Pour commencer, récupérez les semis d’Arabidopsis Columbia-0 de cinq jours, congelés et non traités, dans le récipient d’azote liquide. Broyez les semis à l’aide d’un homogénéisateur en poudre pendant une minute. Ajoutez ensuite 500 microlitres de tampon d’extraction de polysome dans le tube.
Inversez et tourbillonnez le tube pour mélanger l’échantillon. Centrifuger la solution d’extraction à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, filtrez le surnageant à travers une crépine de 100 micromètres pour obtenir une solution d’extraction claire et sans particules.
Chargez le surnageant filtré sur le gradient de saccharose pré-préparé et attendez qu’il atteigne l’équilibre. Ensuite, ultracentrifugez le gradient à l’aide d’un rotor à godets oscillant à 210 000 G pendant 3,5 heures à quatre degrés Celsius avec des taux d’accélération et de décélération maximum. Les ARN non polysomiques et polysomiques sont séparés en fonction de leur densité dans la solution de gradient de saccharose correspondante.
Préparez la solution de chasse pour le pousse-seringue de micro-volume composée de 70 % de saccharose, 10 % de glycérol et 0,02 % de bleu de bromophénol. Mélangez soigneusement la solution pendant 30 à 40 minutes. Après avoir injecté la solution de poursuite dans le gradient, à l’aide du logiciel, contrôlez le fractionneur de gradient de densité.
Calibrez ensuite la machine avec de l’eau déminéralisée. Après l’ultracentrifugation, placez le tube sur le fractionneur à gradient de densité. À l’aide du système de perçage du tube, connectez le tube au pousse-seringue et au détecteur d’ultraviolets.
Basculez le fractionneur de gradient de densité en mode de contrôle logiciel à distance. Réglez le débit d’injection du pousse-seringue à micro-volume à trois millilitres par minute. Lancez le processus d’obtention du graphique de profil des polysomes en mesurant la densité optique à 254 nanomètres à l’aide du fractionneur.
Sur la base des mesures du profil des polysomes, collectez séparément les fractions d’ARN non polysomiques et polysomiques. Mélangez soigneusement les fractions d’ARN collectées avec une solution pré-froide deux fois plus salée. Ajoutez ensuite huit microlitres d’un stock dilué de contrôle de l’ARN poly-A eucaryote à partir du kit.
Centrifugez la solution à haute teneur en sel avec un mélange d’ARN avec un rotor à godet oscillant à 450 000 G pendant cinq heures à quatre degrés Celsius. Versez soigneusement le surnageant et lavez la pastille d’ARN trois fois avec 500 microlitres d’eau pré-froide traitée au DEPC. Après le dernier lavage, ajoutez 500 microlitres de réactif d’extraction d’ARN à l’échantillon d’ARN.
Mélangez et incubez pendant 10 minutes. Ajouter 100 microlitres de chloroforme et bien mélanger. Incuber pendant 10 minutes pour permettre la séparation des phases.
Centrifugez le mélange à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Transférez la couche aqueuse transparente supérieure contenant de l’ARN dans un nouveau tube et mélangez-la doucement avec un volume égal d’isopropanol. Incuber le mélange à moins 20 degrés Celsius pendant deux heures pour précipiter l’ARN.
Après la précipitation, centrifugez à nouveau et jetez le surnageant, en laissant la pastille d’ARN au fond. Lavez la pastille d’ARN avec un millilitre d’éthanol pré-froid à 75 %. Centrifugez à 12 000 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et faites sécher la pastille d’ARN à l’air.
Une fois sec, remettre la pastille en suspension dans 30 microlitres d’eau traitée au DEPC. Mesurez la concentration d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre à spectre complet de 220 à 750 nanomètres, en vous concentrant sur la densité optique de 260. Le profilage des polysomes a montré une séparation nette entre les fractions non polysomiques et polysomiques dans des conditions normales.
Le stress thermique à 40 degrés Celsius a considérablement réduit l’intensité du signal de la fraction polysomale, et cet effet a été inversé après une récupération de deux heures à 22 degrés Celsius, ramenant le signal aux niveaux de contrôle. Les résultats de l’extraction de l’ARN ont indiqué que le stress thermique réduisait le pourcentage d’ARN dans la fraction polysomale, qui était restaurée après récupération à 22 degrés Celsius.
