Maintenez les cellules souches pluripotentes ou PSC dans des plaques de culture à six puits et confirmez la densité cellulaire au microscope. Pour la différenciation des cardiomyocytes ou des CM, ensemencer les CSP dans une plaque de culture à 96 puits dans un milieu de préparation des CSP. Au premier stade de la différenciation cardiaque, lorsque les CSP atteignent 80 à 90 % de confluence, passer du milieu au milieu de différenciation CM avec deux à 20 micromolaires CHIR.
Après 24 à 48 heures de traitement CHIR, remplacez le milieu par un milieu de différenciation CM frais. Au deuxième stade ou au troisième jour, remplacer le milieu par le milieu de différenciation CM complété par cinq micromolaires IWR1 en culture jusqu’au cinquième jour. Ensuite, changez le milieu pour le milieu de différenciation CM et conservez-le jusqu’aux jours six à sept, lorsque les PSC se différencient en cellules progénitrices cardiaques, ou CPC.
Au jour 10 ou au jour 12, fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 15 minutes à température ambiante. Au moment de la coloration, traitez les cellules avec une solution de perméabilisation pendant 30 minutes à température ambiante. Incuber l’échantillon avec l’anticorps primaire CTNT pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Traiter ensuite l’échantillon avec des anticorps secondaires dans du PBS contenant 1 % d’albumine sérique bovine pendant une heure à 37 degrés Celsius. Après avoir retiré l’anticorps secondaire des cellules, colorez les noyaux par Hoechst pendant cinq minutes à température ambiante. Rincez ensuite les cellules trois fois avec du PBS avant d’ajouter 100 microlitres de PBS par puits pour éviter le dessèchement.
Pour collecter des images immunofluorescentes en fond clair et CTNT des différents stades de différenciation à l’aide d’un microscope automatisé prenant en charge la culture de cellules vivantes, ouvrez le logiciel et créez un nouveau plan expérimental. Choisissez un objectif 5X et un mélange 2X2 pour l’imagerie. Dans le menu des canaux, ajoutez le canal TL en fond clair pour l’imagerie en fond clair et les canaux AF 488 et H 33 42 pour l’imagerie par immunofluorescence.
Modifiez le trajet de la lumière dans la configuration de l’imagerie. Dans le menu Pile Z, définissez le nombre de tranches et d’intervalles lors de la numérisation. Dans la fenêtre de navigation et de vignettes, configurez les régions de vignette par transporteur et définissez 25 vignettes sur cinq colonnes en cinq rangées pour un puits.
Pour acquérir des images, placez d’abord la plaque de culture cellulaire dans le plateau d’échantillon et chargez le plateau à l’intérieur du microscope. Si l’échantillon est constitué de cellules vivantes, ouvrez le système de chauffage et la pompe à dioxyde de carbone pour maintenir les conditions appropriées pour la culture à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone. Ouvrez le projet expérimental prédéfini.
Ouvrez le menu des tuiles et calibrez manuellement la position de la plaque. Dans la fenêtre de navigation et de tuiles, sélectionnez les puits nécessaires et cliquez sur Créer pour construire des régions de tuiles pour ces puits. Cliquez sur Vérifier les régions de tuiles dans le menu des tuiles et exécutez le focus automatique pour vérifier tous les puits.
Corrigez ensuite manuellement l’orientation de chaque puits. Cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience et attendez l’imagerie automatique. En règle générale, il faut environ 1,2 heure pour scanner une plaque de culture entière de 96 puits.
Dans le cadre de traitement, choisissez l’exportation d’image, sélectionnez le type de fichier au format TIFF non compressé ou au format PNG et appliquez-le.
