Les auteurs remercient Nico Zantl, Klaus Pfeffer, et Bernhard Holzmann. Cette étude a été soutenue par la Deutsche Forschungsgemeinschaft, Bonn-Bad Godesberg, en Allemagne (GRK-840; Vo 450/10-1).

1. Préparation de la souris <ol><li> Anesthésier la souris par injection intrapéritonéale du fluide de stupéfiants (voir tableau des réactifs) et la placer en position couchée. </li><li> Les pieds de la souris doivent être fixés avec du ruban adhésif sur la plaque pour assurer une position stable de l&#39;animal pendant l&#39;opération. </li></ol> 2. Fonctionnement <ol><li> Prenez une canule iv, qui est couramment utilisé pour les injections iv chez les humains, et tailler sa tube plastique circulaire de 2mm à son extrémité. Nous utilisons trois différentes tailles de canules de contrôler les taux de mortalité (BD Venflon 18GA (1,2 x45mm, 80 mL / min); 16GA (1,7 x45mm, 180 mL / min) 14GA (2,0 x45mm, 270 mL / min)). </li><li> Après la désinfection complète de la peau abdominale, l&#39;inciser le long de sa ligne médiane environ 15mm. Ouvrez la caverne péritonéale en incisant les muscles abdominaux et le péritoine le long de la ligne blanche. </li><li> Identifier le pôle caecal et tirez soigneusement le caecum, l&#39;iléon terminal et le côlon ascendant hors de l&#39;abdomen par l&#39;utilisation de tampons de coton. </li><li> 15mm distale de la valvule iléo-colique, il faut percer la paroi du côlon ascendant avec une suture 7 / 0. Ainsi, les lésions des vaisseaux intestins doivent être évités. La suture est fixée sur la paroi colique par deux noeuds chirurgicales. </li><li> Maintenant perforation du côlon ascendant avec le prêt canule de 1-2 mm de la suture proximale 7 / 0. Insérez soigneusement la canule dans le colon jusqu&#39;au sillon dans le tube de plastique est au niveau de la séreuse. </li><li> Mettez les extrémités libres de la suture 7 / 0 autour de la canule et le lieu d&#39;un nœud double exactement dans le sillon préparé du tube en plastique. </li><li> Maintenant, prenez l&#39;aiguille de la suture 7 / 0 et de piquer à travers la paroi du côlon antimésentérique. Consécutivement, deux nœuds chirurgicaux doivent être effectués pour de plus fixer le tube de plastique dans la paroi colique. Couper les extrémités de suture. </li><li> Récupérez la pièce en fer de la canule un peu et couper le tube en plastique hors proches (1mm) à la fixation 7 / 0 suture. </li><li> Maintenant, on doit soigneusement le lait selles du cæcum vers le stent du côlon par l&#39;utilisation de tampons de coton jusqu&#39;à ce qu&#39;un petit bout de selles apparaît en haut de l&#39;endoprothèse. </li><li> Mettez l&#39;intestin retour dans la caverne et la réanimation liquidienne péritonéale Performe par l&#39;administration intrapéritonéale de 0,5 ml de solution saline. </li><li> Fermer le péritoine avec une suture continue (4 / 0). </li><li> Fermer la peau avec des sutures singulier (4 / 0). </li></ol> 3. Soins postopératoires <ol><li> Mettre le dos de l&#39;animal dans sa cage, qui devrait contenir suffisamment de nourriture et d&#39;eau. Pour l&#39;analgésie, l&#39;administration intrapéritonéale d&#39;une substance puissante analgésique (nous utilisons la buprénorphine) devraient être régulièrement effectués. </li><li> Dans les deux premiers jours après l&#39;opération, on a à contrôler les animaux toutes les 6 heures. </li></ol> 4. Sham CASP <ol><li> Effectuez les étapes 1.1 à 2.4. </li><li> Ne pas perforer le côlon. Juste exécuter les étapes 2.6 à 2.8. </li><li> Effectuez les étapes 02.10 à 03.02. </li></ol> 5. CASPI <ol><li> Effectuer CASP en utilisant une canule étapes suivantes 14G 01/01 au 03/01 </li><li> 5h après l&#39;ACPS, on doit utiliser l&#39;animal à nouveau. Préparer et anesthésier la souris à nouveau selon les étapes 1.1 à 1.2 </li><li> Ouvrez les sutures de la paroi abdominale. </li><li> Tirez sur le côlon ascendant avec le stent. </li><li> Découpez soigneusement les sutures de fixation du stent et retirer le stent. </li><li> Fermer le défaut dans le côlon avec une seule suture inversion (7 / 0). </li><li> Mettez de l&#39;intestin dans la cavité abdominale et rincer ce dernier à deux reprises avec 10 ml de solution saline. </li><li> Fermer le péritoine avec une suture continue (4 / 0). </li><li> Fermer la peau avec des sutures singulier (4 / 0). </li><li> Suivez les étapes 3.1 à 3.2 </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Dans quelques heures après l&#39;opération, les animaux montrent des signes cliniques d&#39;une septicémie début. Les symptômes typiques de la maladie sont à mobilité réduite, manteau horrent, sueurs, diminution de l&#39;apport alimentaire, la perte de poids et de comportement escapade également réduite. Animaux développer une péritonite aiguë avec infection systémique consécutive normalement meurent dans les 48h. Selon la taille inséré un stent, les taux de mortalité distinctes peuvent être générés. Un des résultats 14G stent dans 100% de mortalité, de mortalité 16G donne 70%, et les taux de mortalité de 50% peut être atteint en utilisant un stent 18G (figure 1a). Les résultats de l&#39;opération Sham dans un taux de survie de 100%. Habituellement, tous les animaux meurent inbetween les premières 48 heures après l&#39;ACPS. Ainsi, tous les animaux qui sont en vie à ce point le temps peut être considéré comme des survivants. Cependant, nous recommandons une période d&#39;observation supplémentaire d&#39;au moins 72 heures pour détecter les rares «décès tardifs&quot; après l&#39;ACPS. Le résultat de CASPI dépend de la période de temps après CASP lorsque le stent est enlevé. Une intervention 3h après les résultats du PCRS dans un taux de survie de 45%. Si le stent est retiré après 5h du PCRS, seulement 10% desanimaux survivent à la procédure. Un déménagement stent après les résultats 9h dans une mortalité de 100% (figure 1b). Sham CASPI conduit à 100% de survie. Pour les réglages Caspi, nous recommandons une période d&#39;observation de 10 jours, car il ya habituellement des animaux, qui meurent plus tard 48 heures après l&#39;ACPS. L&#39;inspection macroscopique de l&#39;abdomen situs 24 heures après l&#39;ACPS montre des signes typiques d&#39;une péritonite: oedème, vasodilatation, la paroi intestinale érythémateux, démarcation nette des plaques de Peyer, paralysie intestinale, liquide libre, et la sécrétion septique (figure 2). L&#39;infection systémique peut être démontré par des analyses bactériologiques. 12 heures après l&#39;ACPS, massives quantités bactérienne peut être détectée dans le lavage péritonéal, du sang, du foie, du poumon, la rate et les reins. L&#39;analyse qualitative des bactéries révèle une infection systémique par les bactéries intestinales typiques comme E. coli, Bacteroides espèces, Enterococcus, etc (figure 3). CASP-induite septicémie se manifeste dans la libération locale et aussi systémique de cytokines pro-et anti-inflammatoires et des chimiokines. 12 heures suivant l&#39;ACPS, des quantités importantes de TNF, IL-1β, IL-6, IL-10, MCP-1 et d&#39;autres peut être mesurée par ELISA dans le sang mais aussi dans les surnageants des suspensions d&#39;organes, le foie, par exemple, des poumons, la rate, des reins (Fig 4). Lors de l&#39;établissement du PCRS dans votre laboratoire, les taux de survie, la bactériologie et la libération de cytokines devraient être prises comme des paramètres de contrôle pour une exécution correcte de l&#39;ACPS. Plus tard, ces paramètres peuvent être pris comme la norme lu système pour tous les paramètres expérimentaux. <img src="/files/ftp_upload/2299/2299fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1a: Survie après CASP. Les taux de survie après une chirurgie CASP dépendra du diamètre du stent inséré. 14G résultats CASP un taux de mortalité de 100%, les résultats CASP 16G de la mortalité de 70%, et CASP 18G conduit à une mortalité de 50%. Sham CASP est associée à une survie de 100%. . n = 20/groupe B: Les taux de survie après une chirurgie CASPI dépendent du moment de l&#39;enlèvement du stent. L&#39;enlèvement du stent à 3h après 14G CASP conduit à un taux de mortalité de 55%. L&#39;enlèvement du stent à 5h après les résultats 14G CASP un taux de mortalité de 90% tandis que l&#39;élimination du stent à 9h, après des résultats CASP 14G à 100% de mortalité. Sham Caspi (5h) se traduit par une survie de 100%. n = 10/groupe (Sham CASPI; CASPI 9h), n = 20/groupe (3h CASPI; 5h CASPI). <img src="/files/ftp_upload/2299/2299fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2: abdominale 24h situs après CASP. La paroi abdominale a été retirée après 24h 16G CASP CASP ou fictive, respectivement. Le situs du simulacre de la souris ressemble exploité physiologiques. En revanche, les résultats du PCRS dans l&#39;oedème, l&#39;hyperémie, les intestins dilatated, et la démarcation des plaques de Peyer démontrant une péritonite aiguë. <img src="/files/ftp_upload/2299/2299fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3: Bactériologie. CASP conduit à une infection grave de plusieurs compartiments et des organes par les bactéries intestinales dans les 12h après l&#39;opération. Nombre de bactéries sont donnés comme des unités formant colonie (UFC) par ml, respectivement. Les cultures bactériennes prélevées sur des souris une opération fictive sont complètement stériles (non représentée). 16G CASP, n = 5/groupe. <img src="/files/ftp_upload/2299/2299fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4: Les cytokines. CASP déclenche une réponse immunitaire systémique que plusieurs cytokines et chimiokines sont détectables dans le plasma et aussi dans les surnageants d&#39;organes. La figure montre de manière exemplaire les cytokines pro-inflammatoires du facteur de nécrose tumorale (TNF) et l&#39;interleukine-6 ​​(IL-6) ainsi que la prédominance des anti-inflammatoires IL-10. 12h après l&#39;ACPS, des niveaux remarquables peuvent être détectés dans le plasma, le foie, les poumons et la rate. Cependant, l&#39;IL-10 ne peuvent pas être détectées dans les poumons et la rate après l&#39;ACPS. Opération fictive ne conduit pas à une sécrétion de cytokines (non représentée). 16G CASP, n = 5/groupe.

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	<li>Maier, S., Traeger, T., Entleutner, M., Westerholt, A., Kleist, B., Huser, N., Holzmann, B., Stier, A., Pfeffer, K., Heidecke, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cecal+ligation+and+puncture+versus+colon+ascendens+stent+peritonitis:+two+distinct+animal+models+for+polymicrobial+sepsis.">Cecal ligation and puncture versus colon ascendens stent peritonitis: two distinct animal models for polymicrobial sepsis.</a> Shock. 21, 505-511 (2004).</li><li>Bougaki, M., Searles, R. J., Kida, K., Yu, J. D. e., Buys, E. 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M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+role+for+CD4++T+lymphocytes+in+murine+diffuse+peritonitis+due+to+inhibition+of+local+bacterial+elimination.">Detrimental role for CD4+ T lymphocytes in murine diffuse peritonitis due to inhibition of local bacterial elimination.</a> Gut. 57, 188-195 (2008).</li><li>Daubeuf, B., Mathison, J., Spiller, S., Hugues, S., Herren, S., Ferlin, W., Kosco-Vilbois, M., Wagner, H., Kirschning, C. 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D., Lehmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colon+ascendens+stent+peritonitis--a+model+of+sepsis+adopted+to+the+rat:+physiological,+microcirculatory+and+laboratory+changes.">Colon ascendens stent peritonitis--a model of sepsis adopted to the rat: physiological, microcirculatory and laboratory changes.</a> Shock. 28, 59-64 (2007).</li><li>Traeger, T., Kessler, W., Assfalg, V., Cziupka, K., Koerner, P., Dassow, C., Breitbach, K., Mikulcak, M., Steinmetz, I., Pfeffer, K., Heidecke, C. D., Maier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+role+of+CC+chemokine+receptor+4+in+murine+polymicrobial+sepsis.">Detrimental role of CC chemokine receptor 4 in murine polymicrobial sepsis.</a> Infect Immun. 76, 5285-5293 (2008).</li><li>Traeger, T., Kessler, W., Hilpert, A., Mikulcak, M., Entleutner, M., Koerner, P., Westerholt, A., Cziupka, K., Rooijen, N. v. a. n., Heidecke, C. D., Maier, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+depletion+of+alveolar+macrophages+in+polymicrobial+sepsis+increases+lung+injury,+bacterial+load+and+mortality+but+does+not+affect+cytokine+release.">Selective depletion of alveolar macrophages in polymicrobial sepsis increases lung injury, bacterial load and mortality but does not affect cytokine release.</a> Respiration. 77, 203-213 (2009).</li><li>Traeger, T., Mikulcak, M., Eipel, C., Abshagen, K., Diedrich, S., Heidecke, C. D., Maier, S., Vollmar, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kupffer+cell+depletion+reduces+hepatic+inflammation+and+apoptosis+but+decreases+survival+in+abdominal+sepsis.">Kupffer cell depletion reduces hepatic inflammation and apoptosis but decreases survival in abdominal sepsis.</a> Eur J Gastroenterol Hepatol. , (2010).</li><li>Weighardt, H., Kaiser-Moore, S., Schlautkotter, S., Rossmann-Bloeck, T., Schleicher, U., Bogdan, C., Holzmann, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Type+I+IFN+modulates+host+defense+and+late+hyperinflammation+in+septic+peritonitis.">Type I IFN modulates host defense and late hyperinflammation in septic peritonitis.</a> J Immunol. 177, 5623-5630 (2006).</li><li>Zantl, N., Uebe, A., Neumann, B., Wagner, H., Siewert, J. R., Holzmann, B., Heidecke, C. D., Pfeffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Essential+role+of+gamma+interferon+in+survival+of+colon+ascendens+stent+peritonitis,+a+novel+murine+model+of+abdominal+sepsis.">Essential role of gamma interferon in survival of colon ascendens stent peritonitis, a novel murine model of abdominal sepsis.</a> Infect Immun. 66, 2300-2309 (1998).</li></ol>

CASP est un modèle de septicémie polymicrobienne abdominale qui répond à la plupart des critères postulé pour un modèle de septicémie précieux: CASP peut être effectué chez les petits animaux, est hautement reproductible, facile à suivre par les paramètres standard, offre de bonnes possibilités de lecture, et imite étroitement les paramètres cliniques de septicémie abdominale. Dans une étude comparative nous avons pu montrer que les CASP conduit à une péritonite diffuse avec une infection précoce et constante augmentation et l&#39;inflammation systémique (syndrome de réponse inflammatoire systémique), tandis que la ligature et ponction du caecum (CLP) révèle un modèle de formation d&#39;abcès intra-abdominal avec soutenue et mineures des signes d&#39;inflammation systémique (1). La technique de CASPI présente une possibilité de simuler l&#39;évolution clinique de péritonite avec l&#39;accent d&#39;assainissement consécutives chirurgicale, qui est le principe le plus important thérapeutique chez l&#39;homme. L&#39;ACPS peut être appliquée pour toutes les questions autour d&#39;une septicémie ou une péritonite et est donc utile pour toutes les disciplines traitant de la recherche septicémie, par exemple en immunologie, pharmacologie, chirurgie, médecine de soins intensifs, etc Une sélection de publications portant sur des sujets différents de la septicémie en utilisant le modèle du PCRS est donnée ci-dessous (1-14). Lorsque commençant par l&#39;ACPS, il faut être conscient que certaines pratiques est nécessaire pour effectuer l&#39;opération exactement et rapidement. Expérience chirurgicale peut être utile mais n&#39;est pas requise. Nous vous recommandons de détection de letality comme un paramètre pour une exécution correcte de l&#39;ACPS. On devrait commencer par l&#39;ACPS 14G comme un stent grande est plus facile à manipuler qu&#39;un plus mince. Un chirurgien CASP formé est capable d&#39;opérer une souris dans les 10 minutes. Avant de commencer toute expérience, vous devriez vous assurer que vous êtes à proximité de cette période. Lorsque vous acquis une certaine expérience avec la procédure chirurgicale, vous devez effectuer une cinétique de survie pour vérifier vos compétences. 14G CASP devrait entraîner une létalité de 100%. Débutants dans notre laboratoire ont à prouver qu&#39;ils sont capables de générer une létalité de 100% avec CASP 14G avant qu&#39;ils ne commencent avec l&#39;expérience. De plus, la bactériologie et les mesures de cytokines devraient être effectués pour vérifier la septicémie. Si vous avez des problèmes au début avec les étapes de microchirurgie de l&#39;ACPS, l&#39;utilisation de loupes ou d&#39;un microscope chirurgical peut être utile. Mais en principe, l&#39;ACPS peut être bien fait sans ces utilitaires. Pour la reproduction de nos taux de survie, il est absolument nécessaire que les mêmes matériaux, notamment les stents (BD Venflon, voir ci-dessous), sont utilisés. Sinon, des variations importantes des résultats sont possibles. De plus, nous suggérons qu&#39;il peut y avoir des variations des résultats selon, par exemple, l&#39;individualité du chirurgien. Toutefois, l&#39;influence de facteurs tels que devrait être faible. En résumé, l&#39;ACPS est une pratique, le modèle septicémie simple, reproductible et précieux qui imite de près la situation clinique de sepsis abdominal. Il est donc adapté à tous les domaines de la recherche septicémie.

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		<div>
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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Narcotic fluid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Mix 0.5 mL Rompun with 4.0 mL Ketanest, and add 5.5 mL of saline solution (0.9%). 
For complete anesthesia, inject intraperitoneally 10 &mu;L/g body weight</td>
</tr>
<tr>
<td>Rompun (20 mg/ml Xylazine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Bayer AG 51368 Leverkusen, Germany</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Ketanest (25mg/ml Esketamine)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Pfizer Pharma GmbH, 10785 Berlin, Germany</td>
<td>647028001E</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Venflon 18GA (1,2x45mm, 80ml/min)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ USA 07417</td>
<td>391457</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Venflon 16GA (1,7x45mm, 180ml/min)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ USA 07417</td>
<td>391455</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BD Venflon 14GA (2,0x45mm, 270ml/min)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ USA 07417</td>
<td>391456</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Catgut Polyester 4/0 white, non absorbable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Catgut GmbH, 08258 Markneukirchen, Germany</td>
<td>17218113</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mariderm black 7/0, non absorbable</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Catgut GmbH, 08258 Markneukirchen, Germany</td>
<td>18104900</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

colon ascendens stent peritonitis (casp) - a standardized model for polymicrobial abdominal sepsis

Sepsis demeure un problème persistant sur les unités de soins intensifs du monde entier. Comprendre les mécanismes complexes de la septicémie est la condition préalable pour l&#39;établissement de nouvelles approches thérapeutiques dans ce domaine. Par conséquent, les modèles animaux sont nécessaires qui sont capables d&#39;imiter au mieux la maladie humaine et aussi suffisamment face aux questions scientifiques. Le Colon ascendens stent péritonite (CASP) est un modèle très standardisé pour le sepsis abdominaux polymicrobiennes chez les rongeurs. Dans ce modèle, un stent petite est chirurgicalement inséré dans le côlon ascendant des souris ou des rats conduit à une fuite continue des bactéries intestinales dans la cavité péritonéale. La procédure aboutit à une péritonite, bactériémie systémique, infection d&#39;organes par les bactéries intestinales, et la libération systémique, mais aussi locaux de plusieurs cytokines pro-et anti-inflammatoires. La létalité des ACPS peuvent être contrôlés par le diamètre du stent inséré. Une variante de ce modèle, le CASP dits avec une intervention (Caspi), soulève la possibilité de retirer le foyer septique par une deuxième opération selon les procédures habituelles en pratique clinique. CASP est un modèle facilement apprenables et hautement reproductible qui imite étroitement l&#39;évolution clinique de sepsis abdominal. Elle conduit ainsi à l&#39;étude sur des questions scientifiques dans plusieurs domaines de l&#39;immunologie, par exemple, l&#39;infectiologie, ou la chirurgie.

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Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Le Colon ascendens stent péritonite (CASP) est un modèle très standardisé pour le sepsis abdominaux polymicrobiennes chez les rongeurs. Cet article décrit la procédure chirurgicale de l&#39;ACPS. Le modèle du PCRS et ses variantes permettent l&#39;investigation systématique des différents problèmes concernant le sujet de la septicémie.

Colon ascendens stent péritonite (CASP) - un modèle standardisé pour sepsis abdominal polymicrobienne

Sepsis remains a persistent problem on intensive care units all over the world. Understanding the complex mechanisms of sepsis is the precondition for ...

colon-ascendens-stent-peritonitis-casp-standardized-model-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Colon Ascendens Stent Peritonitis (CASP) - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

19.4K vues.  University of Greifswald. Le Colon ascendens stent péritonite (CASP) est un modèle très standardisé pour le sepsis abdominaux polymicrobiennes chez les rongeurs. Cet article décrit la procédure chirurgicale de l'ACPS. Le modèle du PCRS et ses variantes permettent l'investigation systématique des différents problèmes concernant le sujet de la septicémie.

Vidéo: Colon Ascendens Stent Peritonitis CASP - a Standardized Model for Polymicrobial Abdominal Sepsis

Cecal Ligation and Puncture-induced Sepsis as a Model To Study Autophagy in Mice

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is provided to induce sepsis of varying severity in mice using the CLP technique. Autophagy is a fundamental tissue response to stress and pathogen invasion. Two current protocols to assess autophagy in vivo in the context of experimental sepsis are also presented here. (I) Transgenic mice expressing green fluorescence protein (GFP)-LC3 fusion protein are subjected to CLP. Localized enhancement of GFP signal (puncta), as assayed either by immunohistochemical or confocal assays, can be used to detect enhanced autophagosome formation and, thus, altered activation of the autophagy pathway. (II) Enhanced autophagic vacuole (autophagosome) formation per unit tissue area (as a marker of autophagy stimulation) can be quantified using electron microscopy. The study of autophagic responses to sepsis is a critical component of understanding the mechanisms by which tissues respond to infection. Research findings in this area may ultimately contribute towards understanding the pathogenesis of sepsis, which represents a major problem in critical care medicine.

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method. Current protocols to assess autophagy in vivo in the context of CLP-induced sepsis are presented here: A protocol for measuring autophagy using (GFP)-LC3 mice, and a protocol for measuring autophagosome formation by electron microscopy.

Cecal ligature et ponction induite Sepsis comme un modèle pour étudier autophagie chez les souris

Experimental sepsis can be induced in mice using the cecal ligation and puncture (CLP) method, which causes polymicrobial sepsis. Here, a protocol is ...

Recherche

Immunologie et infection

A Controlled Mouse Model for Neonatal Polymicrobial Sepsis

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse polymicrobial sepsis can be induced by injecting cecal slurry intraperitoneally into day of life 7 mice and monitoring them for the following week. Presented here are the detailed steps necessary for the implementation of this neonatal sepsis model. This includes making a homogeneous cecal slurry stock, diluting it to a weight- and litter-adjusted dose, an outline of the monitoring schedule, and a definition of observed health categories used to define humane endpoints. The generation of a homogeneous cecal slurry stock from pooled donors allows for the administration into many litters over time, reducing the variation between donors, and preventing the use of potentially toxic glycerol. The monitoring strategy used allows for the anticipation of survival outcome and the identification of mice that would later progress to death, allowing for an earlier identification of the humane endpoint. Two main behavioral features are used to define the health scores, namely, the ability of the neonatal mice to right themselves when placed on their back and their level of mobility. These criteria could potentially be applied to address humane endpoints in other studies of neonatal disease in mice, as long as a pilot study is performed to confirm accuracy. In conclusion, this approach provides a standardized method to model newborn sepsis in mice, while providing resources to assess animal welfare used to define early humane endpoints for challenged animals.

This protocol provides the necessary steps to establish and evaluate neonatal sepsis in 7-day-old mice.

Un modèle de souris contrôlée pour infection polymicrobienne néonatale

Neonatal sepsis remains a global burden. A preclinical model to screen effective prophylactic or therapeutic interventions is needed. Neonatal mouse ...

Design of Cecal Ligation and Puncture and Intranasal Infection Dual Model of Sepsis-Induced Immunosuppression

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple organs. With the development of therapies, most patients survive the hyperinflammatory phase but progress to an immunosuppressive phase, which increases the emergence of secondary infections. Therefore, improved understanding of the pathogenesis underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive phase during sepsis is of tremendous importance. Reported here is a model to test infectious outcomes by creating double-hit infections in mice. A standard surgical procedure is used to induce polymicrobial peritonitis by cecal ligation and puncture (CLP) and followed by intranasal infection of Staphylococcus aureus to simulate pneumonia occurring in immune suppression that is frequently seen in septic patients. This dual model can reflect the immunosuppressive state occurring in patients with protracted sepsis and susceptibility to secondary infection from nosocomial pneumonia. Hence, this model provides a simple experimental approach to investigate the pathophysiology of sepsis-induced secondary bacterial pneumonia, which may be used for discovering novel treatments for sepsis and its complications.

This protocol describes techniques to measure infectious outcomes underlying secondary hospital-acquired infections in the immunosuppressive condition, first by establishing cecal ligation/puncture mice then challenging them with intranasal infection to create a clinically relevant model of immunosuppression sepsis.

Conception de la ligation et de la perforation et de l'infection intranasale Double modèle de l'immunosuppression induite par la septicémie

Sepsis, a severe and complicated life-threatening infection, is characterized by an imbalance between pro- and anti-inflammatory responses in multiple ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 times of its original size. Clinical and experimental studies have shown that small aneurysms may rupture, while a subpopulation of large aneurysms may remain stable. Thus, in addition to the measurement of intraluminal diameter of the aorta, knowledge of structural traits of the vessel wall may provide important information to assess the stability of the AAA. Aortic stiffening has recently emerged as a reliable tool to determine early changes in the vascular wall. Pulse propagation velocity (PPV) along with the distensibility and radial strain are highly useful ultrasound-based methods relevant for assessing aortic stiffness. The primary purpose of this protocol is to provide a comprehensive technique for the use of ultrasound imaging system to acquire images and analyze the structural and functional properties of the aorta as determined by MILD, PPV, distensibility and radial strain.

This manuscript describes a detailed protocol for using high frequency ultrasound imaging to measure luminal diameter, pulse propagation velocity, distensibility and radial strain on a mouse model of abdominal aortic aneurysm.

Mesure de la vitesse de propagation des impulsions, de la disxsibilité et de la souche dans un modèle abdominal de souris d’anévrisme aortique

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...

A Neonatal Imaging Model of Gram-Negative Bacterial Sepsis

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a protocol for studying the pathogenesis of E. coli O1:K1:H7, a serotype responsible for high mortality rates in neonates. Our method utilizes intravital imaging of neonatal pups at different time points during the progression of infection. This imaging, paralleled by measurement of bacteria in the blood, inflammatory profiling, and tissue histopathology, signifies a rigorous approach to understanding infection dynamics during sepsis. In the current report, we model two infectious inoculums for comparison of bacterial burdens and severity of disease. We find that subscapular infection leads to disseminated infection by 10 h post-infection. By 24 h, infection of luminescent E. coli was abundant in the blood, lungs, and other peripheral tissues. Expression of inflammatory cytokines in the lungs is significant at 24 h, and this is followed by cellular infiltration and evidence of tissue damage that increases with infectious dose. Intravital imaging does have some limitations. This includes a luminescent signal threshold and some complications that can arise with neonates during anesthesia. Despite some limitations, we find that our infection model offers an insight for understanding longitudinal infection dynamics during neonatal murine sepsis, that has not been thoroughly examined to date. We expect this model can also be adapted to study other critical bacterial infections during early life.

Infection of neonatal mice with bioluminescent E. coli O1:K1:H7 results in a septic infection with significant pulmonary inflammation and lung pathology. Here, we describe procedures to model and further study neonatal sepsis using longitudinal intravital imaging in parallel with enumeration of systemic bacterial burdens, inflammatory profiling, and lung histopathology.

Un modèle néonatal d’imagerie de la septicémie bactérienne gramnégative

Neonates are at an increased risk of bacterial sepsis due to the unique immune profile they display in the first months of life. We have established a ...

Isolation of Adipogenic and Fibro-Inflammatory Stromal Cell Subpopulations from Murine Intra-Abdominal Adipose Depots

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute functionally to the expansion and remodeling of WAT in adulthood. A tremendous barrier to studying the implications of this cellular heterogeneity is the inability to readily isolate functionally distinct cell subpopulations from WAT SVF for in vitro and in vivo analyses. Single-cell sequencing technology has recently identified functionally distinct fibro-inflammatory and adipogenic PDGFR&#946;+ perivascular cell subpopulations in intra-abdominal WAT depots of adult mice. Fibro-inflammatory progenitors (termed, &#8220;FIPs&#8221;) are non-adipogenic collagen producing cells that can exert a pro-inflammatory phenotype. PDGFR&#946;+ adipocyte precursor cells (APCs) are highly adipogenic both in vitro and in vivo upon cell transplantation. Here, we describe multiple methods for the isolation of these stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal WAT depots. FIPs and APCs can be isolated by fluorescence-activated cell sorting (FACS) or by taking advantage of biotinylated antibody-based immunomagnetic bead technology. Isolated cells can be used for molecular and functional analysis. Studying the functional properties of stromal cell subpopulation in isolation will expand our current knowledge of adipose tissue remodeling under physiological or pathological conditions on the cellular level.

This protocol describes the technical approach to isolate adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal white adipose tissue (WAT) depots by fluorescence-activated cell sorting or immunomagnetic bead separation.

Isolement de sous-populations de cellules stromales adipogènes et fibro-inflammatoires à partir de dépôts adipeux intra-abdominaux murins

The stromal-vascular fraction (SVF) of white adipose tissue (WAT) is remarkably heterogeneous and consists of numerous cell types that contribute ...

A Contemporary Warming/Restraining Device for Efficient Tail Vein Injections in a Murine Fungal Sepsis Model

In rodent models, tail vein injections are important methods for intravenous administration of experimental agents. Tail vein injections typically involve warming of the animal to promote vasodilation, which aids in both the identification of the blood vessels and positioning of the needle into the vessel lumen while securely restraining the animal. Although tail vein injections are common procedures in many protocols and are not considered highly technical if performed correctly, accurate and consistent injections are crucial to obtain reproducible results and minimize variability. Conventional methods for inducing vasodilation prior to tail vein injections generally depend on the use of a heat source such as a heat lamp, electrical/rechargeable heat pads, or pre-heated water at 37 &#176;C. Despite being readily accessible in a standard laboratory setting, these tools evidently suffer from poor/limited thermo-regulatory capacity. Similarly, although various forms of restraining devices are commercially available, they must be used carefully to avoid trauma to the animals. These limitations of the current methods create unnecessary variables in experiments or result in varying outcomes between experiments and/or laboratories.
In this article, we demonstrate an improved protocol using an innovative device that combines an independent, thermally regulated, warming device with an adjustable restraining unit into one system for efficient streamlined tail vein injection. The example we use is an intravenous model of fungal bloodstream infection that results in sepsis. The warming apparatus consists of a heat-reflective acrylic box installed with an adjustable automatic thermostat to maintain the internal temperature at a pre-set threshold. Likewise, the width and height of the cone restraining apparatus can be adjusted to safely accommodate various rodent sizes. With the advanced and versatile features of the device, the technique shown here could become a useful tool across a range of research areas involving rodent models that employ tail vein injections.

Here, we present an effective and efficient method for rodent tail vein injections using a uniquely designed warming/restraining device. By streamlining the initiation of vasodilation and restraining processes, this protocol allows accurate and timely intravenous injections of large groups of animals with minimal distress.

Un dispositif contemporain de réchauffement / retenue pour des injections efficaces de la veine de la queue dans un modèle de septicémie fongique murine

In rodent models, tail vein injections are important methods for intravenous administration of experimental agents. Tail vein injections typically involve ...

Functional Assessment of Intestinal Permeability and Neutrophil Transepithelial Migration in Mice using a Standardized Intestinal Loop Model

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water while preventing passage of luminal bacteria and exogenous substances. A breach of this layer results in increased permeability to luminal contents and recruitment of immune cells, both of which are hallmarks of pathologic states in the gut including inflammatory bowel disease (IBD). 
Mechanisms regulating epithelial barrier function and transepithelial migration (TEpM) of polymorphonuclear neutrophils (PMN) are incompletely understood due to the lack of experimental in vivo methods allowing quantitative analyses. Here, we describe a robust murine experimental model that employs an exteriorized intestinal segment of either ileum or proximal colon. The exteriorized intestinal loop (iLoop) is fully vascularized and offers physiological advantages over ex vivo chamber-based approaches commonly used to study permeability and PMN migration across epithelial cell monolayers.
We demonstrate two applications of this model in detail: (1) quantitative measurement of intestinal permeability through detection of fluorescence-labeled dextrans in serum after intraluminal injection, (2) quantitative assessment of migrated PMN across the intestinal epithelium into the gut lumen after intraluminal introduction of chemoattractants. We demonstrate feasibility of this model and provide results utilizing the iLoop in mice lacking the epithelial tight junction-associated protein JAM-A compared to controls. JAM-A has been shown to regulate epithelial barrier function as well as PMN TEpM during inflammatory responses. Our results using the iLoop confirm previous studies and highlight the importance of JAM-A in regulation of intestinal permeability and PMN TEpM in vivo during homeostasis and disease. 
The iLoop model provides a highly standardized method for reproducible in vivo studies of intestinal homeostasis and inflammation and will significantly enhance understanding of intestinal barrier function and mucosal inflammation in diseases such as IBD.

Dysregulated intestinal epithelial barrier function and immune responses are hallmarks of inflammatory bowel disease that remain poorly investigated due to a lack of physiological models. Here, we describe a mouse intestinal loop model that employs a well-vascularized and exteriorized bowel segment to study mucosal permeability and leukocyte recruitment in vivo.

Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

The intestinal mucosa is lined by a single layer of epithelial cells that forms a dynamic barrier allowing paracellular transport of nutrients and water ...

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection or damage. Currently, the widely used mice models of sepsis include lipopolysaccharide (LPS)-induced endotoxemia, cecal ligation and puncture (CLP), and monobacterial infection model systems. This protocol describes a method to study the host responses during Salmonella Typhimurium infection-induced septic peritonitis in mice. S. Typhimurium, a Gram-negative intracellular pathogen, causes typhoid-like disease in mice.
This protocol elaborates the culture preparation, induction of septic peritonitis in mice through intraperitoneal injection, and methods to study systemic host responses. Furthermore, the assessment of bacterial burden in different organs and the flow cytometric analysis of increased neutrophil numbers in the peritoneal lavage is presented. Salmonella Typhimurium-induced sepsis in mice leads to an increase in proinflammatory cytokines and rapid infiltration of neutrophils in the peritoneal cavity, leading to lower survival.
Every step in this protocol has been optimized, resulting in high reproducibility of the pathogenesis of septic peritonitis. This model is useful for studying immunological responses during bacterial sepsis, the roles of different genes in disease progression, and the effects of drugs to attenuate sepsis.

Characterizing Salmonella Typhimurium-induced Septic Peritonitis in Mice

This protocol describes the induction of Gram-negative monobacterial sepsis in a mouse model system. The model is useful in investigating the inflammatory and lethal host responses during sepsis.

Caractérisation de la péritonite septique induite par Salmonella Typhimurium chez la souris

Sepsis is a dysregulated host immune response to microbial invasion or tissue damage, leading to organ injury at a site distant from that of the infection ...

Evaluation of a Reliable Biomarker in a Cecal Ligation and Puncture-Induced Mouse Model of Sepsis

Sepsis is a severe life-threatening and rapidly developing disease that causes millions of deaths annually worldwide. Researchers have made tremendous efforts to elucidate the pathophysiology of sepsis using various animal models; the mouse model of sepsis induced by cecal ligation and puncture (CLP) is widely used in laboratories. The three technical aspects that affect the severity and replicability of the CLP model are the percentage of cecum ligated, the size of the needle used for cecal puncture, and the volume of feces squeezed into the abdominal cavity. The rapid and specific diagnosis of sepsis is a crucial factor that affects the outcome. The gold standard for sepsis diagnosis is microbial culture; however, this process is time-consuming and sometimes inaccurate. The detection of sepsis-specific biomarkers is fast, but the existing biomarkers are unsatisfactory due to a short half-life, non-specificity, and insufficient sensitivity. Therefore, there is an urgent need for a reliable biomarker of sepsis in the early stages. Previous publications suggest that excessive neutrophil extracellular traps (NETs) occur in sepsis. Citrullinated histone H3 (CitH3), as a NET component, is elevated both in septic animals and patients, and the presence of CitH3 is a reliable diagnostic biomarker of sepsis. The present study aimed to describe a standardized mouse model of CLP-induced sepsis and establish a reliable blood biomarker of sepsis. Our work may contribute to the early and accurate diagnosis of sepsis in the future.

This protocol presents the operative details of cecal ligation and puncture (CLP) in a mouse model of sepsis. CLP is one of the most widely used techniques to create an animal model of sepsis. Therefore, a standardized CLP protocol is required for the attainment of reliable research results.

Évaluation d’un biomarqueur fiable dans un modèle murin de septicémie induit par ligature et ponction

Sepsis is a severe life-threatening and rapidly developing disease that causes millions of deaths annually worldwide. Researchers have made tremendous ...

Colon ascendens stent péritonite (CASP) - un modèle standardisé pour sepsis abdominal polymicrobienne

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