Pour commencer, obtenez la plante Nicotiana benthamiana infiltrée avec les cellules d’Agrobacterium tumefaciens hébergeant les vecteurs souhaités. Pour les études de localisation des protéines, récoltez deux feuilles de deux plantes à des moments différents après l’infiltration. À l’aide d’une lame, coupez la zone d’infiltration en tranches à l’écart de la veine.
Placez l’échantillon de tissu avec le côté abaxial vers le haut sur une goutte d’eau stérile au centre d’une lame de microscope. Couvrez la diapositive avec une vitre de protection en veillant à ce qu’aucune bulle ne soit piégée. Visualisez le signal fluorescent des balises autofluorescentes dans la zone infiltrée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser.
Collectez 20 images pour chaque condition en utilisant au moins deux réplicats biologiques indépendants. Score de localisation plasmodesmale de la protéine testée en fonction de l’apparition diagnostique ponctuée du signal à la périphérie cellulaire. Les protéines TVCV MP-EGFP et PDL5-EGFP ont démontré une localisation ponctuée claire des plasmodesmes.
Alors que PDCB1-EGFP a montré une localisation à la fois dans les plasmodesmes et le réticulum endoplasmique le premier jour, après l’infiltration. Les MP et PDLP5 ont commencé à s’accumuler au niveau des plasmodesmes le premier jour après l’infiltration, atteignant leur intensité maximale le deuxième jour et restant stables pendant cinq jours. PDCB1 a montré une forte localisation du réticulum endoplasmique jusqu’au troisième jour, après quoi la localisation plasmodesmale est devenue visible dans moins de cellules.
