Pour commencer, placez les tissus de souris extraits dans le tube du broyeur de tissus contenant 50 % de solution saline glacée et 50 % de méthanol. Insérez le pilon dans le tube du broyeur et tournez-le doucement cinq fois pour homogénéiser le tissu. Transférez immédiatement le tissu homogénéisé dans un tube de 15 millilitres.
Ajoutez deux millilitres de méthanol et un millilitre d’hydroxylamine 0,1 molaire à l’échantillon homogénéisé. Laisser reposer le mélange pendant 15 minutes à température ambiante. Pour l’extraction des rétinoïdes, ajoutez 10 millilitres d’hexane à l’homogénat et agitez le tube horizontalement pendant au moins 10 secondes.
Centrifuger le mélange d’hexane homogéné pendant trois minutes à 1000 x g pour séparer les phases. À l’aide d’une pipette, transférez la couche d’hexane dans un tube en verre séparé de 15 millilitres et placez l’échantillon dans une centrifugeuse à vide pour évaporer complètement l’hexane de l’échantillon extrait. Remettez en suspension les rétinoïdes séchés dans le tube de 15 millilitres avec 100 microlitres d’hexane et faites un bon vortex pour vous assurer que tous les rétinoïdes sont dissous.
Pipetez les 100 microlitres d’hexane dans le deuxième tube de verre et vortex le tube pour dissoudre les rétinoïdes. Ensuite, pipetez l’intégralité des 100 microlitres d’hexane dans un seul verre inerte pour l’analyse HPLC. Configurez l’exécution HPLC en utilisant les conditions appropriées.
Identifiez les pics à l’aide des temps de rétention et des spectres UV pour chaque rétinoïde d’intérêt en fonction des normes. À l’aide du système de données chromatographiques, intégrer les pics identifiés et référencer la courbe standard externe pour quantifier l’analyte. Pour les chromatogrammes de tissus biologiques, intégrez manuellement les pics pour tenir compte des variabilités des temps de rétention.
Dans le chromatogramme de l’œil de la souris témoin, le 13-cis-rétinal, le 11-cis-rétinal, le tout-trans-rétinal, le 11-cis-rétinol et le tout-trans-rétinol ont été identifiés. Dans le chromatogramme de l’œil de souris traité à l’hydroxylamine, les temps de rétention ont été augmentés. Des isomères syn et anti-isomères de ces rétinaldéhydes étaient également présents.
Dans le chromatogramme du tissu hépatique de souris, le palmitate de rétinyle et le tout-trans-rétinol ont été identifiés comme les principales formes de vitamine A, et celui dans le sang de souris a montré un pic de trans-rétinol. Les spectres absorbants UV ont confirmé la présence d’isoformes rétinoïdes dans les pics de chromatogramme.
