Ce travail a été soutenu par l&#39;USDA 1999-35212-8680 subventions, de 2005 à 01378, et 2010-04288-01, USDA fonds à formule et l&#39;État de Géorgie Subvention de recherche en médecine vétérinaire agricole. Le protocole décrit dans la présente publication a été développé pour une utilisation par les étudiants dans le cadre de cours de recherche dirigée: MIBO 4900L, GENE 4960H, BCMB 4960L et 4960H BIOL à l&#39;Université de Géorgie et utilisés par les étudiants sur plusieurs projets de recherche en épidémiologie moléculaire dans l&#39;Maurer laboratoire. Nous tenons à remercier les nombreux étudiants de premier cycle qui ont effectué des recherches dans les laboratoires de Maurer et Lee, et notre chef de département, John Glisson pour soutenir nos efforts pour intégrer l&#39;enseignement de premier cycle à la recherche.

<ol>
	<li>Dauga, C., Zabrovskaia, A., Grimont, P. A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Restriction+fragment+length+polymorphism+analysis+of+some+flagellin+genes+of+Salmonella+enterica.">Restriction fragment length polymorphism analysis of some flagellin genes of Salmonella enterica.</a> J. Clin. Microbiol. 36, 2835-2843 .</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, M. D., Hofacre, C. L., Maier, M., White, D. G., Ayers, S., Wang, L., Berghaus, R., Maurer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapid+screen+of+broth+enrichments+for+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg,+and+Typhimurium+using+an+allelotyping+multiplex+PCR+that+targets+O+and+H+antigen+alleles.">A rapid screen of broth enrichments for Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium using an allelotyping multiplex PCR that targets O and H antigen alleles.</a> J. Food Prot. 72, 2198-2201 (2009).</li><li>Hong, Y., Liu, T., Lee, H. o. f. a. c. r. e., Maier, C. L., White, M., Ayers, D. G., Wang, S., Berghaus, L., R, M. a. u. r. e. r. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.Rapid+screening+of+Salmonella+enterica+serovars+Enteritidis,+Hadar,+Heidelberg+and+Typhimurium+using+a+serologically-correlative+allelotyping+PCR+targeting+the+O+and+H+antigen+alleles.">J.Rapid screening of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg and Typhimurium using a serologically-correlative allelotyping PCR targeting the O and H antigen alleles.</a> BMC Microbiol. , (2008).</li><li>Liu, T., Liljebjelke, K., Bartlett, E., Hofacre, C. L., Sanchez, S., Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+nested+PCR+to+detection+of+Salmonella+in+poultry+environments.">Application of nested PCR to detection of Salmonella in poultry environments.</a> J. Food Prot. 65, 1227-1232 (2002).</li><li>Maurer, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+detection+and+limitation+of+molecular+techniques.">Rapid detection and limitation of molecular techniques.</a> Ann. Rev. Food Sci. Tech. 2, 259-279 (2011).</li><li>Moscoso, H., Alvarado, I., Hofacre, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+analysis+of+infectious+bursal+disease+virus+from+bursal+tissues+collected+on+FTA+filter+paper.">Molecular analysis of infectious bursal disease virus from bursal tissues collected on FTA filter paper.</a> Avian Dis. 50, 391-396 (2006).</li><li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular cloning: a laboratory. , (1989).</li><li>Wittwer, C. T., Fillmore, G. C., Hillyard, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+polymerase+chain+reaction+capillary+tubes+with+hot+air.">Automated polymerase chain reaction capillary tubes with hot air.</a> Nucleic Acids Res. 17, 4353-4357 (1989).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La plupart disponibles dans le commerce des tests PCR pour la détection de gènes cibles Salmonella unique pour le genre (ex. invA). Cependant, tous les salmonelles sont égaux dans leur capacité à causer la maladie chez l&#39;homme ou de la prévalence dans les populations animales. La reconnaissance précoce des différences antigéniques de Salmonella LPS O-antigène et flagellinH1 et les antigènes H2 a conduit à la différenciation de Salmonella dans plus de 2500 sérovars en fonction de ces différences antigéniques. Il ya 46 différents antigènes O et 86 distinctes flagelline (H) des antigènes identifiés dans le genre Salmonella. Salmonella peuvent posséder un (H1) ou de deux différentes (H1 et H2) flagellines. La combinaison différente de O, H1 et H2 antigènes compte des sérotypes de Salmonella les 2500 aujourd&#39;hui reconnu. Un sérovar est attribué selon la formule antigénique dérivée de l&#39;identification de l&#39;individu antigènes O et H. La formule antigénique est écrit comme O: H1: H2, et où &quot;-&quot;, se réfère à l&#39;absence de H1 ou H2 flagelline et «NT» (non typables) pour Salmonella négatives pour l&#39;antigène O. Par exemple, le sérovar Typhimurium est attribué à un S. enterica isoler avec la formule antigénique B: i: 1,2 alors que Enteritidis est donnée à un isolat avec la D1 la formule: g, m: -. Cette variation antigénique dans la population de Salmonella est la manifestation extérieure de différences au niveau des nucléotides qui peuvent donc être facilement exploitée par PCR. Nous avons identifié les différences génétiques associés à des allèles O et H pour développer une PCR allélotypage pour identifier S. sérovars enterica: Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium (3). L&#39;attribution correcte et les rapports de Salmonella sérotype nécessite des tests pour tous les allèles associés à O: H1: formules antigéniques H2 pour Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B : r: 1,2), et Typhimurium (B: i: 1,2). Sans la connaissance de l&#39;allèle O ou antigène, la conclusion de la g H1, allèle m ne suffit pas nécessairement identifier les salmonelles isolat comme Enteritidis que d&#39;autres sérotypes de Salmonella les: Agona, en Californie, et à Montevideo, possèdent également cette même allèle. Alors que la PCR allélotypage a été initialement conçu pour détecter l&#39;avant mentionnés sérovars de Salmonella, ce test peut identifier 19 autres sérovars (tableau 3). Notre allélotypage PCR a été initialement conçu pour détecter les allèles O et H. En pratique, il est devenu plus pratique et rentable pour nous d&#39;identifier les O-antigène par agglutination sur lame, en utilisant O antisérum spécifique, plutôt que d&#39;effectuer l&#39;O allélotypage PCR lorsque l&#39;on travaille avec des cultures de Salmonella isolés. Cependant, nous ne recommandons d&#39;utiliser l&#39;O allélotypage PCR si votre laboratoire utilise cette PCR comme un écran (2) ou pour le typage des isolats de Salmonella soumis le FTA cartes (6), et comprennent une PCR Salmonella spécifique avec le premier écran d&#39;échantillons (4 ). Limiter le PCR allélotypage aux seuls échantillons qui sont identifiées comme Salmonella par PCR ou tests biochimiques / antigénique. Le protocole décrit dans cet article a été optimisé pour une utilisation avec le Rapidcycler Idaho Technology, un thermocycleur à air chaud qui permet de réduire les volumes de réaction et les conditions de réaction fonctionne en moins de temps que de nombreux thermocycleurs bloc de chauffage. Pour adapter ce protocole pour l&#39;utilisation avec un thermocycleur bloc chauffant peut exiger l&#39;optimisation des conditions de réaction empiriquement par l&#39;abaissement / élévation des températures de recuit; ajustant concentrations d&#39;amorces, ou ajuster les concentrations de MgCl 2. Par exemple, nous avons dû adapter le protocole pour le MJ Research PTC-200 thermocycleur comme suit. Travailler avec les volumes réaction décrite dans le tableau 1, le stock de travail concentrationof l&#39;ensemble d&#39;amorces i a été dilué à 2,5 uM, la température de recuit a été abaissé de 55 ° C à 45 ° C, temps d&#39;incubation et à la dénaturation, d&#39;hybridation et l&#39;extension des mesures a été allongée à 20 s pour la PCR i / g, m allélotypage. Ayant les contrôles positifs et négatifs appropriés sont essentiels dans le démarrage initial et d&#39;optimisation pour les PCR, y compris les protocoles publiés. Nous recommandons l&#39;acquisition de sérotypes de Salmonella les connus, spécifiquement anatum (E1: E, H: 1,6), Enteritidis (D1: g, m: -), Hadar (C2: z10: e, n, x), Heidelberg (B: r : 1,2), Montevideo (C1: g, m, s: 1,2,7) et Typhimurium (B: i: 1,2) et un laboratoire d&#39;Escherichia coli K12 (DH5a, LE393, JM109, etc ) comme contrôles positifs et négatifs, respectivement pour les tests de PCR allélotypage décrit dans cet article. Plusieurs de ces sérotypes de Salmonella les servira comme contrôles positifs ou négatifs, selon le allèle est testé. Certaines précautions et les directives doivent être suivies tout en effectuant ceci et tout autre diagnostic par PCR. Tout d&#39;abord, la séparation physiquede la préparation de modèles, PCR set-up, et électrophorèse sur gel est essentiel dans la prévention de possibles PCR report de contamination et de rapports erronés de faux positifs. En outre, l&#39;inclusion de contrôles appropriés sont nécessaires dans toute routine PCR comme ces contrôles d&#39;identifier les problèmes à mesure qu&#39;ils surviennent et d&#39;aider à l&#39;interprétation des résultats (5). Surtout, la cohérence est essentielle, notamment en ce qui concerne les conditions d&#39;électrophorèse pour les andestimation amplicon détection (produit PCR) de taille de l&#39;amplicon. Pour illustrer ce point, nous avons délibérément suspendu électrophorèse plus tôt que prévu à la figure 1A. Les standards de poids moléculaire (voies 1 et 13) et le contrôle positif (piste 2) ne sont pas suffisamment séparés pour estimer avec précision tailles ou d&#39;observer la séparation de fragments d&#39;ADN où il ya des petites différences (~ 50 pb) dans les tailles. Une séparation adéquate des fragments d&#39;ADN, en particulier les normes de poids moléculaire, est essentiel que les rapports positifs dépend de l&#39;estimation précise de la taille amplicon et de distinguer «vrai positif» de la non-spécifiques amplicons qui sont parfois observés dans le fonctionnement quotidien de toute la PCR (5 ). Par exemple, il ya un amplicon non spécifiques à la figure 1B, piste 7 (~ 700 pb de taille). Avaient été abandonnées par électrophorèse trop tôt, quand le front de colorant a été seulement au point à mi-chemin dans le gel d&#39;agarose, il y aurait peu de différenciation entre 500 pb et 700 pb des fragments d&#39;ADN. Par conséquent, l&#39;échantillon dans le couloir 7 aurait été indiqué à tort comme positive pour les deux i et g, m allèles. Enfin, on doit reconnaître les limites associées à toute épreuve. Plusieurs des PCR H1/H2 allélotypage n&#39;ont pas le pouvoir de discrimination subtile à discerner des différences génétiques dans allèles appartenant à l&#39;H2 1,2; 1,5; 1,6; 1,7 complexe antigène; e, n, x / e , n, Z15 complexe antigène et le complexe antigène G H1, qui comprend le g, m allèle. Un ou deux changements d&#39;acides aminés représentent les épitopes différents présents dans ces antigènes flagellaires. Il était donc difficile pour nous de concevoir des amorces qui pourraient exploiter ces différences, parfois seule paire de base dans la séquence du gène flagelline (3). Par exemple, Salmonella sérovars Dublin (D1: g, p: -) et Berta (D1: f, g, t: -) sont également positifs par PCR avec nos g, mallelotyping amorces. Les amorces H2 allélotypage ne peut pas distinguer Typhimurium (B: i: 1,2) de Lagos (B: i: 1,5), Heidelberg (B: r: 1,2) de Bradford (B: r: 1,5), Winneba (B: r: 1,6), ou Remo (B: r: 1,7), ou Hadar (C2: z10: e, n, x) de Glostrup (C2: z10: E, N, Z15). Alors que la probabilité de rencontrer certains de ces sérotypes: Lagos, Bradford, Winneba, Remo ou Glustrup est distant, c&#39;est une possibilité et nécessite soit en fournissant disclaimer sur la limitation des essais »ou un autre test de confirmation. En conclusion, cette sérotypage basé sur la PCR identifie rapidement S. enterica sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium, et O, H1, H2 et allèles associés à 19 sérovars supplémentaires. Ce dosage est rapide, efficace alternative à l&#39;approche microbiologique traditionnelle à Salmonella sérotype.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du produit </th><th> Tapez </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaire </th></tr><tr><td> Luria Bertani </td><td></td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Tubes Microfuge </td><td> 1,5 ml de capacité </td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Éthanol </td><td> 200 la preuve </td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> Année de biologie moléculaire </td><td> Sigma </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable; PCR uniquement) </td></tr><tr><td> 10 x tampon PCR: </td><td> 20 mM MgCl 2 </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td> (Tampon est livré avec la BSA, Ficoll et tartrazine) </td></tr><tr><td></td><td> 30 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 40 mM MgCl 2 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Des amorces de PCR </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> DMSO </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> dNTP </td><td></td><td> Roche </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Taq ADN polymérase </td><td></td><td> Denville </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Pipettes capillaires </td><td> Volume de 10 ul </td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rapide Cycler </td><td></td><td> Idaho Technology </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Agarose </td><td> Faible TEE; année de biologie moléculaire </td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> 50 X tampon TAE ou TBE 5X Buffer </td><td></td><td> Fisher </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Le bromure d&#39;éthidium </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Horizontale, la chambre submersible électrophorèse sur gel avec de la moisissure sur gel </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Alimentation </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr><tr><td> Molecular Imager Gel Doc système </td><td></td><td> BioRad </td><td></td><td> (Ou toute autre source comparable) </td></tr></tbody></table> Tableau 4. Matériaux

an allelotyping pcr for identifying salmonella enterica serovars enteritidis, hadar, heidelberg, and typhimurium

Commerciale actuelle des tests PCR pour identifier les gènes cibles Salmonella unique de ce genre. Cependant, il ya deux espèces, six sous-espèces, et plus de 2500 sérotypes de Salmonella les différents, et tous ne sont pas égaux dans leur signification pour la santé publique. Par exemple, trouver S. enterica sous-espèce de l&#39;Arizona IIIa sur une ferme couche de table de l&#39;œuf est insignifiant comparé à l&#39;isolement de S. enterica sérotype Enteritidis, je sous-espèces, la principale cause de salmonellose liée à la consommation d&#39;œufs de table. Sérovars sont identifiés sur la base des différences antigéniques des lipopolysaccharides (LPS) (antigène O) et la flagelline (H1 et H2 antigènes). Ces différences antigéniques sont l&#39;aspect extérieur de la diversité des gènes et allèles du gène associé à ce phénotype. Nous avons développé une allélotypage, la PCR multiplex que les touches sur les différences génétiques entre les quatre principaux S. enterica sous-espèce de sérovars j&#39;ai trouvé dans la volaille et associés aux maladies humaines importantes aux États-Unis. Les paires d&#39;amorces de PCR ont été ciblées pour les principaux gènes ou des séquences uniques d&#39;un sérotype de Salmonella spécifique et destinée à produire un amplicon avec la taille spécifique pour ce gène ou allèle. Salmonella sérovar est attribué à un isolat basée sur la combinaison des résultats des tests PCR pour LPS spécifiques et allèles du gène flagelline. La PCR multiplex décrit dans cet article sont spécifiques pour la détection de S. enterica sous-espèce, je sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium. Ici, nous montrent comment utiliser les PCR multiplex pour identifier sérovar Salmonella pour un isolé.

Watch this Scientific Journal Video about An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium at JoVE.com

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Nous décrivons un multiplex pour la détection rapide de Salmonella enterica sérovars, Hadar, Heidelberg et Typhimurium PCR. Sérotypes de Salmonella les particuliers peuvent être identifiés, en ciblant un multiplex PCR pour les gènes et les séquences uniques à la grappe biosynthèse de l&#39;antigène O et la flagelline d&#39;un sérovar donné. Sérovar est affecté ensuite à une Salmonella isoler basé sur l&#39;apparence des amplicons spécifiques de taille, (produit de PCR) correspondant à l&#39;allèle cible.

Une PCR pour l&#39;identification allélotypage Salmonella enterica Sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

an-allelotyping-pcr-for-identifying-salmonella-enterica-serovars

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

21.6K vues.  University of Georgia. Nous décrivons un multiplex pour la détection rapide de Salmonella enterica sérovars, Hadar, Heidelberg et Typhimurium PCR. Sérotypes de Salmonella les particuliers peuvent être identifiés, en ciblant un multiplex PCR pour les gènes et les séquences uniques à la grappe biosynthèse de l'antigène O et la flagelline d'un sérovar donné. Sérovar est affecté ensuite à une Salmonella isoler basé sur l'apparence des amplicons spécifiques de taille, (...