Pour commencer, cultivez les graines de Nicotiana benthamiana dans un sol humide dans une chambre à environnement contrôlé réglée à 23 degrés Celsius, en maintenant 16 heures de lumière, suivies de huit heures d’obscurité. Après avoir transféré les plants de deux semaines dans des pots plus grands, cultivez les plantes dans les mêmes conditions pendant quatre à cinq semaines pour les préparer aux expériences d’agro-infiltration. Associez des cellules d’Agrobacterium à des méphasines EHA105 contenant les vecteurs souhaités sur des plaques de gélose LB et incuberez-les à 28 degrés Celsius.
Après deux jours, transférez une seule colonie de la plaque dans deux millilitres de bouillon LB et incubez toute la nuit à 28 degrés Celsius avec une agitation à 250 tours par minute. Ensuite, retirez un millilitre de la culture de nuit et ajoutez quatre millilitres de bouillon LB frais à la reculture pendant une heure dans les mêmes conditions. Granuler les cellules par centrifugation.
Après cela, déterminez le nombre de cellules de la suspension bactérienne à 600 nanomètres et ajustez la densité optique à 0,1 ou 0,2 à l’aide d’un tampon d’infiltration. Incuber la suspension bactérienne à température ambiante pendant trois heures en agitant doucement. Ensuite, infiltrez la surface abaxiale des feuilles complètement développées de différentes plantes à l’aide d’une seringue jetable sans aiguille d’un millilitre.
Marquez la zone infiltrée, qui apparaîtra plus foncée que les tissus non infiltrés environnants, avec un stylo étanche.
