Les auteurs tiennent à remercier les chefs, sous-chefs et les communautés de Macha pour leur unwaveing ​​coopérer lors de moustiques collections d&#39;échantillons sur le terrain. Dr Doug Norris et Rebecca Kent a offert une précieuse expertise sur le protocole de relargage. Ce travail a été financé par la Johns Hopkins Malaria Research Institute pilote de système de subvention. Mosquito et parasites ADN normes de laboratoire ont été fournies gracieusement par MR4, American Type Culture Collection &amp;.

1. Dissection préparatoire de spécimens de moustiques <ol><li> Moustique lieu sur une petite coupe de parafilm et de montage sur microscope à dissection. </li><li> Couverture en goutte d&#39;eau déminéralisée pour assouplir les tissus. </li><li> Inciser la carcasse moustique précisément à la jonction entre le thorax et l&#39;abdomen, ainsi entailler large de la tête et du thorax de la section abdominale. </li><li> Transférer chaque section moustiques disséqués dans un autoclave propre tube de 1,5 ml préalablement marqué avec les détails de moustiques numéro d&#39;identification et convenablement marqués pour désigner section de corps (par exemple &quot;m&quot; pour la mi-gut article; &quot;ht&quot; pour la tête et le thorax section). </li><li> Jeter parafilm et essuyer soigneusement la platine du microscope avec Kimwipe 70% humecté d&#39;alcool avant de traiter le moustique prochaine. </li></ol> 2. Extraction de l&#39;ADN de spécimens de moustiques <ol><li> Pipeter 20 ul d&#39;eau déminéralisée dans le tube échantillon et la pointe de pipette utilisation pour moudre la section des moustiques immergé dans un nonsuspension iForm. </li><li> Ajouter 100 ul de PBS 1X autoclavé / solution de saponine à 1% homogénat de l&#39;échantillon et mélanger au vortex momentanée douce. </li><li> Incuber à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Centrifuger à 20000 xg pendant 2 min et éliminer le surnageant. </li><li> Resuspendre le culot dans 100 ul de PBS 1X. </li><li> Centrifuger de nouveau à 20.000 xg pendant 2 min et éliminer le surnageant. </li><li> Au vortex doux (5 sec), resuspendre le culot dans 75 pl d&#39;eau déminéralisée stérile et 25 ul de 20% p / v de suspension de résine Chelex-100 dans de l&#39;eau déminéralisée. </li><li> Pierce trou dans le couvercle du tube de prélèvement stérile avec aiguille hypodermique 23G flambé au bec Bunsen. </li><li> Suspension d&#39;échantillon bouillir au bain-marie sur une grille flottante (ou dans le bloc de chauffage) pendant 10 min. </li><li> Centrifuger à 20000 xg, pendant 1 min et une solution de transfert d&#39;ADN qui a suivi dans le flacon de stockage préalablement marqué pour être utilisé comme modèle dans les applications PCR. </li></ol> 3. Plasmodium falciparum génotypage et Anophelesspp. Identification moléculaire <ol><li> Ajouter 2,5 ul de l&#39;extrait d&#39;ADN Chelex dans 25 pi de réactions de PCR pour vérifier la qualité de l&#39;ADN 11, identifier les espèces d&#39;anophèles 10 et le génotype P. 12 infections à P. falciparum glandes de l&#39;intestin moyen et salivaires. </li><li> Pour maximiser le rendement amplicon, en particulier pour P. détection de P. falciparum, notamment 1.5X albumine de sérum bovin (BSA) dans la PCR. La composition de réaction suivante est recommandée: (2,5 modèle ul, 0,25, 1,5 uM amorces chlorure de magnésium uM dNTP, 200 uM, 1X tampon PCR, 1,5 BSA et la polymérase Taq ADN 1.0U, en 25 volumes pi). </li><li> Pour vérifier la qualité de l&#39;ADN dans l&#39;extrait, amplifier la région de la déshydrogénase mitochondriale des arthropodes nicotinamide adénine dinucléotide (NADH) sous-unité 4 (ND4) gène (amorces ND4FW [5&#39;-TGA GTD YAT TTA TTR CCT ​​AA-3 &#39;] et ND4RV [5&#39; DMC-CTT CTT CCW ADW CGT TC-3 &#39;]; attendez produit 400 pb) 11,13. </li><li> Afin de différencier les anophèles gambiee sl espèces jumelles. (An. gambiae ss et An. arabiensis. seulement), amplifier région flanquante SNP dans l &#39;espaceur intergénique (IGS), (amorces des Nations Unies [5&#39;-GTGTGCCCCTTCCTCGATGT-3&#39;], GA [5&#39;-CTGGTTTGGTCGGCACGTTT- 3 &#39;], AR [5&#39;-AAGTGTCCTTCTCCATCCTA-3&#39;], attendez-390bp produit Un gambiae ss, An. arabiensis 315bp) 10,11. </li><li> Pour le typage P. falciparum polymorphismes antifolates résistance aux médicaments, effectuer des PCR nichée pour amplifier la région flanquant codons d&#39;acides aminés 108, 51, 59, 16 et 164 de la réductase de dihydrofolate parasite (DHFR): Amorces rondes primaires: M1 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGC-3 &#39;] et M5 [5&#39;-AGTATATACATCGCTAACAGA-3&#39;] Secondaires amorces rondes: M3 [5&#39;-TTTATGATGGAACAAGTCTGCGACGTT-3 &#39;] avec F / [5&#39;-AAATTCTTGATAAACAACGGAAACCTTTTA-3&#39;] Ou F [5&#39;-GAAATGTAATTCCCTAGATATGGAATATT-3] avec M4 [5&#39;-TTAATTTCCCAAGTAAAACTATTAGAGCTTC-3 &#39;]). Aussi amplifier la région contenant des codons d&#39;acides aminés 436, 437, 540, 581 unnd 613 dans le p falciparum synthétase dihydroptéroate (DHPS) gène: Primaire ronde amorces R2 [5&#39;-AACCTAAACGTGCTGTTCAA-3 &#39;] avec R / [5&#39;-AATTGTGTGATTTGTCCACAA3&#39;]; Secondaires amorces rondes J: [5&#39;-&#39;TGCTAGTGTTATAGATATAGGTGGAGAAAGC-3&#39;] avec K / [5&#39;-CTATAACGAGGTATTGCATTTATTGCAAGAA-3 &#39;] Ou K: [5&#39;-TGCTAGTGTTATAGATATAGGATGAGCATC-3 &#39;] avec K /, Ou L [5&#39;-ATAGGATACTATTTGATATTGATATTGGACCAGGATTCG-3 &#39;] avec L / [5&#39;-5TATTACAACATTTTGATCATTCGCGCAACCGG-3&#39;] 12. </li><li> Sujet 4 amplicon ul d&#39;allèles spécifiques digestions par des enzymes de restriction dans 30 pi de réactions suivant les instructions du fabricant, pour détecter les médicaments antifolates associées à la résistance polymorphismes 12. </li><li> Sujet 5 pi d&#39;amplicon de PCR (ou 15 pi de digestion de restriction) par voie de bromure d&#39;éthidium gel d&#39;agarose coloré 2% à électrophorèse (100 - 120V) et visualiser les bandes sous lumière ultraviolette. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonnet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+antimalarial+treatment+in+Guinea:+in+vivo+study+of+two+artemisinin+combination+therapies+in+Dabola+and+molecular+markers+of+resistance+to+sulphadoxine-pyrimethamine+in+N'Zerekore.">Efficacy of antimalarial treatment in Guinea: in vivo study of two artemisinin combination therapies in Dabola and molecular markers of resistance to sulphadoxine-pyrimethamine in N'Zerekore.</a> Malar. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La méthode Chelex simplifiée présentée ici permet l&#39;extraction de la qualité des anophèles et P. ADN falciparum à partir de spécimens de moustiques qui se prêtent à diverses applications PCR. Cette technique peut être utilisée pour l&#39;identification moléculaire des moustiques vecteurs du paludisme et de la surveillance de la pharmacorésistance P. allèles falciparum chez les moustiques des programmes nationaux de lutte contre le paludisme. Les avantages de la technique simplifiée Chelex comprennent la simplicité, moins de réactifs et donc le coût, la sécurité et le temps de traitement plus court (37 min) de protocoles standard tels que la méthode de relargage 10 (2 h 47 min et une étape du jour au lendemain, tableau 1). Les avantages mentionnés ci-dessus et les exigences minimales de réactifs (3 réactifs) par rapport au protocole standard actuel (10 réactifs, tableau 1) 11,15, rendre le protocole Chelex simplifiée particulièrement convivial pour les laboratoires des pays d&#39;endémie où un réactif constantchaîne d&#39;approvisionnement est souvent difficile à maintenir. Une limitation de cette méthode est que, comme le protocole standard, il est également soumis à des inhibiteurs de PCR connus pour se produire dans le tégument moustique 16. Toutefois, cela est facilement soulagée par l&#39;inclusion de BSA dans les essais. BSA a également été utilisé avec succès comme un exhausteur d&#39;amplification des inhibiteurs contre dans les applications de PCR autres 17,18.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> Chelex-100, 50-100 mesh sec </td><td> BioRad </td><td> # 143-2832 </td><td></td></tr><tr><td> Saponine </td><td> SIGMA </td><td> 142-7425 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> New England Biolabs </td><td> B9001S </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple chelex protocol for dna extraction from anopheles spp.

Les pays d&#39;endémie sont de plus en plus l&#39;adoption d&#39;outils moléculaires pour le typage efficace, l&#39;identification et la surveillance contre les parasites du paludisme et les moustiques vecteurs, en tant que partie intégrante de leurs programmes de lutte 1,2,3,4,5. Pour l&#39;établissement durable de ces approches précises dans les opérations de recherche afin de renforcer la lutte antipaludique et les efforts d&#39;élimination, les méthodes simples et abordables, avec le réactif parcimonieux et les besoins en équipement sont essentiels 6,7,8. Nous présentons ici un simple Chelex technique basée sur l&#39;extraction de l&#39;ADN du parasite du paludisme et de vecteur à partir d&#39;échantillons prélevés sur le terrain de moustiques. Nous morphologiquement identifié 72 Anopheles gambiae sl. De 156 moustiques capturés par pyrèthre bombe insecticide dans les cabines de ménages dans une 2,000 km 2 à proximité de l&#39;Institut du paludisme à Macha. Après dissection de séparer la tête et le thorax de l&#39;abdomen pour tous les gam 72 Anophelesgambiae sl. moustiques, les deux parties ont été placés individuellement dans des tubes de 1,5 ml microtubes et immergé dans 20 ul d&#39;eau déminéralisée. Utiliser un embout de pipette stérile, chaque section séparément moustique a été homogénéisé à une suspension uniforme dans l&#39;eau déminéralisée. De l&#39;homogénat découlant de chaque section de moustique, 10 pi a été retenu tandis que l&#39;autre 10 pi a été transféré dans un autoclave séparé tube de 1,5 ml. Les aliquotes séparées ont été soumis à l&#39;extraction d&#39;ADN, soit par le Chelex simplifiée ou de la norme relargage d&#39;extraction protocole 9,10. Le protocole de relargage est dite et largement utilisée car elle emploie des concentrations élevées de sel au lieu de dangereux solvants organiques (tels que le phénol et le chloroforme) pour l&#39;étape de précipitation des protéines au cours de l&#39;extraction d&#39;ADN 9. Les extraits ont été utilisés comme matrices pour l&#39;amplification par PCR en utilisant des amorces ciblant les arthropodes déshydrogénase mitochondriale nicotinamide adénine dinucléotidenase (NADH) 4 sous-unité du gène (ND4) pour vérifier 11 Qualité ADN, la PCR pour l&#39;identification des espèces d&#39;anophèles gambiae frères et sœurs de 10 et une PCR nichée pour le typage des infections à Plasmodium falciparum 12. Comparaison avec la qualité de l&#39;ADN (ND4) PCR a montré une sensibilité de 93% et une spécificité de 82% pour l&#39;approche Chelex par rapport à la place relargage protocole. Les valeurs correspondantes de sensibilité et de spécificité étaient de 100% et 78%, respectivement, en utilisant frère identification des espèces PCR et 92% et 80%, respectivement pour P. falciparum détection par PCR. Il n&#39;y avait aucune différence significative dans la proportion d&#39;échantillons de signal donnant amplicon avec le Chelex ou le relargage régulier protocole dans toutes les applications PCR trois. L&#39;approche nécessaire Chelex trois réactifs simples et 37 min pour compléter, tandis que l&#39;. Relargage protocole comportait 10 réactifs différents et 2 h et 47 min de temps de traitement &quot;, comprenant une étape de nuit Nos résultats montrent èmeà la méthode Chelex est comparable à celui existant relargage d&#39;extraction et peut être remplacé par une approche simple et durable en pays à ressources limitées où un réactif de la chaîne d&#39;approvisionnement constant est souvent difficile à maintenir.

Des exemples de résultats de tests de PCR pour l&#39;ADN extrait de la qualité de moustiques (figure 1), Anopheles arabiensis moléculaire d&#39;identification (figure 2) et P. falciparum détection (figure 3) montrent que la méthode Chelex simplifié donne des résultats similaires à la norme relargage protocole 10, en dépit des mesures beaucoup moins (tableau 1). Avec une qualité d&#39;ADN comparable dans les extraits respectives, il n&#39;est pas surprenant que les taux de positivité échantillon par rapport à un. espèces jumelles gambiae ainsi que les taux d&#39;infection parasitaire n&#39;étaient pas statistiquement différente en fonction de McNemar test du chi carré (figure 3). Sensibilité (%) a été calculé comme VP / (VP + FN) * 100, où TP désigne les vrais positifs et des faux négatifs FN indique. Spécificité (%) a été déterminée comme VN / (VN + FP) * 100, où TN indique vrais négatifs et de faux positifs FP indique. La qualité de l&#39;ADN (ND4) PCR a montré une sensibilité de 93% et une spécificité de 82% pour l&#39;approche Chelex par rapport à la norme établie or relargage protocole. Les valeurs correspondantes de sensibilité et de spécificité étaient de 100% et 78%, respectivement, en utilisant frère identification des espèces PCR et 92% et 80%, respectivement pour P. falciparum détection par PCR. L&#39;ajout de BSA aux mélanges de réaction a entraîné une augmentation générale de positifs par PCR (figure 3) en raison du relief d&#39;inhibiteurs de PCR 14, à la fois pour le Chelex simplifiée et régulière relargage protocole. Toutefois, cette augmentation n&#39;était pas statistiquement significative, sauf pour la qualité de l&#39;ADN (PCR ND4) sur des extraits Chelex (p = 0,039). Allèle-spécifique digestion par des enzymes de restriction sur P. falciparum DHFR (ou gène cible) amplicon permet le génotypage de l&#39;intestin moyen et salivaires des glandes infections palustres pour les allèles de résistance aux médicaments (Figure 4, les données des glandes salivaires non présentées). <table border = &quot;1&quot;&gt; <tbody><tr><td colspan="2"> Procédure simple Chelex </td><td colspan="2"> Norme relargage de procédure </td></tr><tr><td> Mesures </td><td> Réactifs </td><td> Mesures </td><td> Réactifs </td></tr><tr><td><ol><li> Ajouter spécimen à 1,5 ml tube de centrifugeuse et homogénéiser dans 100 ul de PBS 1X / solution de saponine à 1% (2 min). </li><li> Laisser à température ambiante pendant 20 min. </li><li> Centrifuger à 20.000 xg pendant 2 min et éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 100 ul de PBS 1X et mélanger doucement au vortex brièvement (3 secondes). </li><li> Centrifuger à 20.000 xg pendant 2 min et éliminer le surnageant. </li><li> Ajouter 25 ul de 20% p / v Chelex dans l&#39;eau déminéralisée et 75 pl d&#39;eau stérile déminéralisée. </li><li> Pierce trou dans le couvercle du tube d&#39;échantillon en utilisant chaude, aiguille stérile hypodermique 23G et le contenu du tube bouillir pendant 10 minutes. </li><li> Spin tube de centrifugeuse à 20000 xg pendant 1 min. </li><li> Transférer le surnageant dans un flacon stérile et préalablement marqué solution d&#39;ADN à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation (2,5 ul dans 25 ul de réaction PCR). </li></ol></td><td> PBS Saponine Chelex-100 perles </td><td><ol><li> Ajouter spécimen à 1,5 ml tube de centrifugeuse et homogénéiser dans 100 pi de tampon * Bender au DEPC 1% (2 min). </li><li> Incuber à 65 ° C pendant 1 heure. </li><li> Ajouter 15 ul froide 8 M d&#39;acétate de potassium. Mélanger doucement et incuber sur de la glace pendant 45 min. </li><li> Faites tourner l&#39;échantillon dans des microtubes à 20.000 xg pendant 10 min et le transfert de surnageant dans un nouveau tube de 1,5 ml. </li><li> Ajouter 250 ul d&#39;éthanol à 100% et bien mélanger en retournant le tube. </li><li> Incuber l&#39;échantillon à température ambiante pendant 5 min. </li><li> Spin échantillons à 20.000 xg pendant 15 min. </li><li> Aspirer et éliminer le surnageant, le culot en laissant sécher complètement dans le tube (30 min). </li><li> Resuspendre le culot dans 20 ul de 0,1 X SSC RNAse + (10 pg / ml) pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Ajouter 80 pl d&#39;eau DEPC et conserver à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation. </li></ol></td><td> Diéthylpyrocarbonate (DEPC) * Bender tampon: 0,1 M NaCl 0,2 M de saccharose 0,1 M Tris-HCL 0,05 M EDTA, pH 9,1 0,5% dans de l&#39;eau DEPC SDS 8 M d&#39;acétate de potassium L&#39;éthanol 0,1 X citrate de sodium salin (SSC) tampon RNAse (10 pg / ml) </td></tr><tr><td colspan="2"> TEMPS TOTAL: 37 min </td><td colspan="2"> Durée totale: 2 h 47 min, plus du jour au lendemain </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Étape par étape de comparaison des réactifs et des exigences de temps pour le protocole Chelex simple et seard relargage méthode d&#39;extraction d&#39;ADN à partir d&#39;échantillons de moustiques. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig1.jpg" /> Figure 1. ND4 mitochondrial PCR comparaison de la qualité de l&#39;ADN simplifié Chelex &quot;C&quot; et la norme relargage &quot;M&quot; sur des échantillons extraits Anopheles arabiensis sur le terrain. NC, témoin négatif; M1 et C1, C2 et M2, M3 et C3, et C4 et M4 sont appariés relargage et extraits du Chelex Une même. spécimens de moustiques arabiensis. L, 100 pb échelle d&#39;ADN. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig2.jpg" /> Figure 2 moléculaire PCR pour l&#39;identification Anopheles arabiensis C1 et M1, M2 et C2, C3 et M3, M4 et C4 désigner amplicon respectif de relargage &quot;M&quot; et simplifié Chelex extraits d&#39;ADN &quot;C&quot; pour les spécimens de moustiques mêmes;.. AR, Anopheles arabiensiscontrôle positif, L, 100 pb échelle d&#39;ADN. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig3.jpg" /> Figure 3. Détection de points positifs sur Chelex et le relargage des extraits d&#39;ADN pour les échantillons de moustiques sur le terrain, avec des techniques de PCR pour l&#39;identification moléculaire des Anopheles arabiensis (AR) 10, arthropodes gène NADH déshydrogénase 4 (ND4) test de qualité DNA 11, et la résistance aux médicaments antifolate P . falciparum DHFR génotypage 12 (F-M4). Les résultats présentés pour les tests s&#39;exécutent avec ou sans BSA dans le mélange réactionnel. McNemar test du chi carré a été utilisé pour déterminer si les différences entre pour cent des PCR positives à partir d&#39;ADN extrait de la Chelex simplifié et la norme relargage protocoles étaient statistiquement significatives. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3281/3281fig4.jpg" /> <strong&gt; Figure 4. Application du protocole simplifié Chelex dans le génotypage P. infections à P. falciparum chez les moustiques (de l&#39;intestin moyen des données représentées) pour les allèles de résistance aux médicaments. BstN je digestion sur amplicon d&#39;accompagnement codon 108 du P. falciparum gène DHFR 12 montre mutants résistants S108T cycloguanil dans des échantillons de moustiques (M1-M5, l&#39;intestin moyen des données présentées). U, non digérés 522 pb amplicon; FCR3, de laboratoire standard P. clone falciparum contrôle positif portant S108T; K1, P. falciparum standard de laboratoire de contrôle comptable négative cycloguanil clone sensible S108N, L, 100 pb échelle d&#39;ADN.

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Un protocole Chelex simple pour l’extraction de l’ADN d’Anopheles spp. | Immunologie et infection | Vidéo

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Un moyen rapide et abordable pour extraire le parasite du paludisme et de la qualité de l&#39;ADN du vecteur à partir d&#39;échantillons de moustiques est décrite. Capitalisant sur les propriétés de chélation de résine Chelex, la méthode simple permet le génotypage des parasites du paludisme dans les phases de moustiques glandes de l&#39;intestin moyen et salivaires, ainsi que l&#39;identification moléculaire de l&#39;<em&gt; Anopheles</em&gt; Fratrie espèces par PCR.

Un protocole Chelex simple pour l&#39;extraction d&#39;ADN à partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

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54.5K vues.  Malaria Institute at Macha. Un moyen rapide et abordable pour extraire le parasite du paludisme et de la qualité de l'ADN du vecteur à partir d'échantillons de moustiques est décrite. Capitalisant sur les propriétés de chélation de résine Chelex, la méthode simple permet le génotypage des parasites du paludisme dans les phases de moustiques glandes de l'intestin moyen et salivaires, ainsi que l'identification moléculaire de l' Anopheles Fratrie espèces ...

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A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Recherche

Immunologie et infection

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

Hens can be immunized by means of i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume 0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun plasmid-immunization. Dependent on the immunogenicity of the antigen, high antibody-titres (up to 1:100,000 - 1:1,000,000) can be achieved after only one or 3 - 4 boost immunizations. Normally, a hen lays eggs continuously for about 72 weeks, thereafter the laying capacity decreases. This protocol describes the extraction of total IgY from egg yolk by means of a precipitation procedure (PEG. Polson et al. 1980). The method involves two important steps. The first one is the removal of lipids and the second is the precipitation of total IgY from the supernatant of step one. After dialysis against a buffer (normally PBS) the IgY-extract can be stored at -20&deg;C for more than a year. The purity of the extract is around 80 %, the total IgY per egg varies from 40-80 mg, dependent on the age of the laying hen. The total IgY content increases with the age of the hen from around 40 mg/egg up to 80 mg/egg (concerning PEG precipitation). The laying capacity of a hen per year is around 325 eggs. That means a total potential harvest of 20 g total IgY/year based on a mean IgY content of 60 mg total IgY/egg (see Table 1).

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol PEG Precipitation

This protocol describes in particular the extraction of total IgY from egg yolk by means of polyethylene glycol precipitation and gives general information about IgY technology.

Technologie IgY: Extraction d&#39;anticorps de jaune d&#39;œuf de poulet par polyéthylène glycol (PEG) Précipitations

Hens can be immunized by means of  i.m. vaccination (Musculus pectoralis, left and right, injection volume  0.5-1.0 ml) or by means of Gene-Gun ...

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important plant parasitic nematodes. The microscopic second-stage juvenile (J2), molted once in the egg, is the infective stage. The J2s hatch from the eggs, move freely in the soil within a film of water, and locate root tips of suitable plant species. After penetrating the plant root, they migrate towards the vascular cylinder where they establish a feeding site and initiate feeding using their stylets. The multicellular feeding site is comprised of several enlarged multinuclear cells called 'giant cells' which are formed from cells that underwent karyokinesis (repeated mitosis) without cytokinesis. Neighboring pericycle cells divide and enlarge in size giving rise to a typical gall or root knot, the characteristic symptom of root-knot nematode infection. Once feeding is initiated, J2s become sedentary and undergo three additional molts to become adults. The adult female lays 150-250 eggs in a gelatinous matrix on or below the surface of the root. From the eggs new infective J2s hatch and start a new cycle. The root-knot nematode life cycle is completed in 4-6 weeks at 26-28&deg;C.
Here we present the traditional protocol to infect plants, grown in pots, with root-knot nematodes and two methods for high-throughput assays. The first high-throughput method is used for plants with small seeds such as tomato while the second is for plants with large seeds such as cowpea and common bean. Large seeds support extended seedling growth with minimal nutrient supplement. The first high throughput assay utilizes seedlings grown in sand in trays while in the second assay plants are grown in pouches in the absence of soil. The seedling growth pouch is made of a 15.5 x 12.5cm paper wick, folded at the top to form a 2-cm-deep trough in which the seed or seedling is placed. The paper wick is contained inside a transparent plastic pouch. These growth pouches allow direct observation of nematode infection symptoms, galling of roots and egg mass production, under the surface of a transparent pouch. Both methods allow the use of the screened plants, after phenotyping, for crossing or seed production. An additional advantage of the use of growth pouches is the small space requirement because pouches are stored in plastic hanging folders arranged in racks.

High and Low Throughput Screens with Root-knot Nematodes Meloidogyne spp.

Two distinct methods to screen plants with root-knot nematodes are described. The described approaches include high-throughput screens with nematodes in a nondestructive manner facilitating the use of these plants in breeding programs.

Écrans à haut débit et faible avec Les nématodes à galles Meloidogyne spp.</em

Root-knot nematodes (genus Meloidogyne) are obligate plant parasites. They are extremely polyphagous and considered one of the most economically important ...

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully understood and several hypotheses have been put forward, including mechanical obstruction of microvessels by P. falciparum-parasitized red blood cells (pRBC). Indeed, during the intra-erythrocytic stage of its life cycle, P. falciparum has the unique ability to modify the surface of the infected erythrocyte by exporting surface antigens with varying adhesive properties onto the RBC membrane. This allows the sequestration of pRBC in multiple tissues and organs by adhesion to endothelial cells lining the microvasculature of post-capillary venules 1. By doing so, the mature forms of the parasite avoid splenic clearance of the deformed infected erythrocytes 2 and restrict their environment to a more favorable low oxygen pressure 3. As a consequence of this sequestration, it is only immature asexual parasites and gametocytes that can be detected in peripheral blood.
Cytoadherence and sequestration of mature pRBC to the numerous host receptors expressed on microvascular beds occurs in severe and uncomplicated disease. However, several lines of evidence suggest that only specific adhesive phenotypes are likely to be associated with severe pathological outcomes of malaria. One example of such specific host-parasite interactions has been demonstrated in vitro, where the ability of intercellular adhesion molecule-1 to support binding of pRBC with particular adhesive properties has been linked to development of cerebral malaria 4,5. The placenta has also been recognized as a site of preferential pRBC accumulation in malaria-infected pregnant women, with chondrotin sulphate A expressed on syncytiotrophoblasts that line the placental intervillous space as the main receptor 6. Rosetting of pRBC to uninfected erythrocytes via the complement receptor 1 (CD35)7,8 has also been associated with severe disease 9.
One of the most recently described P. falciparum cytoadherence phenotypes is the ability of the pRBC to form platelet-mediated clumps in vitro. The formation of such pRBC clumps requires CD36, a glycoprotein expressed on the surface of platelets. Another human receptor, gC1qR/HABP1/p32, expressed on diverse cell types including endothelial cells and platelets, has also been shown to facilitate pRBC adhesion on platelets to form clumps 10. Whether clumping occurs in vivo remains unclear, but it may account for the significant accumulation of platelets described in brain microvasculature of Malawian children who died from CM 11. In addition, the ability of clinical isolate cultures to clump in vitro was directly linked to the severity of disease in Malawian 12 and Mozambican patients 13, (although not in Malian 14).
With several aspects of the pRBC clumping phenotype poorly characterized, current studies on this subject have not followed a standardized procedure. This is an important issue because of the known high variability inherent in the assay 15. Here, we present a method for in vitro platelet-mediated clumping of P. falciparum with hopes that it will provide a platform for a consistent method for other groups and raise awareness of the limitations in investigating this phenotype in future studies. Being based in Malawi, we provide a protocol specifically designed for a limited resource setting, with the advantage that freshly collected clinical isolates can be examined for phenotype without need for cryopreservation.

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

This method investigates the platelet-mediated clumping phenotype of Plasmodium falciparum-infected erythrocytes (pRBC) in clinical isolates. This is performed by isolating and co-incubating platelet-rich plasma and a suspension of pRBC.

Un protocole simple pour agglutination des plaquettes induite par des<em&gt; Plasmodium falciparum</emLes érythrocytes&gt; infectées dans une ressource Mauvais réglage

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l&#39;analyse des lymphocytes infiltrant

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.

Une approche simple et efficace de construire Mutant Vaccinia vecteurs de virus

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

Combinant l’analyse de l’ADN dans une Extraction de Virion brut avec l’analyse de l’ARN des feuilles infectées pour découvrir de nouveaux génomes de Virus

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Rapid, Safe, and Simple Manual Bedside Nucleic Acid Extraction for the Detection of Virus in Whole Blood Samples

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for the rapid bedside inactivation of the Ebola virus during blood sampling for safe nucleic acid (NA) tests by adding a commercial lysis/binding buffer directly into the vacuum blood collection tubes. Using this bedside inactivation approach, we have developed a safe, rapid, and simplified bedside NA extraction method for the subsequent detection of a virus in lysis/binding buffer-inactivated whole blood. The NA extraction is directly performed in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. 
After the blood is collected into the lysis/binding buffer, the contents are mixed by flipping the tube by hand, and the mixture is incubated for 20 min at room temperature. Magnetic glass particles (MGPs) are added to the tube, and the contents are mixed by flipping the collection tube by hand. The MGPs are then collected on the side of the blood collection tube using a magnetic holder or a magnet and a rubber band. The MGPs are washed three times, and after the addition of elution buffer directly into the collection tube, the NAs are ready for NA tests, such as qPCR or isothermal loop amplification (LAMP), without the removal of the MGPs from the reaction. The NA extraction method is not dependent on any laboratory facilities and can easily be used anywhere (e.g., in field hospitals and hospital isolation wards). When this NA extraction method is combined with LAMP and a portable instrument, a diagnosis can be obtained within 40 min of the blood collection.

Here, we present a protocol for the rapid virus nucleic acid extraction from the virus-inactivated whole blood. The extraction is performed directly in the blood collection tubes and requires no equipment or electricity. The method is not dependent on laboratory facilities and can be used anywhere (e.g., in field hospitals).

Extraction rapide, sûre et Simple acide nucléique chevet manuelle pour la détection des Virus dans des échantillons de sang total

The rapid diagnosis of an infection is essential for the outbreak management, risk containment, and patient care. We have previously shown a method for ...

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Une plate-forme haut débit pour la détection de Salmonella spp /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Analysis of Fecal Microbiota Dynamics in Lupus-Prone Mice Using a Simple, Cost-Effective DNA Isolation Method

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that are not only driven by genetic factors, but also environmental factors that can trigger the onset and/or worsen the disease course. A previously published study on the dynamics of the gut microbiota in lupus-prone MRL/lpr female mice showed how changes of the gut microbiota can alter disease progression. Here, a protocol is described for extracting representative samples from the gut microbiota for studies of autoimmunity. Microbiota samples are collected from the anus and processed, from which the DNA is extracted using a phenol-chloroform method and purified by alcohol precipitation. After PCR is performed, purified amplicons are sequenced using a Next Generation Sequencing platform at Argonne National Laboratory. Finally, the 16S ribosomal RNA gene sequencing data is analyzed. As an example, data obtained from gut microbiota comparisons of MRL/lpr mice with or without CX3CR1 are shown. Results showed significant differences in genera containing pathogenic bacteria such as those in the phylum Proteobacteria, as well as the genus Bifidobacterium, which is considered part of the healthy commensal microbiota. In summary, this simple, cost-effective DNA isolation method is reliable and can help the investigation of gut microbiota changes associated with autoimmune diseases.

This protocol provides a simple, cost-effective DNA isolation method for the analysis of murine gut microbiota alterations during the development of autoimmune disease.

Analyse de la dynamique du microbiote fécal chez les souris sujettes au lupus à l’aide d’une méthode simple et rentable d’isolement de l’ADN

Gut microbiota has an important role in educating the immune system. This relationship is extremely important for understanding autoimmune diseases that ...