Ce travail est financé par le NIH subventions P20 RR021905-01, CF SPR octroi STANTO07R0, et la NASA accorde NNH09ZNE002C.

<img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Schéma de SESI-MS analyse des composés volatils bactérienne. L&#39;espace libre de la culture bactérienne est déplacé par CO 2 (1) dans la chambre de réaction SESI (2). Comme les volatiles traversent la chambre de réaction SESI ils passent à travers le nuage électronébulisation et devenir ionisé (3). Une fois ionisé, les volatiles sont tiré dans le spectromètre de masse pour l&#39;analyse (4). L&#39;excès de gaz porteur et n&#39;ayant pas réagi volatiles bactériennes sont transmises à travers un 0,22 um (5) du filtre, comme une mesure supplémentaire de protection, et ventilé à une hotte chimique. Encart: L&#39;aiguille d&#39;électronébulisation SESI est un capillaire de silice (40 um ID) avec une pointe d&#39;aiguille aiguisée. Comme une démonstration de l&#39;utilisation du SESI-MS pour la caractérisation des composés volatils bactériennes, E. coli K12 et P. PAO1 aeruginosa sont cultivées en aérobiose pendant 24 h dans 50 ml LB-Lennox à 37 ° C et les spectres SESI-MS des composés volatils headspace sont collectées en 2 minutes. Le dioxyde de carbone (99,99%) à un débit de 2 L / min est utilisé comme gaz transporteur pour livraison volatiles pour la chambre de réaction. La chambre de réaction SESI a été construite et équipée d&#39;une API-3000 (SCIEX), en remplacement de la source originale électronébulisation d&#39;ions. Les spectres sont collectés dans le mode d&#39;ions positifs en utilisant 0,1% d&#39;acide formique, méthanol 5,0%, et 94,9% d&#39;eau (v / v) comme la solution d&#39;électronébulisation, livré à 5 Nl / s grâce à une silice non-conducteur capillaire avec une aiguille aiguisée (40 um ID). La tension appliquée est de 2,5 kV. Analyste 1.4.2 du logiciel (Applied Biosystems) est utilisé pour la collecte de données avec les paramètres suivants: 20 - 500 Da, MCA mode, 40 scans, 3 s / scan, et 2 min de temps d&#39;analyse total. 1. Système de culture <ol><li> Choisissez le navire approprié pour la croissance de votre culture, compte tenu des exigences de croissance de l&#39;espèce dans votre expérience (par exemple, l&#39;aération, de lumière, température, etc), ainsi que la prestation efficace des substances volatiles au spectromètre de masse. Les flacons de culture nous choisissons d&#39;utiliser en standard de 100 ml en pyrex bouteilles des médias munis d&#39;un bouchon fileté qui ont au moins deux ports Luer. Une ligne d&#39;entrée est insérée dans un port Luer pour la livraison de gaz porteur jusqu&#39;à la bouteille d&#39;échantillonnage et d&#39;une ligne de sortie est inséré par un autre port pour la livraison de COV dans l&#39;instrument (Figure 1). Toute ports supplémentaires sont branchés. </li><li> Avant de cultiver les échantillons, pressuriser les vaisseaux et les plonger dans de l&#39;eau pour vérifier les fuites. Les fuites de gaz sont la principale cause de résultats atypiques en forme de faiblesse ou l&#39;absence de signaux d&#39;ions volatil. </li></ol> 2. Expérimentation biologique: set-up et des considérations de sécurité <ol><li> Faites pousser vos cultures dans les conditions appropriées à votre hypothèse. Il est recommandé qu&#39;au moins deux biologiques répliques, chacune avec deux techniques répliques, sont utilisés pour chaque variable. </li><li> Préparer un blanc pour chaque condition de culture (milieu, antibiotiques, etc) et incuber le vide sous les mêmes conditions que vos échantillons. </li><li> Employer les précautions de sécurité qui sont appropriées pour les agents biologiques que vous utilisez, en tenant compte du niveau de biosécurité (s) de l&#39;espèce. </li><li> Pour éviter la contamination de votre instrument et les lignes de transfert de gaz avec des agents biologiques viables, installer des filtres de la taille des pores dans la ligne appropriée de gaz porteur. Les filtres ne pas interférer avec le transfert de substances volatiles à la chambre de réaction SESI, mais peut légèrement l&#39;impact de l&#39;efficacité du transfert de aérosol. 6 </li><li> Utiliser un confinement secondaire ou une enceinte de biosécurité lors de la fixation du bouchon de transfert du gaz à votre flacon de culture pour assurer le confinement adéquat dans le cas de déversement d&#39;agents biologiques. </li><li> Initier et mettre fin à des flux de gaz porteur jusqu&#39;à votre bouteille d&#39;échantillon d&#39;une manière qui ne sera pas augmenter la pression dans la bouteille. </li></ol> 3. L&#39;optimisation des instruments REMARQUE: SESI-MS est spécifiquement conçu pour volatils de l&#39;échantillon, afin de limiter l&#39;utilisation des articles de soins personnels parfumés (par exemple, eau de Cologne, rince-bouche, les lotions, assouplissant), gomme, cigarettes, etc avant d&#39;utiliser l&#39;instrument. Étroitement bouchon tous les produits chimiques volatiles dans le laboratoire, et l&#39;air de contrôle rédige autant que possible pendant les tests. Les paramètres suivants instrumentale, qui affectent tous intensité du signal et de la stabilité, aura besoin d&#39;être optimisé pour votre instrument et d&#39;expérimenter. <ol><li> Solution électronébulisation et de débit: Choisir la solution d&#39;électronébulisation appropriée pour la classe de molécules que vous souhaitez cibler, en tenant compte de la polarité instrument de fonctionnement (mode positif ou négatif-ion) et le caractère moléculaire des composés cibles. Dans cette expérience, la solution d&#39;électronébulisation est de 0,1% d&#39;acide formique, méthanol 5,0%, 94,9% d&#39;eau (v / v), ce qui améliore l&#39;intensité du signal des molécules moins polaires while assurer la stabilité du signal est bonne. La solution est livrée à un débit de 5 nL / s. </li><li> Débit gaz vecteur: Le débit de gaz porteur peut affecter la stabilité électrospray et l&#39;intensité du signal. CO 2 (≥ 99,99%) à un débit de 2 L / min est utilisée ici. </li><li> La forme et la position de l&#39;aiguille: La forme et la position de pointe de l&#39;aiguille affectent fortement l&#39;intensité du signal et la stabilité. Lorsque vous installez une nouvelle aiguille, la position de l&#39;aiguille doit être optimisée afin de créer un équilibre entre le fond bas, haut intensité du signal d&#39;analyte et la stabilité du signal. Afin de reproduire les spectres SESI après un changement d&#39;aiguille, il est nécessaire de recueillir périodiquement des spectres que vous ajuster la position de l&#39;aiguille jusqu&#39;à ce que vous êtes en mesure d&#39;égaler le spectre observé à vos dossiers. La distance de la pointe d&#39;aiguille à spectrométrie de masse electrospray orifice sera de 1 - 5 mm. </li><li> Tension appliquée: La tension qui est appliquée au système affecte l&#39;intensité du signal d&#39;ions et de la stabilité du cône electrospray Taylor. En outre, la tension optimale dépend de votre solution d&#39;électronébulisation et la forme pointe de l&#39;aiguille. Au début de votre série d&#39;expériences, de déterminer la tension qui donne le spectre du signal et une stabilité optimales pour votre système, et ensuite utiliser cette tension pour toutes les expériences ultérieures. Pour notre système, les tensions appliquées de 2,0 - 5,0 kV de fournir une intensité de signal optimale et la stabilité électrospray. Pour cette expérimentation 2,5 kV est utilisé. </li></ol> 4. Activation et réglage du SESI-MS pour l&#39;analyse <ol><li> Commencez par vous assurer que la tension d&#39;alimentation est éteint et que le système est déchargé de l&#39;électricité. Pour ce faire, 1) assurer le voyant sur la tension d&#39;alimentation sont hors service, 2) assurer la tension sur le multimètre est nul, et 3) mise à la terre les fils électriques. </li><li> Installez la solution appropriée électronébulisation pour votre expérience. </li><li> Allumez le gaz porteur et de régler le débit à la vitesse appropriée pour votre expérience. </li><li> Appliquer une pression vers le réservoir électronébulisation pour initier la livraison de la solution d&#39;électronébulisation à la chambre de réaction. </li><li> Tournez sur la tension d&#39;alimentation et d&#39;ajuster la tension à une valeur appropriée pour vos expériences. </li></ol> REMARQUE: À ce point les surfaces métalliques de la source d&#39;ionisation sont capables de délivrer un choc dangereux. Une grande prudence lorsque l&#39;on travaille autour de l&#39;instrument une fois la tension d&#39;alimentation a été activée. <ol start="6"><li> Mettre en place une méthode de réglage pour la surveillance du spectre SESI-MS tout en faisant affiné ajustements à la tension appliquée. Utiliser les paramètres d&#39;acquisition que vous avez optimisé pour votre système et votre expérience. Effacer l&#39;acquisition multiple canaux case à cocher (MCA) (le cas échéant) afin que chaque scan produit un spectre indépendante, réglez le temps d&#39;acquisition à 10 - 15 min, et lancer l&#39;acquisition. Spectres de l&#39;arrière-plan de gaz porteur devrait maintenant être observées. </li><li> Faire affiné ajustements à la tension appliquée pour obtenir un chromatogramme d&#39;ions stables total (CIT) et scans reproductibles qui correspondent le CO 2 scans pour vos expériences précédentes. Une fois les réglages de tension ont été faites, continuer à recueillir des spectres et TIC pendant cinq minutes pour s&#39;assurer que l&#39;instrument est stabilisé. </li><li> Une fois la stabilité instrumentale est assurée, mis en place la méthode d&#39;acquisition en fonction de vos échantillons, en ajustant le temps d&#39;acquisition, plage de données, et la sélection du MCA, au besoin. Recueillir un spectre de fond du gaz porteur pour vos dossiers. </li></ol> 5. Obtention d&#39;une empreinte digitale volatiles de votre culture bactérienne <ol><li> Pour collecter un spectre blanc, de diriger le flux de gaz porteur à travers les lignes de dérivation, puis attacher l&#39;échantillon blanc (vannes fermées) pour les lignes de transfert de gaz de l&#39;instrument. </li><li> Ouvrir les vannes de la bouteille d&#39;échantillon, et fermer les vannes des lignes de dérivation. </li><li> Laisser le système s&#39;équilibrer pendant 30 secondes, période pendant laquelle l&#39;humidité dans la chambre de réaction se stabilise. Cette période d&#39;équilibrage est essentiel pour obtenir des spectres reproductibles. Pour s&#39;assurer que le système est équilibré, vous pouvez surveiller les TIC, ce qui va changer au cours de la période d&#39;équilibration, et de stabiliser par la suite. </li><li> Une fois que le système est équilibré, amorcer la collecte de spectre. </li><li> Après le spectre est recueilli, retirer la bouteille en ouvrant d&#39;abord les lignes transporteur de gaz de dérivation, puis la fermeture des vannes de l&#39;échantillon, et enfin enlever la bouteille d&#39;échantillonnage. Rincez le système avec le gaz porteur pour 2 - 4 min, retirer l&#39;humidité et les volatiles adsorbées à partir des lignes de transfert, la prévention de l&#39;échantillon à l&#39;échantillon de report. </li><li> Répétez les étapes 5.2 à 5.5 pour chaque échantillon bactérien, par intermittence collecte supplémentaires spectres vide pour assurer approfondie vierge soustraction. Incomplet vierge soustraction mènera à laapparition de pics de fond chimiques dans votre spectre traité qui sont communes à l&#39;atmosphère des techniques d&#39;ionisation à pression (par exemple, les phtalates, les silicones, etc.) 9 </li><li> Lorsque la collecte de vos spectres, s&#39;assurer que les signaux d&#39;ions ne dépassent pas les limites de détection linéaire de votre instrument, tel que déterminé par les TIC et l&#39;intensité maximale des pics individuels. Ions dépasser les limites supérieures de détecteur de votre instrument peut générer des pics artefact qui ne sont pas représentatifs de votre échantillon. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs Comme un exemple des spectres SESI-MS qui peut être obtenue pour volatiles bactérienne, les empreintes positives mode ion volatiles pour E. coli et P. aeruginosa culture aérobie dans LB-Lennox de 24 h à 37 ° C sont représentées (fig. 2). Le E. spectre coli volatile est dominée par l&#39;indole à m / z = 118, ce qui donne E. coli cultures de leur odeur caractéristique, tandis que le spectre de P. aeruginosa contient une grande variété de pics protonable. S&#39;il vous plaît noter que les intensités relatives des pics dans le spectre volatiles sont dépendantes des paramètres instrumentaux décrits dans la section 3. Ces paramètres doivent être étroitement contrôlé d&#39;une expérience à afin d&#39;obtenir des spectres reproductibles. <img src="/files/ftp_upload/2664/2664fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2-vierge soustraite des ions positifs en mode SESI-spectres SM (20 - 150 m / z). De E. coli K12 et P. aeruginosa PAO1 volatils après 24 h de croissance aérobie dans LB-Lennox à 37 ° C. Pour plus de détails sur les pics observés dans les spectres du SESI, s&#39;il vous plaît se référer à Zhu, et al. 8.

<ol>
	<li>Fuerstenau, S., Kiselev, P., Fenn, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ESI-MS+in+the+analysis+of+trace+species+in+gases.">ESI-MS in the analysis of trace species in gases.</a> , (1999).</li><li>Wu, C., Siems, W. F., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+ion+mobility+spectrometry/mass+spectrometry+of+illicit+drugs.">Secondary electrospray ionization ion mobility spectrometry/mass spectrometry of illicit drugs.</a> Anal. Chem. 72, 396-403 (2000).</li><li>Tam, M., Hill, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization-ion+mobility+spectrometry+for+explosive+vapor+detection.">Secondary electrospray ionization-ion mobility spectrometry for explosive vapor detection.</a> Anal. Chem. 76, 2741-2747 (2004).</li><li>Martinez-Lozano, P., Rus, J., de la Mora, G. F., Hernandez, M., de la Mora, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Secondary+electrospray+ionization+(SESI)+of+ambient+vapors+for+explosive+detection+at+concentrations+below+parts+per+trillion.">Secondary electrospray ionization (SESI) of ambient vapors for explosive detection at concentrations below parts per trillion.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 287-294 (2009).</li><li>Martinez-Lozano, P., de la Mora, J. 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Les bactéries produisent différentes combinaisons de substances volatiles, qui peuvent être utilisés pour l&#39;identification bactérienne 10-12 et l&#39;évaluation de l&#39;état métabolique. La méthode SESI-MS décrit ici fournit un moyen de caractériser rapidement volatiles bactérienne (en deux minutes ou moins), sans aucune préparation d&#39;échantillon, générant un bactériennes «empreinte digitale» pour l&#39;identification de l&#39;espèce. 8 Dans les dernières décennies ionisation d&#39;autres la pression atmosphérique techniques de SM ont été appliquées à la caractérisation de composés volatils, y compris les tubes de flux d&#39;ions sélectifs (FIPD) et la réaction de transfert de protons (PTR) spectrométrie de masse. L&#39;avantage distinctif qui SESI fournit plus de ces méthodes d&#39;ionisation d&#39;autres, c&#39;est qu&#39;il est possible de pics de fragments spécifiques (à condition que le type approprié de spectromètre de masse a été adapté pour le SESI), qui est un outil important pour l&#39;identification composé. Nous n&#39;avons pas abordé la fragmentation de pointe dans le protocole ci-dessus, mais pour des exemples de la façon dont les informations de fragmentation peut être utilisé dans la caractérisation des composés volatils bactériennes, s&#39;il vous plaît se référer à Zhu, et al. 8 SESI-MS a une application directe de la détection in situ des infections pulmonaires bactériennes via l&#39;analyse d&#39;haleine, mais peut aussi être appliqué à n&#39;importe quel décor dans lequel l&#39;échantillonnage volatile est possible. Par exemple, les analyses de composés volatils dans l&#39;urine, le sang et le souffle, qui sont pertinents pour le diagnostic des troubles métaboliques, les maladies gastro-intestinales, le cancer et l&#39;exposition environnementale, sont bien adaptés pour le SESI-MS. 13,14 SESI-MS a également un large éventail de non-applications cliniques empreintes de COV, y compris l&#39;analyse rapide des aliments pour les volatiles caractéristique associée à la maturation, le vieillissement, ou gâter. 15-18

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du produit </td><td> Tapez </td><td> Société </td><td> Catalogue # </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> API-3000 triple quadripôle </td><td> Instrument </td><td> SCIEX </td><td></td><td> Acheté avec analyste 1.4.2 (Applied Biosystems) </td></tr><tr><td> SESI Ion Source </td><td> Instrument </td><td></td><td></td><td> Sur mesure; Voir référence 6 </td></tr><tr><td> Débitmètre gaz </td><td> Équipement </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-03217-74 </td><td></td></tr><tr><td> Le dioxyde de carbone </td><td> Équipement </td><td> Airgas </td><td> CD I300 </td><td> ≥ pur à 99,99% </td></tr><tr><td> D&#39;azote </td><td> Équipement </td><td> Airgas </td><td> NI UHP300 </td><td> Ultra haute pureté </td></tr><tr><td> 100 ml bouteilles en verre des médias </td><td> Équipement </td><td> VWR </td><td> 89012-114 </td><td> GL45 filetage </td></tr><tr><td> Capsules de bouteilles avec des ports Luer </td><td> Équipement </td><td> Bio Chem Fluidique </td><td> 00945T-3 </td><td> Cap Assemblée </td></tr><tr><td> Luer le port fiches </td><td> Équipement </td><td> Bio Chem Fluidique </td><td> 009LP </td><td> Cap Assemblée </td></tr><tr><td> Tube 1 / 4 &quot;(DO) x 1 / 8&quot; (ID) </td><td> Équipement </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-95875-02 </td><td> Cap assemblage et les lignes de transfert de gaz </td></tr><tr><td> Tube 1 / 8 &quot;(DO) x 1 / 16&quot; (ID) </td><td> Équipement </td><td> Cole-Parmer </td><td> EW-06605-27 </td><td> Cap Assemblée </td></tr><tr><td> Vannes à deux voies </td><td> Équipement </td><td> Cole-Parmer </td><td> 07391-04 </td><td> Cap Assemblée </td></tr><tr><td> Filtre, Grade AAQ </td><td> Équipement </td><td> Filtres Balston </td><td> 9922-05 </td><td></td></tr><tr><td> Acide formique, LC / MS de grade </td><td> Réactifs </td><td> Fisher </td><td> A117-05AMP </td><td> Solution électronébulisation </td></tr><tr><td> Le méthanol, LC / MS de grade </td><td> Réactifs </td><td> Fisher </td><td> A456-500 </td><td> Solution électronébulisation </td></tr><tr><td> Eau, LC / MS de grade </td><td> Réactifs </td><td> Fisher </td><td> W6-500 </td><td> Solution électronébulisation </td></tr></tbody></table>

characterizing bacterial volatiles using secondary electrospray ionization mass spectrometry (sesi-ms)

Secondaire ionisation par électronébulisation spectrométrie de masse (SESI-MS) est une méthode développée pour la détection rapide de composés volatils, sans la nécessité pour le prétraitement de l&#39;échantillon. La méthode a été décrite par Fenn et ses collègues 1 et a été appliquée à la détection de drogues illicites et d&#39;explosifs 2 3-4, la caractérisation de cinq volatiles peau, et l&#39;analyse de souffle 6-7. Ionisation SESI produit par des réactions de transfert de protons entre la solution d&#39;électronébulisation et de l&#39;analyte volatiles, et est donc adapté à l&#39;analyse de l&#39;hétéro-molécules organiques, comme dans d&#39;ionisation électrospray traditionnelle (ESI). Cependant, contrairement à ESI standard, le processus de transfert de protons du SESI survient dans la phase vapeur plutôt que dans la solution (Fig. 1), et donc le SESI est le mieux adapté pour la détection de substances organiques volatiles et les aérosols. Nous élargissons l&#39;utilisation de la SESI-MS pour la détection de substances volatiles bactériennes comme une méthode pour l&#39;identification bactérienne et la caractérisation 8. Nous avons démontré que le SESI-MS empreintes volatiles, combiné avec une méthode d&#39;analyse statistique, peut être utilisé pour différencier les genres bactériens, des espèces et des cultures mixtes dans une variété de milieux de croissance. 8 Ici, nous fournir les étapes pour l&#39;obtention d&#39;empreintes digitales bactérienne volatiles en utilisant le SESI -MS, y compris les paramètres instrumentaux qui devrait être optimisé pour assurer robustes identification bactérienne et de caractérisation.

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Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry SESI-MS

Secondaire ionisation par électronébulisation spectrométrie de masse (SESI-MS) permet la détection de composés organiques volatils (COV) sans avoir besoin d&#39;aucune préparation d&#39;échantillons. Ce protocole fournit des instructions pour le rapide (quelques minutes) la caractérisation des COV bactériennes utilisant le SESI-MS.

Caractériser Volatiles bactérienne secondaire à l&#39;aide d&#39;ionisation électrospray spectrométrie de masse (SESI-MS)

Secondary electrospray ionization mass spectrometry (SESI-MS) is a method developed for the rapid detection of volatile compounds, without the need for ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Characterizing Bacterial Volatiles using Secondary Electrospray Ionization Mass Spectrometry (SESI-MS)

17.8K vues.  University of Vermont. Secondaire ionisation par électronébulisation spectrométrie de masse (SESI-MS) permet la détection de composés organiques volatils (COV) sans avoir besoin d'aucune préparation d'échantillons. Ce protocole fournit des instructions pour le rapide (quelques minutes) la caractérisation des COV bactériennes utilisant le SESI-MS.

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Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

L&#39;extraction des lipides cellulaires pour ciblées dilution isotopique stable analyse de spectrométrie de masse chromatographie liquide-

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

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Bacterial Detection &amp; Identification Using Electrochemical Sensors

Electrochemical sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and can be adapted for detection of a wide variety of analytes. Electrochemical sensors operate by transducing a biological recognition event into a useful electrical signal. Signal transduction occurs by coupling the activity of a redox enzyme to an amperometric electrode. Sensor specificity is either an inherent characteristic of the enzyme, glucose oxidase in the case of a glucose sensor, or a product of linkage between the enzyme and an antibody or probe.
Here, we describe an electrochemical sensor assay method to directly detect and identify bacteria. In every case, the probes described here are DNA oligonucleotides. This method is based on sandwich hybridization of capture and detector probes with target ribosomal RNA (rRNA). The capture probe is anchored to the sensor surface, while the detector probe is linked to horseradish peroxidase (HRP). When a substrate such as 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) is added to an electrode with capture-target-detector complexes bound to its surface, the substrate is oxidized by HRP and reduced by the working electrode. This redox cycle results in shuttling of electrons by the substrate from the electrode to HRP, producing current flow in the electrode.

We describe an electrochemical sensor assay method for rapid bacterial detection and identification. The assay involves a sensor array functionalized with DNA oligonucleotide capture probes for ribosomal RNA (rRNA) species-specific sequences. Sandwich hybridization of target rRNA with the capture probe and a horseradish peroxidase-linked DNA oligonucleotide detector probe produces a measurable amperometric current.

Bacterial Detection &amp; identification au moyen de capteurs électrochimiques

Electrochemical  sensors are widely used for rapid and accurate measurement of blood glucose and  can be adapted for detection of a wide variety of ...

Imaging of Biological Tissues by Desorption Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological tissues at the hundreds to tens of microns scale. When performed under ambient conditions, sample pre-treatment becomes unnecessary, thus simplifying the protocol while maintaining the high quality of information obtained. Desorption electrospray ionization (DESI) is a spray-based ambient MSI technique that allows for the direct sampling of surfaces in the open air, even in vivo. When used with a software-controlled sample stage, the sample is rastered underneath the DESI ionization probe, and through the time domain, m/z information is correlated with the chemical species' spatial distribution. The fidelity of the DESI-MSI output depends on the source orientation and positioning with respect to the sample surface and mass spectrometer inlet. Herein, we review how to prepare tissue sections for DESI imaging and additional experimental conditions that directly affect image quality. Specifically, we describe the protocol for the imaging of rat brain tissue sections by DESI-MSI.

Desorption electrospray ionization mass spectrometry (DESI-MS) is an ambient method by which samples, including biological tissues, can be imaged with minimal sample preparation. By rastering the sample below the ionization probe, this spray-based technique provides sufficient spatial resolution to discern molecular features of interest within tissue sections.

Imagerie des tissus biologiques par désorption ionisation électrospray spectrométrie de masse

Mass spectrometry imaging (MSI) provides untargeted molecular information with the highest specificity and spatial resolution for investigating biological ...

Sample Preparation Strategies for Mass Spectrometry Imaging of 3D Cell Culture Models

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with some of the spatial and molecular complexity of tissue. For example, many cell lines form 3D structures given appropriate in vitro conditions. Colon cancer cell lines form 3D cell culture spheroids, in vitro mimics of avascular tumor nodules. While immunohistochemistry and other classical imaging methods are popular for monitoring the distribution of specific analytes, mass spectrometric imaging examines the distribution of classes of molecules in an unbiased fashion. While MALDI mass spectrometric imaging was originally developed to interrogate samples obtained from humans or animal models, this report describes the analysis of in vitro three dimensional cell cultures, including improvements in sample preparation strategies. Herein is described methods for growth, harvesting, sectioning, washing, and analysis of 3D cell cultures via matrix-assisted laser desorption/ionization-mass spectrometry (MALDI-MS) imaging. Using colon carcinoma 3D cell cultures as a model system, this protocol demonstrates the ability to monitor analytes in an unbiased fashion across the 3D cell culture system with MALDI-MSI.

Immortalized cancer cell lines can be grown as 3D cell cultures, a valuable model for biological research. This protocol describes mass spectrometry imaging of 3D cell cultures, including improvements in the sample preparation platform. The goal of this protocol is to instruct users to prepare 3D cell cultures for mass spectrometry imaging analysis.

Exemple Stratégies Préparation de Spectrométrie de Masse Imagerie de culture cellulaire 3D Modèles

Three dimensional cell cultures are attractive models for biological research. They combine the flexibility and cost-effectiveness of cell culture with ...

Qualitative Characterization of the Aqueous Fraction from Hydrothermal Liquefaction of Algae Using 2D Gas Chromatography with Time-of-flight Mass Spectrometry

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in complex mixtures. It is often used to analyze gasoline, jet fuel, diesel, bio-diesel and the organic fraction of bio-crude/bio-oil. In most of those analyses, the first dimension of separation is non-polar, followed by a polar separation. The aqueous fractions of bio-crude and other aqueous samples from biofuels production have been examined with similar column combinations. However, sample preparation techniques such as derivatization, solvent extraction, and solid-phase extraction were necessary prior to analysis. In this study, aqueous fractions obtained from the hydrothermal liquefaction of algae were characterized by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry without prior sample preparation techniques using a polar separation in the first dimension followed by a non-polar separation in the second. Two-dimensional plots from this analysis were compared with those obtained from the more traditional column configuration. Results from qualitative characterization of the aqueous fractions of algal bio-crude are discussed in detail. The advantages of using a polar separation followed by a non-polar separation for characterization of organics in aqueous samples by two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry are highlighted.

A two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry method is described for characterization of the aqueous fraction of bio-crude produced from hydrothermal liquefaction of algae. This protocol can also be employed to analyze the aqueous fraction of liquid products from fast pyrolysis, catalytic fast pyrolysis, catalytic deoxygenation and hydro-treating.

Caractérisation qualitative de la fraction aqueuse de hydrothermale Liquéfaction d&#39;algues Utilisation 2D chromatographie en phase gazeuse avec le temps de vol Spectrométrie de masse

Two-dimensional gas chromatography coupled with time-of-flight mass spectrometry is a powerful tool for identifying and quantifying chemical components in ...

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption electrospray ionization (MALDESI) is an example of such methods, where features of matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) (e.g., pulsed nature of desorption) and electrospray ionization (ESI) (e.g., soft-ionization) are combined. One of the major advantages of MALDESI is its inherent versatility. In MALDESI experiments, an ultraviolet (UV) or infrared (IR) laser can be used to resonantly excite an endogenous or exogenous matrix. The choice of matrix is not analyte dependent, and depends solely on the laser wavelength used for excitation. In IR-MALDESI experiments, a thin layer of ice is deposited on the sample surface as an energy-absorbing matrix. The IR-MALDESI source geometry has been optimized using statistical design of experiments (DOE) for analysis of liquid samples as well as biological tissue specimens. Furthermore, a robust IR-MALDESI imaging source has been developed, where a tunable mid-IR laser is synchronized with a computer controlled XY translational stage and a high resolving power mass spectrometer. A custom graphical user interface (GUI) allows user selection of the repetition rate of the laser, number of shots per voxel, step-size of the sample stage, and the delay between the desorption and scan events for the source. IR-MALDESI has been used in variety of applications such as forensic analysis of fibers and dyes and MSI of biological tissue sections. Distribution of different analytes ranging from endogenous metabolites to exogenous xenobiotics within tissue sections can be measured and quantified using this technique. The protocol presented in this manuscript describes major steps necessary for IR-MALDESI MSI of whole-body tissue sections.

Whole-body Mass Spectrometry Imaging by Infrared Matrix-assisted Laser Desorption Electrospray Ionization IR-MALDESI

A mass spectrometry imaging (MSI) source operated at atmospheric pressure was developed by coupling mid-infrared laser desorption and electrospray post-ionization. Exogenous ice matrix was used as the energy-absorbing matrix to facilitate resonant desorption of tissue-related material. This manuscript provides a step-by-step protocol for performing IR-MALDESI MSI of whole-body neonatal mouse.

Corps entier Spectrométrie de masse d&#39;imagerie par infrarouge laser assistée par matrice désorption Electrospray Ionisation (IR-MALDESI)

Ambient ionization sources for mass spectrometry (MS) have been the subject of much interest in the past decade. Matrix-assisted laser desorption ...

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

Caractérisation de la Migration cellulaire dans les trois dimensions In Vitro plaie environnements

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingénierie « Golden » Fluorescence par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques et analyse des protéines par spectrométrie de masse et de Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria can undergo changes in the physiology due to the exposure to host growth environment and the presence of the host cells. We developed an assay to rapidly measure the virulence state of bacteria that minimize the extent to which bacteria grow in the presence of host cells. Bacteria and amoebae are mixed together and immobilized on a single imaging plane using an agar pad. The procedure uses single-cell fluorescence imaging with calcein-acetoxymethyl ester (calcein-AM) as an indicator of host cell health. The fluorescence of host cells is analyzed after 1 h of exposure of host cells to bacteria using epifluorescence microscopy. Image analysis software is used to compute a host killing index. This method has been used to measure virulence within planktonic and surface-attached Pseudomonas aeruginosa sub-populations during the initial stage of biofilm formation and may be adapted to other bacteria and other stages of biofilm growth. This protocol provides a rapid and robust method of measuring virulence and avoids many of the complexities associated with the growth and maintenance of mammalian cell lines. Virulence phenotypes measured here using amoebae have also been validated using mouse macrophages. In particular, this assay was used to establish that surface attachment upregulates virulence in P. aeruginosa.

Here, we present a protocol to measure the virulence of planktonic or surface-attached bacteria using D. discoideum (amoeba) as a host. Virulence is measured over a period of 1 h and host killing is quantified using fluorescence microscopy and image analysis. We demonstrate this protocol using the bacterium P. aeruginosa.

Un dosage de la Virulence bactérienne rapide basé sur une Image à l’aide d’amibe

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Préparation des cellules synthétiques produisant des protéines à l’aide d’extraits bactériens exempts de cellules, de liposomes et de transfert d’émulsion

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...