Nous tenons à remercier le Dr Paul Weigel à l&#39;Univ. de l&#39;Oklahoma pour l&#39;utilisation de l&#39;anticorps monoclonal 30 pour la détection du récepteur HARE/Stabilin-2 et Janet Weigel pour son aide technique. Cette recherche est financée par des fonds de recherche de l&#39;Université du Nebraska.

1. L&#39;excision du foie (adoptée par BP Seglen 12 et R. 13 Blomhoff avec des modifications 14,15) <ol><li> Ajouter 10 ml 30% d&#39;isoflurane dans le polyéthylène glycol à une boîte de Pétri dans une chambre de 5,5 L fermés. Il est optimal d&#39;attendre 10-15 minutes après l&#39;addition de l&#39;isoflurane à créer une atmosphère stabilisée dans la chambre. </li><li> Placer un rat dans la chambre étanche et lui permettre de devenir anesthésiés. Plein effet de l&#39;anesthésie sont apparentes lorsque l&#39;animal devient mou, insensible, et expose la respiration profonde. </li><li> Placer 2 mL d&#39;isoflurane dans le polyéthylène glycol dans certains des boules de coton au fond d&#39;un tube de la seringue 30 ml. </li><li> Placez le rat sur le dos sur un plateau recouvert de couches et placer le tube seringue sur le museau. </li><li> Confirmer immédiatement une anesthésie profonde en mouillant l&#39;abdomen avec de l&#39;éthanol à 70%. Ne pas laisser l&#39;animal mourir par overdose isoflurane. </li><li> Avec des ciseaux et des pinces à pansement, exposer l&#39;ensemble de abdcavité ominal. </li><li> Localisez la veine porte et, en utilisant une pince, tirer deux fils de soie ou de fil de polyester chirurgicale (ligature) sous la veine porte immédiatement au-dessus de la branche mésentérique. </li><li> Retirer les pinces et faites un nœud simple en vrac. </li><li> En utilisant des pinces sous la veine porte et en tirant doucement en arrière pour redresser la veine, cathétériser la veine avec un cathéter Autoguard Insyte (18 GA, 1,3 x 300 mm, BD Biosciences) cathéter ou similaire. Le cathéter doit aller au-delà de quelques mm de la boucle formée par le fil. </li><li> Rétracter et retirer l&#39;aiguille en relâchant le déclencheur à ressort sur le cathéter. Le sang doit commencer à s&#39;infiltrer dans le cathéter jusqu&#39;à indiquant le placement de ligature correcte. </li><li> Serrer l&#39;nœud simple et sécurisé avec un autre nœud simple. </li><li> Sever soit la veine cave inférieure ou de l&#39;aorte descendante (aorte abdominale) pour permettre au sang de s&#39;écouler dans le système circulatoire. </li><li> Commencez rinçage du foie avec oxygénéesSCT à 37 ° C pour éliminer le sang (blanchiment) à un débit de 20 ml / min. Le foie doit tourner à partir d&#39;un violet rougeâtre à une couleur argile. </li><li> Alors que le foie est le rinçage, le foie d&#39;accise en coupant le tube digestif et du tissu conjonctif. Il est important de ne pas lacérer le foie ou la perforation de la capsule de Glisson. </li><li> Placez le foie sur un filet de plastique sur un entonnoir qui permet tampons d&#39;être collectée et recyclée. Tampons à ce point ne devrait pas être remis en circulation, mais le débit dans le bécher de déchets. Flushing ne devrait pas durer plus de 10 min. (Figure 2A). Préparer la solution endocytose requises au point 2.1 étape. </li></ol> 2. Internalisation de 125 I-SA-b-Hep (ou un autre ligand adapté et étiqueté) <ol><li> Pour 50 ml de RPMI des médias dans un petit bécher, ajouter à une concentration finale de BSA 0,05% et 0,01 mCi 125 I-SA-b-Hep ou un autre ligand convenablement étiqueté pour l&#39;endocytose. </li><li> Fixez ce bécher à l&#39;apparatus pour permettre l&#39;oxygénation. </li><li> Eteignez la pompe, passer la tubulure d&#39;entrée, puis tourner sur la pompe à 20 ml / min. </li><li> Comme le RPMI étiquetés s&#39;approche du foie, éteindre la pompe et permettre excès de liquide dans l&#39;entonnoir et vidange tube. </li><li> Placez le tuyau de vidange dans le bécher médias pour permettre la recirculation des supports étiquetés, puis redémarrer la pompe. </li><li> Laisser faire recirculer les fluides à travers le foie pour pas plus de 1 heure. </li><li> Pendant cette étape d&#39;internalisation, assurez-vous que la température dans le foie est stable en le couvrant et préparer la collagénase pour la digestion. </li></ol> 3. Digestion du foie par digestion à la collagénase <ol><li> Fraîchement dissous et filtrés (0,45 um) collagénase (100 rats de poids mg / kg) doit être ajouté au tampon 2 dans un volume total ne doit pas dépasser 60 ml à 37 ° C. Le volume dépend de la longueur / volume intérieur du tube et doit être ajustée en conséquence. </li><li> Arrêter la pompe et d&#39;échanger lestuyauterie d&#39;entrée du bécher médias à la SCT. </li><li> Rincez le foie pendant 2 min à 50 mL / min ce qui permet de desserrer des jonctions cellulaires desmosomales qui sont dépendante du calcium. </li><li> Alors que le foie est le rinçage, l&#39;échange le bécher les médias avec le gobelet contenant de la collagénase sur l&#39;appareil. </li><li> Immédiatement après le rinçage, commencer la digestion par la collagénase dans une boucle de circulation à un débit de 20 ml / min jusqu&#39;à 15 min. Depuis lots varient collagénase par numéro de lot, les variations dans la quantité et l&#39;heure de la digestion doivent être optimisés pour chaque nouveau lot de collagénase. La collagénase est également dépendante du calcium. Eteignez la pompe et l&#39;interrupteur de la mémoire tampon et les lignes de gaz de ballon A à B. Flacon de transfert des effluents de la ligne à partir du conteneur des déchets dans le ballon B (fig. 2B). </li><li> Arrêter la pompe, retirer le cathéter et le transfert du foie dans un plat contenant 20-30 ml de tampon 1. </li><li> Peler l&#39;Glisson capsule du foie et secouer la cellules dans le liquide. </li><li> Comme le liquide devient opaque avec du matériel cellulaire, transfert des cellules à travers un maillage de 100 um suivi d&#39;une filtration à travers une maille 30 um et ensuite dans une forme conique de 50 mL sur la glace. </li><li> Ajouter plus de tampon 1 pour le foie et continuer secouant les cellules de la matrice du foie, le transfert du liquide vers le filtre maille et conique. </li><li> Répétez les étapes 3.7 à 3.9 jusqu&#39;à ce qu&#39;il n&#39;y plus de cellules peuvent être délogés avec agitation raisonnable du foie. </li></ol> 4. Purification de l&#39;hépatocyte et SEC <ol><li> Centrifuger les 50 ml contenant des cellules Coniques à 150 xg pendant 3 min. pour culotter les hépatocytes. </li><li> Transfert de la fraction liquide contenant des cellules non parenchymateuses au frais 50 ml Coniques sur la glace. </li><li> Laver les hépatocytes se remettre en suspension le culot dans un tampon de 3 et répéter les étapes 4.1 et 4.2 plus de trois fois. </li><li> A la fin des lavages, les pastilles sont ≥ 97% des hépatocytes pur. Pour obtenir le SECS, centrifugeuse de tous les tubes contenant commun surnageant (contenant les CSH, secs, et KCS et quelques petits hépatocytes) à 200 xg pendant 10 min. à 4 ° C. </li><li> Aspirer le tampon et la suspension de toutes les boulettes dans 5 ml de RPMI / BSA à 4 ° C. </li><li> Piscine les cellules ensemble dans deux tubes et ajouter RPMI / BSA jusqu&#39;à un volume de 35 ml. </li><li> Centrifuger les Coniques à 100 xg pendant 3 min. </li><li> Recueillir les 25 premiers ml de liquide et le transfert à un nettoyage conique de 50 mL. </li><li> Reprendre le culot dans les 10 autres supports mL et ajouter 25 ml de retour du froid RPMI / BSA et centrifuger à 100 xg pendant 3 min. </li><li> Répétez les étapes 3,8 et 3,9 fois de plus, jetez le culot cellulaire et inférieure 10 ml de milieu. </li><li> Centrifuger les surnageants à granulés SECS, KCS, et de CSH à 200 xg pendant 10 min. à 4 ° C. </li><li> Préparer trois tubes de 50 ml contenant 20 ml de Percoll 25% dans le PBS sur la glace. Sous-couche avec 15 ml de Percoll 50% dans chaque tube. </li><li> Resuspendre les culots cellulaires dans un volume total de 30 mL de RPMI / BSA. </li><li> Soigneusement superposition each gradient avec 10 ml de cellules et centrifuger à 900 xg pendant 20 min à 4 ° C. </li><li> Secondes et KCs ont très proche des densités porteur et sont à l&#39;interface 25/50%. CSH sont généralement à 25% / media Interface en raison de leur plus grande flottabilité que les cellules lipidiques stockage. Toute hépatocytes restants et les cellules sanguines ont la plus faible et flottabilités sont culottées. Aspirer de haut en bas près de l&#39;interface de 25/50% et jeter ce matériel. </li><li> Collecter les cellules dans l&#39;interface de 25/50% et le transfert d&#39;une forme conique à froid fraîche avec du RPMI. Le volume final doit être ~ 40 ml à diluer le Percoll. </li><li> Centrifuger les coniques à 350 xg pendant 10 min à 4 ° C pour culotter les cellules. </li><li> Resuspendre les cellules dans ~ 10 ml pré-chauffé RPMI contenant 100 U / ml Penicillin/100 g / mL cellules streptomycine et placer dans un plat en verre lavé à l&#39;acide de Pétri ou Cristallisoir. </li><li> Incuber les cellules pendant 15 min. à 37 ° C dans un incubateur de culture tissulaire. </li><li> Rock ou tourbillon de la plaque un peu pluspuis recueillir les SECs dans le surnageant. Le KCS adhérer au verre beaucoup plus rapidement que SECS. Alternativement, le SEC peut être séparé de KCs par immunopurification utilisant des anticorps anti-CD31 ou anti-Stabilin2/HARE conjugués à des billes magnétiques. </li><li> Numéros de la viabilité et la cellule peut être évaluée par exclusion du bleu trypan utilisant un hématimètre ou avec l&#39;aide d&#39;un compteur de cellules automatisé. </li><li> Culture de la fibronectine secondes sur enduit de plats en plastique à 37 ° C, 5% de CO 2, BSA RPMI/0.25% avec 40 ng / ml de VEGF, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine ou avec des hépatocytes milieux conditionnés. </li><li> Hépatocytes, KCS, et secondes peuvent être évaluer pour l&#39;internalisation des contenus labellisés par l&#39;utilisation d&#39;un compteur gamma et la normalisation de la protéine cellulaire totale ou par microscopie (si marqué par fluorescence) en utilisant ces méthodes de culture. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs: Purification de l&#39;hépatocyte est ≥ 97% et la purification SEC est Typicallié de ≥ 95% en utilisant cette méthode. Excision de la cavité abdominale, la canulation de la veine porte, et le blanchiment du foie devraient tous se produisent au sein d&#39;une minute pour obtenir les meilleurs résultats. HARE/Stabilin-2 est un récepteur spécifique sur SECs foie et n&#39;est pas exprimée dans d&#39;autres types de cellules du foie. Dans cet échantillon, les lysats cellulaires des deux hépatocytes et secondes ont été séparés par 5% de SDS-PAGE et sondé avec un anticorps monoclonal dirigé contre les deux isoformes de Stabilin-2 (Fig. 3). L&#39;héparine non fractionnée injectée dans le sang est éliminé par le foie 16. La clairance est principalement réalisée par le foie SECs contrairement aux hépatocytes et KCS 17. Le récepteur est le récepteur Stabilin-2/HARE dédouanement principale qui lie l&#39;héparine et internalise en s 18. Dans notre exemple, nous avons étiqueté héparine avec une étiquette biotine sur le groupe carboxylate de GlcNAc / NS. La biotine a été conjugué à de la streptavidine iodés pour la détection de prot héparine intérioriséeoglycan. L&#39;injection de l&#39;héparine étiquetés suivie par exsanguination 30 minutes après l&#39;injection nous permet de contrôler quels organes intérioriser cette forme d&#39;héparine. Dans ce court intervalle de temps, le foie est l&#39;organe dégagement primaire (Fig. 4). Pour mieux comprendre quel type de cellule est responsable du dédouanement, nous avons ajouté 125 I-SA-b-Hep aux médias RPMI supplémenté avec 0,05% de BSA et lui a permis de circuler à travers le foie pendant 20 min. Après digestion par la collagénase et la purification cellulaire, la grande majorité de l&#39;héparine marquée est intériorisée par sec en contraste avec les hépatocytes (Fig. 5). <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Figure 1. Architecture du foie de base. SECs forment les parois des sinusoïdes et sont normalement fenêtrée (petits amas de cercles). Cellules étoilées (CSH) sont trouvés dans l&#39;espace de Disse, contrairement à c Kupfferaunes (KCS) qui sont normalement présents dans la microvascularisation des sinusoïdes. Hépatocytes occuper l&#39;autre côté de l&#39;espace de Disse. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Figure 2. Schéma de l&#39;appareil de perfusion. A) Mise en place d&#39;un appareil lors de la vidange / lavage des sinusoïdes du foie. SCT est dans un flacon de 1 litre. B) Un flacon 125 ml contenant environ 60 ml de tampon 2 avec de la collagénase est utilisée pour la digestion du foie dans un circuit fermé. La ligne de l&#39;effluent est également modifiée dans le conteneur de déchets à travers un flacon B entaille dans le bouchon en caoutchouc. La ligne de l&#39;oxygène n&#39;est pas immergé dans le tampon contenant de la collagénase (flacon B) pour éviter la mousse. Les bouchons sur chaque ballon est entaillée pour permettre un transfert efficace de la ligne d&#39;effluents et d&#39;éviter une pression accrue de l&#39;oxygène gazeux. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. </sTrong préparations&gt; hépatocytes sont pas contaminés par la SEC. Des quantités égales de lysats de cellules purifiées à partir de lots d&#39;hépatocytes (voie 1) et secs (piste 2) ont été séparés par 5% de SDS-PAGE et transférées sur nitrocellulose. Anticorps monoclonal # 30 qui est spécifique contre les deux isoformes (315 kDa et 190 kDa) de HARE/Stabilin-2 été utilisé pour sonder les lysats. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Distribution de l&#39;héparine étiquetés dans les organes. Les rats ont été injectés dans la veine latérale de la queue avec 125 I-SA-b-hépatite attendre 30 minutes, puis saigné. Sang a été prélevé afin de ne pas donner un quelconque des organes artificiellement lectures élevé. Coups par minute (CPM) de chaque organe ont été normalisées par rapport au poids de l&#39;organe en grammes. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. Montant de l&#39;héparine étiquetés dans les hépatocytes et SEC. RPMJ&#39;ai supports contenant 125 I-SA-b-Hep a été autorisé à circuler à travers un foie intact pendant 20 minutes suivie par digestion à la collagénase et la purification cellulaire. Des quantités égales de lysats hépatocytes et SEC protéine cellulaire ont été quantifiés par le dosage de Bradford et comptées par un compteur gamma. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Cellules de Kupffer sont séparés de SECs par adhérence sur le verre. Les cellules ont été placés dans un plat en verre lavé à l&#39;acide cristallisant et autorisés à adhérer pendant 15 min à 37 ° C, 5% de CO 2. Le surnageant contenant non respectées cellules a été doucement agité et placé dans un tube à centrifuger. Lysats de cellules à la fois collé sur le verre (voie 1) et de la non-respectées cellules (piste 2) ont été séparés par 8% de SDS-PAGE, effacé, et sondé avec un anticorps contre CD163 qui est spécifique des cellules de Kupffer. <img src="/files/ftp_upload/3138/3138fig7.jpg" alt="Figure 7"/> SECs Figure 7. Plaqué sur plastique recouvert de fibronectine à 6 puits boîtes ont été incubées pendant la nuit dans RPMI supplémenté avec 0,1% de BSA. Des images à contraste de phase ont été prises à (A) 100x et (B) 200x de grossissement.

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Commun. 218, 314-319 (1996).</li><li>Duryee, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipopolysaccharide+is+a+cofactor+for+malondialdehyde-acetaldehyde+adduct-mediated+cytokine/chemokine+release+by+rat+sinusoidal+liver+endothelial+and+Kupffer+cells.">Lipopolysaccharide is a cofactor for malondialdehyde-acetaldehyde adduct-mediated cytokine/chemokine release by rat sinusoidal liver endothelial and Kupffer cells.</a> Alcohol Clin. Exp. Res. 28, 1931-1938 (2004).</li></ol>

Pas de conflits d&#39;intérêt déclarés.

Anesthésie du rat par la méthode de goutte pendante dans laquelle la vapeur d&#39;isoflurane induit inconscience est la méthode préférée pour nos études. Un vaporisateur peut aussi être utilisé à la place d&#39;une seringue avec du coton pour maintenir l&#39;animal en dehors de la chambre, mais les interventions chirurgicales sont si rapides, il n&#39;est pas nécessaire. Le polyéthylène glycol est ajouté à l&#39;isoflurane pour diminuer la pression de vapeur et le taux d&#39;évaporation. Trop de vapeurs d&#39;isoflurane va induire la mort trop rapidement. Si l&#39;animal meurt avant que le foie est canulée et blanchies avec le SCT, l&#39;accumulation de sang peut coaguler dans le foie et éviter un lavage efficace des sinusoïdes et la digestion par la collagénase. L&#39;ajout d&#39;héparine peut être utile comme un anticoagulant, mais n&#39;est pas utilisé dans ces études puisque nous utilisons l&#39;héparine étiqueté comme notre sonde. Gey solution saline tamponnée (GBSS) est souvent remplacé par d&#39;autres laboratoires pour la purification de la SEC. Bien qu&#39;il soit utile pour la purification de la SEC, l&#39;hépatiteatocytes ne tolèrent pas GBSS ainsi que des tampons 1-3 et viabilités ne sont pas aussi élevés. Lorsque l&#39;on mesure l&#39;endocytose, c&#39;est une bonne pratique pour mesurer les niveaux de fond dans l&#39;organe et dans les hépatocytes purifiée. Cette méthode est l&#39;un des deux pour une purification efficace des SEC après la perfusion du foie avec de la collagénase. L&#39;autre méthode sépare les cellules non parenchymateuses par 19 centrifugation élutriation lieu de gradient de Percoll. Les avantages de l&#39;utilisation d&#39;élutriation plus gradients de Percoll sont viabilités cellulaires légèrement plus élevé et les chiffres. L&#39;inconvénient est que la centrifugation élutriation nécessite un rotor spécialisée, dédiée centrifugeuse et la pompe péristaltique ensemble, ce qui coûte des dizaines de milliers de dollars. Cette méthode ne nécessite que l&#39;utilisation d&#39;une centrifugeuse de table réfrigérée et une pompe péristaltique qui est la norme dans de nombreux laboratoires. Séparation des secondes et KCs par adhésion sélective est une méthode standard20-22. S&#39;il est vrai que SECs va adhérer au verre et le plastique, le point clé est d&#39;utiliser lavé à l&#39;acide de verre propre avec pas plus d&#39;une incubation de 15 minutes à 37 ° C à 5% de CO 2. KCS adhèrent toujours plus rapide que s et il est conseillé de laver délicatement le KCS avec les médias pour en extraire toute SECs restants qui sont devenus lâchement. Pronase et d&#39;autres protéases sont également omis de la digestion par la collagénase étapes dans ce protocole pour augmenter viabilités des cellules. Les protéases digèrent récepteurs extracellulaires et peut inhiber l&#39;adhésion cellulaire dans les étapes finales de purification. La méthode présentée ici a une grande variété d&#39;applications. Bien que nous montrons le résultat final dans lequel l&#39;héparine est d&#39;abord pris pour le dédouanement, la perfusion du foie pour l&#39;obtention d&#39;hépatocytes primaires, KC, secs, et les CSH peut être utile pour un certain nombre d&#39;études impliquant des voies métaboliques, immunorégulation, des activités au trésor, et les autres physiologiques studies. La partie la plus difficile de cette procédure est bonne canulation, la digestion du foie, et la manipulation du foie sans avoir le bordereau de cathéter de la veine porte.

<ul><li> Tampon 1: 142 mM de NaCl 6,7 mM de KCl, 10 mM d&#39;HEPES, 1,5% de BSA, pH 7,4 </li><li> Tampon 2 (tampon de perfusion): 67,0 mM de NaCl, 6,7 mM de KCl, 4,8 mM de CaCl2-H2O, 101,0 mM HEPES, BSA 1,5%, pH 7,4. </li><li> Tampon 3: NaCl 137 mM, 4,7 mM de KCl, 0,7 mM MgSO 4, 1,2 mM de 2-2H 2 O CaCl, HEPES 10 mM, 1,5% de BSA, pH 7,4 </li><li> RPMI / BSA: 15g / L de BSA dans du RPMI </li><li> TRIS saline tamponnée (SCT): 154 mM NaCl, 10 mM de sel de la Base Trizma. </li><li> Collagénase: collagénase A (# 11088785103) de Roche, la collagénase de type I (# LS004691) de Worthington Biochemical ou la collagénase I (# C0130) ou IA (# C9891) de Sigma-Aldrich. </li></ul> Tous les sels sont de Sigma-Aldrich <table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Société </td><td> Modèle / catalog # </td><td> Commentaire </td></tr><tr><td> Bain d&#39;eau 20L </td><td> ThermoFisher </td><td> 2231 </td><td> L&#39;eau est d&#39;environ 45 ° C pour compenser le refroidissement </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> dans le tube. </td></tr><tr><td> Pompe péristaltique </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-70 </td><td> Masterflex série </td></tr><tr><td> Centrifugeuse réfrigérée </td><td> Sorvall </td><td> Légende XTR </td><td></td></tr><tr><td> Cathéter </td><td> BD Biosciences </td><td> 381444 </td><td></td></tr><tr><td> Dessiccateur de chambre </td><td> Fisher </td><td> 08595E </td><td> Utilisez la plaque intérieure </td></tr><tr><td> Percoll </td><td> Sigma </td><td> P4937 </td><td></td></tr><tr><td> Bovine Serum Albumin </td><td> SeraCare </td><td> AP-4510-01 </td><td></td></tr><tr><td> 100 mailles um </td><td> Laboratoires du spectre </td><td> 146488 </td><td></td></tr><tr><td> 30 mesh um </td><td> Laboratoires du spectre </td><td> 146506 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI 1640 </td><td> Invitrogen </td><td> 21870 </td><td></td></tr><tr><td> Polyéthylène glycol </td><td> Spectre de laboratoires </td><td> PO107 </td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo liver endocytosis followed by purification of liver cells by liver perfusion

Le foie est le centre métabolique de l&#39;organisme des mammifères et sert de filtre pour le sang. L&#39;architecture de base du foie est illustré dans la figure 1, dans lequel plus de 85% de la masse du foie est composé d&#39;hépatocytes et les 15% restants de la masse cellulaire est composé de cellules de Kupffer (KCS), les cellules étoilées (CSH), et cellules endothéliales sinusoïdales (secs). SECs forment les parois des vaisseaux sanguins dans le foie et contiennent la morphologie spécialisées appelées fenestrae sein dans le cytoplasme. Fenestration du cytoplasme est l&#39;apparition de trous (~ 100 um) dans les cellules de sorte que l&#39;acte SECs comme un tamis dont la plupart des chylomicrons, résidus de chylomicrons et des macromolécules, mais pas les cellules, passent à travers les hépatocytes et les CSH 1 (Fig. 1). En raison de l&#39;absence d&#39;une membrane basale, l&#39;écart entre les secondes et les hépatocytes forment l&#39;espace de Disse. CSH occuper cet espace et de jouer un rôle important dans la régulation et la réponse à injury, le stockage de l&#39;acide rétinoïque et l&#39;immunorégulation des 2 foie. SECs sont parmi les cellules les plus actives endocytically du corps affichant une gamme de récepteurs scavenger sur leur surface de la cellule 3. Il s&#39;agit notamment de SR-A, Stabilin-1 et Stabilin-2. Généralement, les petites particules colloïdales moins de 230 nm et de macromolécules en phase tampon sont repris par SECS, alors, les grosses particules et les débris cellulaires est endocytosée (phagocytés) par KCs 4. Ainsi, le jeu en vrac de matériaux extracellulaires tels que les glycosaminoglycanes du sang est largement tributaire de la santé et des fonctions d&#39;endocytose SECs 5,6. Par exemple, une augmentation des niveaux sanguins hyaluronane est révélatrice de la maladie hépatique variant de légère à des formes plus sévères 7. Avec l&#39;exception d&#39;un rapport de 8, il n&#39;ya pas de lignées immortalisées de cellules SEC dans l&#39;existence. Même cette lignée cellulaire immortalisée est dé-différenciationATED en ce qu&#39;elle n&#39;exprime pas les récepteurs scavenger qui sont présents sur SECs primaires (nos données, non présentées). Toutes les études de biologie cellulaire doit être effectuée sur des cellules primaires obtenues fraîchement de l&#39;animal. Malheureusement, secs dédifférencier dans des conditions standard de culture et doit être utilisé dans 1 ou 2 jours après l&#39;isolement de l&#39;animal. Différenciation des SEC est marquée par l&#39;expression de Stabilin-2 ou d&#39;un récepteur HARE 9, CD31, et la présence de fenestration cytoplasmique 1. Différenciation des SEC peut être étendue par l&#39;ajout de VEGF dans les milieux de culture ou par culture de cellules dans le milieu conditionné des hépatocytes 10,11. Dans ce rapport, nous allons démontrer l&#39;activité endocytaire des SEC de l&#39;organe intactes en utilisant la radio-étiquetés héparine pour hyaluronane pour la SEC spécifiques Stabilin-2 du récepteur. Nous allons ensuite purifier les hépatocytes et secondes à partir du foie perfusé pour mesurer l&#39;endocytose.

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In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

L&#39;étude des cellules endothéliales sinusoïdales du foie (secs) doit être effectuée avec des cellules primaires provenant de l&#39;animal car aucune des lignées de cellules existent. Cette méthode repose sur la digestion du foie et centrifugation différentielle pour la purification de la SEC pour la culture subséquente et l&#39;expérimentation.

Dans l&#39;endocytose hépatique in vivo suivie d&#39;une purification des cellules du foie par perfusion du foie

The liver is the metabolic center of the mammalian body and serves as a filter for the blood.  The basic architecture of the liver is illustrated in ...

in-vivo-liver-endocytosis-followed-purification-liver-cells-liver

Research

JoVE Journal

Biology

In vivo Liver Endocytosis Followed by Purification of Liver Cells by Liver Perfusion

18.9K vues.  University of Nebraska, Lincoln. L'étude des cellules endothéliales sinusoïdales du foie (secs) doit être effectuée avec des cellules primaires provenant de l'animal car aucune des lignées de cellules existent. Cette méthode repose sur la digestion du foie et centrifugation différentielle pour la purification de la SEC pour la culture subséquente et l'expérimentation.

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Isolation of CD133+ Liver Stem Cells for Clonal Expansion

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In addition, liver stem cells are hypothesized to be the precursors for a subset of liver cancer, Hepatocellular carcinoma. One of the primary challenges to stem cell work in any solid organ like the liver is the isolation of a rare population of cells for detailed analysis. For example, the vast majority of cells in the liver are hepatocytes (parenchymal fraction), which are significantly larger than non-parenchymal cells. By enriching the specific cellular compartments of the liver (i.e. parenchymal and non-parenchymal fractions), and selecting for CD45 negative cells, we are able to enrich the starting population of stem cells by over 600-fold.The proceduresdetailed in this report allow for a relatively rare population of cells from a solid organ to be sorted efficiently. This process can be utilized to isolateliver stem cells from normal murine liver as well as chronic liver injury models, which demonstrate increased liver stem cell proliferation. This method has clear advantages over standard immunohistochemistry of frozen or formalin fixed liver as functional studies using live cells can be performed after initial co-localization experiments. To accomplish the procedure outlined in this report, a working relationship with a research based flow-cytometry core is strongly encouraged as the details of FACS isolation are highly dependent on specialized instrumentation and a strong working knowledge of basic flow-cytometry procedures. The specific goal of this process is to isolate a population of liver stem cells that can be clonally expanded in vitro.

Here we describe the isolation of CD133 expressing liver stem cells and cancer stem cells from whole murine liver, a process that requires tissue digestion, cell enrichment, and flow cytometry isolation. We include methods for advanced single cell isolation and clonal expansion.

Isolement des cellules CD133 + Foie souches pour l&#39;expansion clonale

Liver stem cell, or oval cells, proliferate during chronic liver injury, and are proposed to differentiate into both hepatocytes and cholangiocytes. In ...

Recherche

Biologie

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

Isolement des fibroblastes de rat par portail<em&gt; In situ</emPerfusion du foie&gt;

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term storage of biological materials such as blood, cells and tissues 1,2. The cryogenic nature of liquid nitrogen, while ideal for sample preservation, can cause rapid freezing of live tissues on contact - known as 'cryogenic burn'2, which may lead to severe frostbite in persons closely involved in storage and retrieval of samples from Dewars. Additionally, as liquid nitrogen evaporates it reduces the oxygen concentration in the air and might cause asphyxia, especially in confined spaces2.
In laboratories, biological samples are often stored in cryovials or cryoboxes stacked in stainless steel racks within the Dewar tanks1. These storage racks are provided with a long shaft to prevent boxes from slipping out from the racks and into the bottom of Dewars during routine handling. All too often, however, boxes or vials with precious samples slip out and sink to the bottom of liquid nitrogen filled tank. In such cases, samples could be tediously retrieved after transferring the liquid nitrogen into a spare container or discarding it. The boxes and vials can then be relatively safely recovered from emptied Dewar. However, the cryogenic nature of liquid nitrogen and its expansion rate makes sunken sample retrieval hazardous. It is commonly recommended by Safety Offices that sample retrieval be never carried out by a single person. Another alternative is to use commercially available cool grabbers or tongs to pull out the vials3. However, limited visibility within the dark liquid filled Dewars poses a major limitation in their use.
In this article, we describe the construction of a Cryotolerant DIY retrieval device, which makes sample retrieval from Dewar containing cryogenic fluids both safe and easy.

Here we present a low cost, durable cryotolerant device for sample retrieval from Dewar tanks filled with liquid nitrogen. The ease of construction and modular design of the device makes the process of sample retrieval from cryogenic tanks safe and easy.

Do-It-Yourself dispositif de récupération d&#39;échantillons cryoconservés tombé accidentellement dans les réservoirs de stockage cryogéniques

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Isolation of Human Hepatocytes by a Two-step Collagenase Perfusion Procedure

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. As such, hepatocytes are an important model for a large variety of research questions. In particular, the use of human hepatocytes is especially important in the fields of pharmacokinetics, toxicology, liver regeneration and translational research. Thus, this method presents a modified version of a two-step collagenase perfusion procedure to isolate hepatocytes as described by Seglen 1.
Previously, hepatocytes have been isolated by mechanical methods. However, enzymatic methods have been shown to be superior as hepatocytes retain their structural integrity and function after isolation. This method presented here adapts the method designed previously for rat livers to human liver pieces and results in a large yield of hepatocytes with a viability of 77&plusmn;10%. The main difference in this procedure is the process of cannulization of the blood vessels. Further, the method described here can also be applied to livers from other species with comparable liver or blood vessel sizes.

A modified two-step collagenase perfusion procedure for isolation of human hepatocytes is described. This method can also be applied to other mammalian livers. The isolated hepatocytes are available in high yield and viability, making them a suitable model for scientific research in areas such as liver regeneration, pharmacokinetics and toxicology.

Isolement des hépatocytes humains par un deux-étape collagénase procédure de perfusion

The liver, an organ with an exceptional regeneration capacity, carries out a wide range of functions, such as detoxification, metabolism and homeostasis. ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

In Vivo suivi 4-Dimensional de hématopoïétiques cellules souches et progénitrices adultes dans la voûte du crâne de souris de moelle osseuse

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved substances from the blood into the liver parenchyma for metabolism and processing. Fenestrations are dynamic structures - both their size and/or number can be altered in response to various physiological states, drugs, and disease, making them an important target for modulation. An understanding of how LSEC morphology is influenced by various disease, toxic, and physiological states and how these changes impact on liver function requires accurate measurement of the size and number of fenestrations. In this paper, we describe scanning electron microscopy fixation and processing techniques used in our laboratory to ensure reproducible specimen preparation and accurate interpretation. The methods include perfusion fixation, secondary fixation and dehydration, preparation for the scanning electron microscope and analysis. Finally, we provide a step by step method for standardized image analysis which will benefit all researchers in the field.

The fenestrated liver sinusoidal endothelial cell is a biologically important filter system that is highly influenced by various diseases, toxins, and physiological states. These changes significantly impact on liver function. We describe methods for the standardisation of the measurement of the size and number of fenestrations in these cells.

Une méthode standardisée pour l&#39;analyse des cellules endothéliales et sinusoïdale du foie Leurs fenestrations par microscopie électronique à balayage

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Cell Type-specific Gene Expression Profiling in the Mouse Liver

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A deeper understanding of the changes in gene expression that occur during repopulation could help identify therapeutic targets to promote the restoration of liver function in the setting of injuries. Nonetheless, methods to isolate specifically the repopulating hepatocytes are inhibited by a lack of cell markers, limited cell numbers, and the fragility of these cells. The development of translating ribosome affinity purification (TRAP) technology in conjunction with the Fah-/- mouse model to recapitulate repopulation in the setting of liver injury allows gene expression profiling of the repopulating hepatocytes. With TRAP, cell type-specific translating mRNA is rapidly and efficiently isolated. We developed a method that utilizes TRAP with affinity-based isolation of translating mRNA from hepatocytes that selectively express the green fluorescent protein (GFP)-tagged ribosomal protein (RP), GFP:RPL10A. TRAP circumvents the long time period required for fluorescence-activated cell sorting that could change the gene expression profile. Furthermore, since only the repopulating hepatocytes express the GFP:RPL10A fusion protein, the isolated mRNA is devoid of contamination from the surrounding injured hepatocytes and other cell types in the liver. The affinity-purified mRNA is of high quality and allows downstream PCR- or high-throughput sequencing-based analysis of gene expression.

Translating ribosome affinity purification (TRAP) enables rapid and efficient isolation of cell type-specific translating mRNA. Here, we demonstrate a method that combines hydrodynamic tail-vein injection in a mouse model of liver repopulation and TRAP to examine the expression profile of repopulating hepatocytes.

Profilage de l'expression génique spécifique au type cellulaire dans le foie de souris

Liver repopulation after injury is a crucial feature of mammals which prevents immediate organ failure and death after exposure of environmental toxins. A ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

Isolement et caractérisation des cellules endothéliales sinusoïdales primaires du foie de souris

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is often not detected until drugs have reached clinical stages, risking patients' safety and leading to substantial losses for the pharma industry. Taking into account that standard 2D models have limitations in detecting DILI it is essential to develop in vitro models that are more predictive to improve data translatability. To understand causality and mechanistic aspects of DILI in detail, a human liver MPS consisting of human primary liver parenchymal and non-parenchymal cells (NPCs) and cultured in 3D microtissues on an engineered scaffold under perfusion has been developed. Cryopreserved primary human hepatocytes (PHHs) and Kupffer cells (HKCs) were cocultured as microtissues in the MPS platform for up to two weeks, and each compound of interest was repeatably dosed onto liver microtissues at seven test concentrations for up to four days. Functional liver-specific endpoints were analyzed (including clinical biomarkers such as alanine aminotransferase, ALT) to evaluate liver function. Acute and chronic exposure to compounds of various DILI severities can be assessed by comparing responses to single and multi-dosed microtissues. The methodology has been validated with a broad set of severe and mildly hepatotoxic compounds. Here we show the data for pioglitazone and troglitazone, well-known hepatotoxic compounds withdrawn from the market for causing liver failures. Overall, it has been shown that the liver MPS model can be a useful tool to assess DILI and its association with changes in hepatic function. The model can additionally be used to assess how novel compounds behave in distinct patient subsets and how toxicity profiles may be affected by liver disease states (e.g., viral hepatitis, fatty liver disease).

Human Liver Microphysiological System for Assessing Drug-Induced Liver Toxicity In Vitro

Drug-induced liver injury (DILI) is a major cause of drug failure. A protocol has been developed to accurately predict the DILI liability of a compound using a liver microphysiological system (MPS). The liver model uses the coculture of primary hepatic cells and translationally relevant endpoints to assess cellular responses to treatment.

Système microphysiologique du foie humain pour l’évaluation de la toxicité hépatique induite par un médicament in vitro

DILI is a major cause of attrition in drug development with over 1000 FDA-approved drugs known to potentially cause DILI in humans. Unfortunately, DILI is ...

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) is a growing global health issue, and the impact of NAFLD is compounded by the current lack of effective treatments. Considerable limiting factors hindering the timely and accurate diagnosis (including grading) and monitoring of NAFLD, as well as the development of potential therapies, are the current inadequacies in the characterization of the hepatic microenvironment structure and the scoring of the disease stage in a spatiotemporal and non-invasive manner. Using a diet-induced NAFLD mouse model, we investigated the use of in vivo micro-computed tomography (CT) imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation. This imaging methodology allows for longitudinal analysis of liver steatosis and functional tissue uptake, as well as the evaluation of the relative blood volume, portal vein diameter, and density of the vascular network. Understanding the adaptations of the hepatic vascular network during NAFLD progression and correlating this with other ways of characterizing the disease progression (steatosis, inflammation, fibrosis) using the proposed method can pave the way toward the establishment of new, more efficient, and reproducible approaches for NAFLD research in mice. This protocol is also expected to upgrade the value of preclinical animal models for investigating&#160;the development of novel therapies against disease progression.

Novel In Vivo Micro-Computed Tomography Imaging Techniques for Assessing the Progression of Non-Alcoholic Fatty Liver Disease

Using a diet-induced non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) mouse model, we describe the use of novel in vivo micro-computed tomography imaging techniques as a non-invasive method to assess the progression stages of NAFLD, focusing predominantly on the hepatic vascular network due to its significant involvement in NAFLD-related hepatic dysregulation.