Ce projet a été soutenu en partie par une subvention pour les National Institutes of Health NIAID (pour AJB et LGA, R01 AI076246). La collection de mutants de Salmonella a été financé en partie par les Instituts nationaux de la santé (subventions pour MM, U01 A152237-05, R01, R01 AI07397-01 AI039557-11 et R01 AI075093-01), en partie par les Instituts nationaux de subventions de la santé (pour HAP, R21 AI083964-01, 1R0 1AI083646-01, 1R56AI077645, R01 AI075093). Nous remercions Steffen Prowollik pour réplique de placage et de confirmer les mutants de la collection.

1 murin macrophage RAW264.7 culture cellulaire <ol><li> Cultiver les cellules de macrophages murins faible numéro de passage, RAW264.7 (Le numéro ATCC ®, TIB-71) dans une culture de cellules ballon évacué capuchon T-75 de filtre dans du milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) , 0,5% de NaHCO 3, et 1% d&#39;acides aminés non essentiels 100x (NEAA) à 37 ° C, dans un incubateur à CO2 à 5%. </li><li> Une fois que les cellules atteignent une confluence de 60 à 80% dans le flacon, en utilisant un racleur de cellules pour récolter les cellules et compter les cellules dans un hémacytomètre et calculer la concentration de cellules. </li><li> Remettre en suspension les cellules et diluer la concentration de cellules dans 2,5 x 10 5 / ml dans du milieu de culture cellulaire DMEM frais. Utiliser des pipettes multicanaux à la plaque 200 pl de DMEM milieu de culture cellulaire contenant 5 x 10 4 cellules dans chaque puits de plaques à 96 puits pour culture cellulaire. </li><li> Plate quatre puits de chaque souche de Salmonella. Mettre en place trois plaques distinctes pour un ensemblede phagocytaire essai cellules d&#39;invasion, et les marquer avec «association», «invasion» et de «réplication», respectivement. </li><li> Placer les plaques dans 5% de CO 2 incubateur à 37 ° C ON pour permettre aux cellules de se fixer des macrophages au fond des puits. </li></ol> 2 Préparation de type sauvage et des mutants de Salmonella <ol><li> Le même jour de la préparation des cellules macrophages RAW264.7, prélever des colonies simples de type sauvage (WT) Salmonella enterica sérotype 14028s Typhimurium, mutant DinvA, DphoP mutants, et les souches mutantes de test souhaités, et de la culture eux dans Luria-Bertani ( LB) complété avec des antibiotiques, le cas échéant. Utilisation chaque ensemble de cellules phagocytaires dosages d&#39;invasion de tester un maximum de 10 souches mutantes (mutants DinvA et DphoP mutant défectueux en replication et invasion intracellulaire, respectivement). </li><li> Cultiver les bactéries pendant 14 heures à 37 ° C avec sHaking à 220 tours par minute dans 5 ml de bouillon LB chaque bouchée non hermétiquement dans 14 ml dans un tube en polypropylène à fond rond. Bouillon LB contenant les antibiotiques appropriés, dans notre cas, la plupart des souches mutantes sont résistantes à la kanamycine, 50 pg / ml </li><li> Le lendemain, la sous-culture de chacun des sur des cultures de souches de Salmonella dans la plaine 5 ml de bouillon LB dans un rapport de 1:50 pour un 4 heures supplémentaires sous agitation à 220 rpm. </li><li> Lire OD 600 valeurs de chaque culture bactérienne sur un spectrophotomètre, et chaque lecture doit aller de 0,6 à 1,2 pour optimiser la pathogénicité de Salmonella île-1 de type III système de sécrétion (SPI-1 SSTT) l&#39;expression du gène de l&#39;invasion. </li><li> Utilisation de la formule 1 DO 600 = 7,5 x 10 8 CFU / ml pour estimer la concentration bactérienne, puis diluer les bactéries à une concentration de 5 x 10 6 UFC / ml dans du milieu de culture cellulaire DMEM frais. </li></ol> 3. Invasion test dans 96 puits Culture Plate <ol><li> Retirez trois cel 96 puitsplaques l de culture de l&#39;incubateur à CO 2 et laver chaque puits une fois avec 200 pi de tampon PBS 1x. </li><li> Après le lavage et l&#39;élimination complète de PBS, ajouter 200 ul bactéries dans un milieu DMEM (voir ci-dessus) dans chaque puits. Il en résulte une x 10 6 cellules de Salmonella dans chaque puits et la multiplicité d&#39;infection (MOI) de 20: 1. </li><li> Centrifuger les plaques à 1000 x g dans un véhicule fermé pendant 10 min, puis remplacer les plaques (temps zéro) dans un 37 ° C, 5% CO 2 pendant 30 min. Pour chaque souche, mis en place au moins quatre puits en double. </li><li> Après 30 minutes, enlever les plaques de l&#39;incubateur et laver trois fois avec 200 pi de PBS 1x pour éliminer les bactéries non associés. </li><li> Après le lavage, sauf la plaque marqué par «association» pour un traitement ultérieur. Ajouter 200 ul de milieu DMEM contenant 100 pg / ml de gentamicine dans chaque puits des plaques marquées &quot;invasion&quot; et &quot;reproduction&quot; pour to tuer la bactérie Salmonella extracellulaire. Remettre les plaques à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant une heure supplémentaire. </li><li> Enregistrer un puits de chaque souche infectée pour enregistrer le nombre de cellules macrophages, traiter le reste des puits sur la &quot;association&quot; plaque avec 200 pi de PBS 1x contenant 1% de Triton X-100 pendant 10 min. La solution Triton lyser les cellules macrophages et libérer Salmonella associée. </li><li> Récolte Salmonella dans chaque puits et placez-les dans 1,5 ml tubes Eppendorf. Faites trois séries de dilutions 10 fois avec 900μl 1x PBS sur les échantillons récoltés de chaque puits, vortex est effectué entre chaque dilution. </li><li> Plaque de la troisième dilution, 10 -3, soit sur ​​des plaques de LB (WT) ou LB Kan (mutants). Étiqueter les plaques avec Salmonella nom approprié de souche, nombre de dilution, point de date et heure. </li><li> Après le troisième tube vortex de dilution, distribuer l&#39;échantillon de 10 ul sur la surface de la gélose et de répétition fnotre temps pour un total de 5 gouttes. Assurez-vous de l&#39;espace de cinq 10 pi coule uniformément sur ​​le plat des boîtes de Pétri 7. </li><li> Une fois que les gouttes tremper dans la gélose, les plaques tourner sur et incuber une nuit à 37 ° C, 5% CO 2 incubateur. </li><li> Traiter des puits enregistrés pour le comptage des macrophages avec 150 ul 1xPBS contenant 0,25% de trypsine-EDTA pendant 10 min. </li><li> Après traitement à la trypsine, place des macrophages dans 1,5 ml tubes Eppendorf et les traitent avec 50 ul de FBS pour neutraliser la solution de trypsine / EDTA, colorent les cellules avec 0,4% de bleu de Trypan et marquer leur grâce à l&#39;utilisation hématimètre. </li><li> Lorsque l&#39;incubation d&#39;une heure s&#39;est écoulée, enlever l &#39;&quot;invasion&quot; et &quot;plaques de réplication&quot; de l&#39;incubateur à CO 2, et lavez chaque puits comme «l&#39;étape 3.4&quot;. </li><li> Enregistrez le &quot;invasion&quot; plaque pour un traitement ultérieur comme &quot;l&#39;étape 3.6 à 3.12&quot;. </li><li> Ajouter 200 ul de milieu DMEM contenant 10 ug / ml de gentamicine àla plaque &quot;de réplication&quot; de maintenir un dégagement de Salmonella dans le milieu extracellulaire. Retour de la plaque à 37 ° C, 5% de CO 2 pendant une heure supplémentaire de 22,5. </li><li> Le lendemain, retirez la plaque &quot;de réplication&quot; à partir de 37 ° C, 5% de CO 2 incubateur, et lavez chaque puits comme «l&#39;étape 3.4&quot; et les traiter comme des «Etape 3.6 à 3.12&quot;. </li><li> Enfin, retirez les plaques de gélose après incubation pendant une nuit dans 37 ° C incubateur et marquer le nombre de colonies bactériennes. </li><li> Une bonne répartition de la colonie doit être comprise entre 10 et 100 colonies, chaque spot contient environ 2 à 20 colonies, il serait difficile de marquer si il y avait plus de 20 colonies sur un seul endroit. Si le nombre est trop faible ou trop élevé, Réensemencement l&#39;échantillon avec 10 dilutions supérieures ou inférieures selon les besoins. </li></ol> Analyse 4. données <ol><li> Calculer les (unités de formation de colonies CFU par ml) de chaque plaque sur la base du placagele volume et le facteur de dilution. </li><li> Déterminer le nombre de Salmonella par des macrophages par le nombre enregistré cellulaire de macrophages de chaque souche. </li><li> Calculer les moyennes géométriques de CFU par des macrophages d&#39;au moins trois expériences indépendantes pour association cellulaire, l&#39;invasion ou de la réplication, respectivement, et en outre à normaliser le WT à la valeur relative. </li><li> Analyser les données d&#39;association, l&#39;invasion et la réplication par t la -test de Student respectivement, en comparant chaque souche WT, et déterminer la signification statistique par la valeur p. </li></ol>

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	<li>Haraga, A., Ohlson, M. B., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonellae+interplay+with+host+cells.">Salmonellae interplay with host cells.</a> Nat Rev Microbiol. 6, 53-66 (2008).</li><li>Mandell, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+intraleukocytic+bacteria+and+antibiotics.">Interaction of intraleukocytic bacteria and antibiotics.</a> The Journal of clinical investigation. 52, 1673-1679 (1973).</li><li>Elsinghorst, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+invasion+by+gentamicin+resistance.">Measurement of invasion by gentamicin resistance.</a> Methods Enzymol. 236, 405-420 (1994).</li><li>Elsinghorst, E. A., Weitz, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+cell+invasion+and+adherence+directed+by+the+enterotoxigenic+Escherichia+coli+tib+locus+is+associated+with+a+104-kilodalton+outer+membrane+protein.">Epithelial cell invasion and adherence directed by the enterotoxigenic Escherichia coli tib locus is associated with a 104-kilodalton outer membrane protein.</a> Infect Immun. 62, 3463-3471 (1994).</li><li>Behlau, I., Miller, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+PhoP-repressed+gene+promotes+Salmonella+typhimurium+invasion+of+epithelial+cells.">A PhoP-repressed gene promotes Salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.</a> J Bacteriol. 175, 4475-4484 (1993).</li><li>Hueck, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+secreted+invasion+determinants+are+homologous+to+Shigella+Ipa+proteins.">Salmonella typhimurium secreted invasion determinants are homologous to Shigella Ipa proteins.</a> Mol Microbiol. 18, 479-490 (1995).</li><li>Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Infection+of+epithelial+cells+with+Salmonella+enterica.">Infection of epithelial cells with Salmonella enterica.</a> Methods Mol Biol. 431, 201-211 (2008).</li><li>Foster, J. W., Spector, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+Salmonella+survive+against+the+odds.">How Salmonella survive against the odds.</a> Annu Rev Microbiol. 49, 145-174 (1995).</li><li>Edwards, A. M., Massey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasion+of+human+cells+by+a+bacterial+pathogen.">Invasion of human cells by a bacterial pathogen.</a> Journal of visualized experiments JoVE. 10, (2011).</li><li>Molinari, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+played+by+the+group+A+streptococcal+negative+regulator+Nra+on+bacterial+interactions+with+epithelial+cells.">The role played by the group A streptococcal negative regulator Nra on bacterial interactions with epithelial cells.</a> Mol Microbiol. 40, 99-114 (2001).</li><li>Van der Velden, A. W., Lindgren, S. W., Worley, M. J., Heffron, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+pathogenicity+island+1-independent+induction+of+apoptosis+in+infected+macrophages+by+Salmonella+enterica+serotype+typhimurium.">Salmonella pathogenicity island 1-independent induction of apoptosis in infected macrophages by Salmonella enterica serotype typhimurium.</a> Infect Immun. 68, 5702-5709 (2000).</li><li>Santos, R. L., Zhang, S., Tsolis, R. M., Baumler, A. J., Adams, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphologic+and+molecular+characterization+of+Salmonella+typhimurium+infection+in+neonatal+calves.">Morphologic and molecular characterization of Salmonella typhimurium infection in neonatal calves.</a> Vet Pathol. 39, 200-215 (2002).</li><li>Lawhon, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+SPI-1+secreted+effectors+in+acute+bovine+response+to+Salmonella+enterica+Serovar+Typhimurium+a+systems+biology+analysis+approach.">Role of SPI-1 secreted effectors in acute bovine response to Salmonella enterica Serovar Typhimurium a systems biology analysis approach.</a> PLoS One. 6, e26869 (2011).</li><li>Drecktrah, D., Knodler, L. A., Galbraith, K., Steele-Mortimer, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Salmonella+SPI1+effector+SopB+stimulates+nitric+oxide+production+long+after+invasion.">The Salmonella SPI1 effector SopB stimulates nitric oxide production long after invasion.</a> Cell Microbiol. 7, 105-113 (2005).</li></ol>

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Le test de protection gentamicine est largement utilisée pour étudier l&#39;invasion et la réplication des bactéries pathogènes intracellulaires intérieur cellule hôte, et c&#39;est surtout un outil biologique important pour l&#39;étude des agents pathogènes, comme la salmonelle, dont l&#39;invasion est l&#39;étape préalable à l&#39;établissement infection 1. La protection dosage standard de gentamicine dans la communauté de recherche Salmonella est mis en œuvre dans 24 puits ...

Salmonella non typhoïdique, sont des causes importantes de maladies entériques dans tous les vertébrés. La salmonellose chez l&#39;homme est parmi les maladies d&#39;origine alimentaire bactériennes top 1. Caractérisation des mécanismes moléculaires qui sous-tendent les interactions de Salmonella avec leurs hôtes animaux se fait principalement à travers l&#39;étude de Salmonella enterica sérotype Typhimurium (STM) en culture de tissus et des modèles animaux d&#39;infection. Obtenir un aperçu des interactions hôtes-STM va nous aider à comprendre comment la bactérie Salmonella survivre et se développer à l&#39;intérieur des cellules hôtes. Le premier défi dans l&#39;étude de ces interactions est d&#39;identifier autant de facteurs participant que possible à la fois l&#39;hôte et l&#39;agent pathogène, mais ces efforts sont largement entravée par les difficultés importantes de faire face à deux systèmes biologiques complexes indépendants simultanément, c&#39;est-à-hôte et Salmonella, dans des conditions physiologiques. De plus, la grande repertoire de Salmonella et de gènes de l&#39;hôte facteurs impliqués dans les interactions hôte codant potentiellement nécessitent plate-forme biologique à haut débit pour relever ce défi. A, test normalisé modifié au phénotype association de Salmonella, l&#39;invasion et la réplication dans les macrophages avec une grande capacité de débit a été développé pour examiner un grand nombre de gènes susceptibles d&#39;engagement dans les interactions Salmonella de. Le test de protection de gentamicine a été développé en 1973 2, mais a d&#39;abord été décrit en détail par Elsinghorst 3,4 à 1994. Il est maintenant devenu un outil standard pour l&#39;étude de nombreuses bactéries pathogènes intracellulaires ex vivo, y compris Salmonella 5,6. Bactéries internalisées éviter d&#39;être tués par des antibiotiques tels que la gentamicine, qui ne peuvent pas pénétrer les cellules eucaryotes 3. En tirant parti de ce phénomène, l&#39;essai de protection gentamicine mesure la survie et la croissance de ba intracellulairepathogènes cterial. Trois événements au cours de l&#39;infection, c&#39;est à dire, d&#39;une association avec les cellules eucaryotes, l&#39;invasion et la replication, peuvent être évalués pour les bactéries pathogènes intracellulaires en fonction de l&#39;intervalle de temps entre l&#39;infection, le traitement de gentamicine, et une nouvelle incubation (Figure 1). Lignées de cellules eucaryotes offrent un environnement physiologique qui est moins complexe que les modèles animaux pertinents pour les études d&#39;interaction hôte-pathogène. Le test de protection gentamicine est une plate-forme appropriée pour étudier les interactions STM-hôtes, mais le dosage standard dans une boîte de culture de 24 puits a une capacité faible débit. Analyse informatique des ensembles de données in vivo identifié 149 produits de gènes de Salmonella qui sont prévus pour interagir avec environ 300 produits de gènes de l&#39;hôte (données non publiées). Le dosage standard de protection gentamicine n&#39;a pas la capacité de ce phénotype nombre de mutants de manière efficace. Dans suppion, l&#39;essai de protection de gentamicine peut théoriquement détecter l&#39;invasion d&#39;un seul bactérie. En raison de cette sensibilité inhérente, les données brutes sont sensibles à des variations lors de techniques répété à des moments différents. Les contrôles internes et rapport de présentation des données après normalisation sont indispensables pour l&#39;interprétation des résultats soit valable. Compte tenu de ces considérations, un test de protection gentamicine normalisé modifié a été développé pour améliorer la capacité de contrôle et d&#39;augmenter la précision. Le protocole suivant est détaillée et illustrée pour effectuer le test de protection à la gentamicine modifié en utilisant des boîtes de culture à 96 puits et la lignée cellulaire de macrophages murins RAW264.7 d&#39;. Par rapport au protocole standard dans des boîtes de culture de 24 puits, le protocole modifié présente les avantages suivants: 1) À l&#39;aide des boîtes de culture de 96 puits permet jusqu&#39;à 10 souches mutantes différentes à phénotypées y compris les contrôles positifs et négatifs internes avec une puissance statistique suffisante;2) La différence de résultats est considérablement réduit, car les mutants sont testés dans la même boîte de culture et, en même temps; 3) L&#39;utilisation de pipettes multicanaux augmente le débit tout en réduisant la fatigue de l&#39;opérateur. Enfin, la comparaison des boîtes de culture de 24 puits, les préoccupations de moins de cellules hôtes par puits dans 96 puits boîte de culture ont été abordées grâce à l&#39;optimisation du protocole et de la normalisation. En résumé, la modification, essai normalisée pour in vitro Salmonella phénotype ou autre association bactérienne, l&#39;invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires augmente la précision et réalise capacité à haut débit tout en réduisant la fatigue de l&#39;opérateur.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:173px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11965</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:173px;">HyClone</td>
			<td style="width:173px;">SH30910.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">T-75 cell culture flask vented filter cap</td>
			<td style="width:173px;">Nest Biotechnology</td>
			<td style="width:173px;">708003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">100X Non-Essential Amino Acids</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Cell scraper</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">353086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">96-well cell culture plate</td>
			<td style="width:173px;">Corning Incorporated</td>
			<td style="width:173px;">3595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">Luria-Bertani (LB) broth</td>
			<td style="width:173px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:173px;">3002-075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:173px;">14 mL Polypropylene Round-Bottom Tube</td>
			<td style="width:173px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:173px;">352059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">PBS pH7.4 (1x)</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">10010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T-8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Kanamycin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">K0254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Gentamicin solution</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">G1272</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:173px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:173px;">25200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:173px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:173px;">Sigma</td>
			<td style="width:173px;">T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

high-throughput assay to phenotype salmonella enterica typhimurium association, invasion, and replication in macrophages

espèces de Salmonella sont des agents pathogènes zoonotiques et principales causes de maladies d&#39;origine alimentaire chez les humains et le bétail 1. La compréhension des mécanismes sous-jacents aux interactions Salmonella de sont importants pour élucider la pathogenèse moléculaire des infections à Salmonella. Le dosage de la protection de gentamicine au phénotype association de Salmonella, l&#39;invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires a été adapté pour permettre le criblage à haut débit de définir les rôles des mutants de délétion de Salmonella enterica sérotype Typhimurium dans les interactions hôte à l&#39;aide de RAW 264.7 macrophages murins. Dans ce protocole, la variance dans la mesure est considérablement réduite par rapport au protocole standard, parce que de type sauvage et des souches mutantes multiples peuvent être testés dans la même boîte de culture et dans le même temps. L&#39;utilisation de pipettes multicanaux augmente le débit et améliore la précision. En outre, les préoccupations liées à l&#39;utilisation de moins host cellules par puits dans 96 puits boîte de culture ont été abordés. Ici, le protocole de l&#39;essai in vitro Salmonella modifié d&#39;invasion en utilisant des cellules phagocytaires a été employée avec succès à phénotype 38 mutants individuels Salmonella de suppression d&#39;association, l&#39;invasion et la réplication intracellulaire. Les phénotypes in vitro sont présentées, dont certaines ont été confirmés par la suite avoir des phénotypes in vivo dans un modèle animal. Ainsi, l&#39;, test normalisé modifié au phénotype Salmonella association, l&#39;invasion et la réplication dans les macrophages avec une grande capacité de débit pourrait être utilisé plus largement pour étudier les interactions bactéries-hôtes.

Afficher les résultats représentatifs (figure 2) après que les données sont tracées sur la base de l&#39;analyse de l&#39;invasion des cellules phagocytaires modifié. Les données comprennent les cinq souches différentes, WT, ΔinvA, ΔphoP, mutant A, et B. mutant Δ Inva, connu pour être défectueux pour l&#39;invasion, et ΔphoP connus pour être défectueux pour la réplication 8, sont utilisés comme témoins positifs pour évaluer la validité expérime...

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High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Une analyse à haut débit de Salmonella in vitro du phénotype bactérien ou autre association, l&#39;invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires avec une grande capacité de débit a été développé. La méthode a été utilisée pour évaluer Salmonella gène knock-out souches mutantes pour leur implication dans les interactions hôte-pathogène.

À haut débit de dosage de phénotype<em&gt; Salmonella enterica</em&gt; Association Typhimurium, Invasion, et la réplication dans les macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

high-throughput-assay-to-phenotype-salmonella-enterica-typhimurium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

12.5K vues.  Texas A&M University.  Une analyse à haut débit de Salmonella in vitro du phénotype bactérien ou autre association, l'invasion et la réplication dans les cellules phagocytaires avec une grande capacité de débit a été développé. La méthode a été utilisée pour évaluer Salmonella gène knock-out souches mutantes pour leur implication dans les interactions hôte-pathogène. 

Vidéo: High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus. However, there are two species, six subspecies, and over 2,500 different Salmonella serovars, and not all are equal in their significance to public health. For example, finding S. enterica subspecies IIIa Arizona on a table egg layer farm is insignificant compared to the isolation of S. enterica subspecies I serovar Enteritidis, the leading cause of salmonellosis linked to the consumption of table eggs. Serovars are identified based on antigenic differences in lipopolysaccharide (LPS)(O antigen) and flagellin (H1 and H2 antigens). These antigenic differences are the outward appearance of the diversity of genes and gene alleles associated with this phenotype.
We have developed an allelotyping, multiplex PCR that keys on genetic differences between four major S. enterica subspecies I serovars found in poultry and associated with significant human disease in the US. The PCR primer pairs were targeted to key genes or sequences unique to a specific Salmonella serovar and designed to produce an amplicon with size specific for that gene or allele. Salmonella serovar is assigned to an isolate based on the combination of PCR test results for specific LPS and flagellin gene alleles. The multiplex PCRs described in this article are specific for the detection of S. enterica subspecies I serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium.
Here we demonstrate how to use the multiplex PCRs to identify serovar for a Salmonella isolate.

An Allelotyping PCR for Identifying Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium

We describe a multiplex PCR for the rapid detection of Salmonella enterica serovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg, and Typhimurium. Specific Salmonella serovars can be identified by targeting a multiplex PCR to genes and sequences unique to the O-antigen biosynthesis cluster and flagellin of a given serovar. Serovar is assigned then to a Salmonella isolate based on the appearance of specific, size amplicons (PCR product) corresponding to the target allele.

Une PCR pour l&#39;identification allélotypage Salmonella enterica Sérovars Enteritidis, Hadar, Heidelberg et Typhimurium

Current commercial PCRs tests for identifying Salmonella target genes unique to this genus.  However, there are two species, six subspecies, and over ...

Recherche

Immunologie et infection

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Cancer immunotherapy can harness the specificity of immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT) based on the adoptive transfer of T cells genetically modified to express a chimeric antigen receptor (CAR) has shown considerable promise in clinical trials1-4. There are several advantages to using CAR+ T cells for the treatment of cancers including the ability to target non-MHC restricted antigens and to functionalize the T cells for optimal survival, homing and persistence within the host; and finally to induce apoptosis of CAR+ T cells in the event of host toxicity5.
Delineating the optimal functions of CAR+ T cells associated with clinical benefit is essential for designing the next generation of clinical trials. Recent advances in live animal imaging like multiphoton microscopy have revolutionized the study of immune cell function in vivo6,7. While these studies have advanced our understanding of T-cell functions in vivo, T-cell based ACT in clinical trials requires the need to link molecular and functional features of T-cell preparations pre-infusion with clinical efficacy post-infusion, by utilizing in vitro assays monitoring T-cell functions like, cytotoxicity and cytokine secretion. Standard flow-cytometry based assays have been developed that determine the overall functioning of populations of T cells at the single-cell level but these are not suitable for monitoring conjugate formation and lifetimes or the ability of the same cell to kill multiple targets8.
Microfabricated arrays designed in biocompatible polymers like polydimethylsiloxane (PDMS) are a particularly attractive method to spatially confine effectors and targets in small volumes9. In combination with automated time-lapse fluorescence microscopy, thousands of effector-target interactions can be monitored simultaneously by imaging individual wells of a nanowell array. We present here a high-throughput methodology for monitoring T-cell mediated cytotoxicity at the single-cell level that can be broadly applied to studying the cytolytic functionality of T cells.

We describe a single-cell high-throughput assay to measure cytotoxicity of T cells when incubated with tumor target cells. This method employs a dense, elastomeric array of sub-nanoliter wells (~100,000 wells/array) to spatially confine the T cells and target cells at defined ratios and is coupled to fluorescence microscopy to monitor effector-target conjugation and subsequent apoptosis.

Quantitative à haut débit Test de cytotoxicité cellulaire unique pour les cellules T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense against gram-negative bacterium Salmonella typhimurium. Salmonella establishes persistent infection in the intestine of C. elegans and results in early death of infected animals. A number of immunity mechanisms have been identified in C. elegans to defend against Salmonella infections. Autophagy, an evolutionarily conserved lysosomal degradation pathway, has been shown to limit the Salmonella replication in C. elegans and in mammals. Here, a protocol is described to infect C. elegans with Salmonella typhimurium, in which the worms are exposed to Salmonella for a limited time, similar to Salmonella infection in humans. Salmonella infection significantly shortens the lifespan of C. elegans. Using the essential autophagy gene bec-1 as an example, we combined this infection method with C. elegans RNAi feeding approach and showed this protocol can be used to examine the function of C. elegans host genes in defense against Salmonella infection. Since C. elegans whole genome RNAi libraries are available, this protocol makes it possible to comprehensively screen for C. elegans genes that protect against Salmonella and other intestinal pathogens using genome-wide RNAi libraries.

A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium

C. elegans has emerged as a new genetic model to study host-pathogen interactions. Here we describe a protocol to infect C. elegans with Salmonella typhimurium coupled with the double-strand RNAi interference technique to examine the role of host genes in defense against Salmonella infection.

Un protocole d&#39;infecter<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Avec<em&gt; Salmonella typhimurium</em

In the last decade, C. elegans has emerged as an invertebrate organism to study interactions between hosts and pathogens, including the host defense ...

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like Shigella flexneri and Francisella novicida need to induce the rupture of the phagosome. In contrast, Salmonella typhimurium replicates in a vacuolar compartment, known as Salmonella-containing vacuole (SCV). However certain mutants of Salmonella fail to maintain SCV integrity and are thus released into the cytosol. The percentage of cytosolic vs. vacuolar bacteria on the level of single bacteria can be measured by differential permeabilization, also known as phagosome-protection assay. The approach makes use of the property of detergent digitonin to selectively bind cholesterol. Since the plasma membrane contains more cholesterol than other cellular membranes, digitonin can be used to selectively permeabilize the plasma membrane while leaving intracellular membranes intact. In brief, following infection with the pathogen expressing a fluorescent marker protein (e.g. mCherry among others), the plasma membrane of host cells is permeabilized with a short incubation in digitonin containing buffer. Cells are then washed and incubated with a primary antibody (coupled to a fluorophore of choice) directed against the bacterium of choice (e.g. anti-Salmonella-FITC) and washed again. If unmarked bacteria are used, an additional step can be done, in which all membranes are permeabilized and all bacteria stained with a corresponding antibody. Following the staining, the percentage of vacuolar and cytosolic bacteria can be quantified by FACS or microscopy by counting single or double-positive events. Here we provide experimental details for use of this technique with the bacterium Salmonella typhimurium. The advantage of this assay is that, in contrast to other assay, it provides a quantification on the level of single bacteria, and if analyzed by microscopy provides the exact number of cytosolic and vacuolar bacteria in a given cell.

Quantification of Cytosolic vs. Vacuolar Salmonella in Primary Macrophages by Differential Permeabilization

We describe the quantification of cytosolic and vacuolar Salmonella typhimurium in bone-marrow derived macrophages using differential digitonin permeabilization.

Quantification des cytosolique vs Vacuolar<em&gt; Salmonella</em&gt; Dans les macrophages primaires par différentiel Perméabilisation

Intracellular bacterial pathogens can replicate in the cytosol or in specialized pathogen-containing vacuoles (PCVs). To reach the cytosol, bacteria like ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins can give insights into their function by determining their localization within the cell and enabling interaction partner identification. We recently published a fast and scalable method to generate Trypanosoma brucei cell lines that express a tagged protein from the endogenous locus. The method was based on a plasmid we generated that, when coupled with long primer PCR, can be used to modify a gene to encode a protein tagged at either terminus. This allows the tagging of dozens of trypanosome proteins in parallel, facilitating the large-scale validation of candidate genes of interest. This system can be used to tag proteins for localization (using a fluorescent protein, epitope tag or electron microscopy tag) or biochemistry (using tags for purification, such as the TAP (tandem affinity purification) tag). Here, we describe a protocol to perform the long primer PCR and the electroporation in 96-well plates, with the recovery and selection of transgenic trypanosomes occurring in 24-well plates. With this workflow, hundreds of proteins can be tagged in parallel; this is an order of magnitude improvement to our previous protocol and genome scale tagging is now possible.

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

Addition of a tag to a protein is a powerful way of gaining insight into its function. Here, we describe a protocol to endogenously tag hundreds of Trypanosoma brucei proteins in parallel such that genome scale tagging is achievable.

Haut-débit Gene Tagging dans<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or cellular processes. With the advancement of biotechnologies and the high translational potential of small molecules, a number of innovative approaches in drug discovery have evolved, which explains the resurgent interest in the use of HTS. The oncology field is currently the most active research area for drug screening, with no major breakthrough made for the identification of new immunomodulatory compounds targeting transplantation-related complications or autoimmune ailments. Here, we present a novel in vitro murine fluorescent-based lymphocyte assay easily adapted for the identification of new immunomodulatory compounds. This assay uses T or B cells derived from a transgenic mouse, in which the Nur77 promoter drives GFP expression upon T- or B-cell receptor stimulation. As the GFP intensity reflects the activation/transcriptional activity of the target cell, our assay defines a novel tool to study the effect of given compound(s) on cellular/biological responses. For instance, a primary screening was performed using 4,398 compounds in the absence of a &#34;target hypothesis&#34;, which led to the identification of 160 potential hits displaying immunomodulatory activities. Thus, the use of this assay is suitable for drug discovery programs exploring large chemical libraries prior to further in vitro/in vivo validation studies.

We present in the current study a novel fluorescence-based assay using lymphocytes derived from a transgenic mouse. This assay is suitable for high-throughput screening (HTS) of small molecules endowed with the capacity of either inhibiting or promoting lymphocyte activation.

A base Fluorescence-lymphocytaire Assay Convient pour Criblage à haut débit des petites molécules

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Un haut-débit Assay Compatible pour évaluer l&#39;efficacité des médicaments contre Macrophage repiquées<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. typhimurium bacteria are quickly detected and phagocytized by macrophages, and contained in vesicles known as phagosomes in order to be degraded. Isolation of S. typhimurium-containing phagosomes have been widely used to study how S. typhimurium infection alters the process of phagosome maturation to prevent bacterial degradation. Classically, the isolation of bacteria-containing phagosomes has been performed by sucrose gradient centrifugation. However, this process is time-consuming, and requires specialized equipment and a certain degree of dexterity. Described here is a simple and quick method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin-streptavidin-conjugated magnetic beads. Phagosomes obtained by this method can be suspended in any buffer of choice, allowing the utilization of isolated phagosomes for a broad range of assays, such as protein, metabolite, and lipid analysis. In summary, this method for the isolation of S. typhimurium-containing phagosomes is specific, efficient, rapid, requires minimum equipment, and is more versatile than the classical method of isolation by sucrose gradient-ultracentrifugation.

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

We describe here a simple and quick method for the isolation of Salmonella typhimurium-containing phagosomes from macrophages by coating the bacteria with biotin and streptavidin.

Isolement de Salmonella typhimurium-contenant des Phagosomes des Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

A High-throughput Assay to Assess and Quantify Neutrophil Extracellular Trap Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. NETs have been demonstrated to serve as an important host defense mechanism that traps and kills microorganisms. On the other hand, they have been implicated in diverse systemic autoimmune diseases. NETs are immunogenic and toxic structures that contain a pool of relevant autoantigens including anti-neutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) and systemic lupus erythematosus (SLE). Different forms of NETs can be induced depending on the stimulus. The amount of NETs can be quantified using different techniques including measuring DNA release in supernatants, measuring DNA-complexed with NET-molecules like myeloperoxidase (MPO) or neutrophil elastase (NE), measuring the presence of citrullinated histones by fluorescence microscopy, or flow cytometric detection of NET-components which all have different features regarding their specificity, sensitivity, objectivity, and quantity. Here is a protocol to quantify ex vivo NET formation in a highly-sensitive, high-throughput manner by using three-dimensional immunofluorescence confocal microscopy. This protocol can be applied to address various research questions about NET formation and degradation in health and disease.

This protocol describes a highly sensitive and high throughput neutrophil extracellular trap (NET) assay for the semi-automated quantification of ex vivo NET formation by immunofluorescence three-dimensional confocal microscopy. This protocol can be used to evaluate NET formation and degradation after different stimuli and can be used to study potential NET-targeted therapies.

Un test haut débit pour évaluer et quantifier les neutrophiles piège extracellulaire Formation

Neutrophil extracellular traps (NETs) are immunogenic extracellular DNA structures that can be released by neutrophils upon a wide variety of triggers. ...