Ce travail a été rendu possible grâce au financement du Wellcome Trust. JM (080 964) et SCW (080 948) ont été soutenus par des bourses du Wellcome Trust et DT par une bourse d&#39;affectation spéciale Malawi-Liverpool-Wellcome.

1. Prélèvement Les plaquettes peuvent être facilement activées par la température, l&#39;agitation ou de stockage et par conséquent, ils doivent être manipulés avec soin. L&#39;utilisation de vacutainers pour recueillir le sang de préparation de plaquettes est inévitable dans la plupart des situations cliniques, mais devrait être soigneusement considéré comme aspiration peut causer l&#39;activation plaquettaire. Grâce au protocole clinique utilisée dans notre hôpital de recherche, nos échantillons sont soigneusement recueillis dans vacutainers de citrate de sodium. Nous n&#39;avons pas connu de problèmes avec prématurée activation plaquettaire dans tel ou notre précédente étude 12. Nous recueillons sang pour la préparation des plaquettes de groupe sanguin O + personnes non spécifique pour minimiser l&#39;agrégation de l&#39;antigène de groupe sanguin. Les bailleurs de fonds n&#39;ont pas non plus pris des médicaments dans les 7-10 jours précédents que certains médicaments sont connus pour influencer la fonction plaquettaire. 1.1 Préparation du plasma riche en plaquettes (PRP) <ol><li> Recueillir environ 5 mldu sang total à partir d&#39;un hôte naïf du paludisme ou de 2,5 ml de sang de CM ou le paludisme sévère (SM) des patients dans un Vacutainer citrate de sodium (BD numéro de produit 36276). </li><li> Centrifuger le sang total à 250 g pendant 10 min à température ambiante. Ne pas centrifuger à 4 ° C en températures basses pourraient provoquer des plaquettes à s&#39;agréger. </li><li> Soigneusement transférer le surnageant de pluie dans un tube de 15 ml propre. Plaquettes sont facilement activés par les variations de température et aux chocs physiques et doivent donc être manipulés avec soin. Évitez de secouer ou de mouvements saccadés du tube. </li><li> Utilisez le haematocytometer d&#39;un Neubauer à compter et à régler la suspension plaquettaire&gt; 300 x 10 3 plaquettes / pl pour les donneurs sains et &lt;150 x 10 3 plaquettes / pl de CM et les patients SM aide du tampon 1X de phosphate (pH 7,2-7,4; PBS). Veillez à choisir un facteur de dilution pour faciliter la numération plaquettaire et s&#39;assurer de leur exactitude. </li></ol> Remarque: le paludisme patients ont une numération plaquettaire réduite par rapport aux individus sains 16,17,18. Par conséquent concentrations de plaquettes de CM et de messagerie unifiée sont ajustés selon les numérations plaquettaires moyennes des patients au sein de chaque groupe de diagnostic du paludisme. Le P. falciparum phénotype agglomérante est courante dans les isolats de CM et affiche une forte affinité de liaison par conséquent, les concentrations de plaquettes réduite ne pas affecter la taille du bouquet ou la fréquence puisque la concentration plaquettaire est standardisée pour tous les cas de CM. 1.2 Préparation de plasma pauvre en plaquettes (PPP) <ol><li> Pour obtenir PPP, centrifuger une partie du PRP obtenu ci-dessus à 1500 g pendant 10 min. La majorité des plaquettes sont sédimentées au fond du tube. </li><li> Les deux PRP et PPP peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu&#39;à deux semaines. Idéalement, utiliser des plaquettes fraîches pour le dosage agglutination. Après 8-10 jours la plupart des plaquettes sont susceptibles d&#39;être inactifs et probablement agrégé. </li></ol> 2. Parasite Culture <ol><li> Laver les granulés CGR trois fois avec 5-10 ml RPMI 1640 par centrifugation à 370 g pendant 5 min. Remarque: dans ce protocole toutes les cultures ont commencé à partir d&#39;environ 1 hématocrite ml (PCV) et maintenu à 5% d&#39;hématocrite. Les cultures peuvent être démarrés avec une PCV de CGR et ajustés en conséquence avec RBC non infectés et des médias pour obtenir un hématocrite désiré. </li><li> Placez le pRBC dans un flacon de culture et compléter avec un milieu de culture paludisme niveau de RPMI 1640 supplémenté avec 25 mM d&#39;HEPES, 5% Albumax II ou 10% de sérum et de 40 pg / ml de gentamycine pour atteindre un hématocrite de 5%. </li><li> Perméat des flacons de culture avec un mélange de 92,5% d&#39;azote, 2,5% d&#39;oxygène et 5% de dioxyde de carbone avant de sceller et incubation. Sinon, la méthode de pot bougie étanche à l&#39;air de Trager-Jensen peut être utilisé. </li><li> Pour pRBC obtenu directement à partir de patients, incuber leur flacon de culture à 24-36 heures dans un incubateur à 37 ° C dans 5% de CO 2 pour obtenir parasites matures. NOTE: Most laboratoire et des lignes adaptée à la culture sont très faciles à maintenir en culture dans des conditions normales. Il existe des techniques simples décrites ci-dessous qui peuvent être utilisés pour synchroniser les différents stades parasitaires de conserver le taux de croissance. </li><li> Préparer un frottis sanguin mince comme décrit ci-dessous et examiner maturation du parasite sous un microscope optique. </li></ol> 3. Thin Film sang préparation des lames <ol><li> Placer environ 10 à 15 pl de sang sur une extrémité d&#39;une lame de verre dépoli reposant sur une surface plane. </li><li> Toucher la goutte de sang avec le bord d&#39;une deuxième glissière jusqu&#39;à ce que le sang est uniformément répartie sur le bord de la seconde lame. </li><li> Tout en maintenant la deuxième diapositive à une ° 45 angle, rapidement mais doucement, sans exercer trop de pression sur la première diapositive, faites glisser le sang à travers la première diapositive de faire un film mince filet de sang qui est uniformément répartie. Air sec. </li><li> Plonger la lame dans du méthanol pendant 10 sec. Air sec. </li><li> Plonger la lame dans 2% Giemsa stain pendant au moins 10 min. Rincez abondamment jusqu&#39;à ce que l&#39;eau soit claire. Air sec. </li><li> Examinez diapositive à l&#39;aide d&#39;une lentille d&#39;émulsion huile à 90-100x sur un microscope optique </li></ol> 4. Purification et la synchronisation des stades asexués La purification de P. maturité falciparum pRBC est une étape nécessaire pour le dosage agglutination. En effet, seuls les parasites matures sont capables de se lier aux récepteurs plaquettaires comme il est, à ce stade du cycle de vie que les ligands concernés sont exprimés et dépassent de la surface des érythrocytes infectés. Il existe plusieurs méthodes pour purifier et synchroniser les stades asexués de P. falciparum: stades asexués tardives peuvent être enrichies par gradient de Percoll 19; cellule magnétique tri 20 ou en utilisant le protocole gélatine de sédimentation 21 décrit ici.. Sorbitol-synchronisation sélectionne pour les étapes du cycle 22, après quoi les noyaux sont cultivées pendant 24 à 26 h pour obtenir les stades matures (sans nRéalisation nécessaire pour effectuer flottation gélatine). 4.1 plasmagel Flotation Plasmagel flottation utilise la solution de gélatine comme à sélectionner pour poids inférieur knobbed érythrocytes de rester en solution tandis que les formes et les rosettes en anneau denses coulent au fond. Cette technique donne jusqu&#39;à 90% de pureté des érythrocytes matures stade infectés et peut être utilisé à la fois pour le terrain et les isolats de laboratoire. Cependant, comme mentionné précédemment, plasmagel flottation élimine pRBC rosettes ainsi que les stades immatures qui pourraient aboutir à une fréquence réduite agglutination dans les échantillons présentant une fréquence élevée de rosettes. Toutefois, l&#39;absence de la pRBC rosettes après plasmagel flottation n&#39;affecterait pas le test agglutination parce rosettes est une interaction des érythrocytes CGR et non infectées tandis que l&#39;agglutination est pRBCs médiation contraignant par les plaquettes. Le ligand impliqué dans ces deux traits est différent, avec complément principalement récepteur CR-1 sur les érythrocytes non infectés médiation rosettes.<ol><li> Solution de milieu et Gelofusine Préchauffer II sans sérum / Albumax à 37 ° C dans un bain d&#39;eau. </li><li> Transférer la culture à un tuyau stérile de 15 ml propre et un culot de cellules par centrifugation à température ambiante à 370 xg pendant 5 min. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant afin de ne pas perturber le culot et remettre les cellules dans un volume égal de Gelofusine et un milieu sans protéines. </li><li> Transférer le mélange dans un tube stérile 15 ml et laisser reposer pendant 15-20 min dans un incubateur à 37 ° C ou jusqu&#39;à une ligne de démarcation claire peut être vu entre un niveau supérieur et inférieur. </li><li> Soigneusement transférer la couche supérieure dans un tube stérile 15 ml fraîche et ajouter 10 ml de RPMI frais. </li><li> Centrifuger à 370 g pendant 5 min et jetez soigneusement surnageant. </li><li> Évaluer stade parasitémie et de développement par frottis sanguin mince et d&#39;examiner sous un microscope optique comme décrit dans la section 4. </li></ol> NOTE: Mature gamme pRBC entre 60-90% des érythrocytes infectés depending sur la parasitémie initiale de la culture. Pour un pourcentage élevé de parasites matures, utiliser des cultures avec une parasitémie initiale de ≥ 10%. 5. Agglomérante Assay <ol><li> Utilisez le haematocytometer d&#39;un Neubauer à compter et à régler la suspension pRBC obtenu après flottation plasmagel à 1 x 10 8 pRBC / ul. </li><li> Dans un nouveau tube de 1,5 ml, remettre en suspension pRBC à 5% d&#39;hématocrite, l&#39;acridine orange à 20 pg / ml de concentration finale et PRP à 10% du volume total. Au lieu d&#39;acridine orange, cultures parasitaires peuvent être colorées avec 25 pg / ml de bromure d&#39;éthidium pendant 5 minutes avant de l&#39;utiliser. Par exemple, pour un mélange réactionnel de 200, ajouter 10 ul pRBC mature, 20 pl de 300 x 10 3 plaquettes / pl pour PRP provenant de donneurs sains ou 150 x 10 3 plaquettes / pl de patients SM et 170 pi de milieu exempt de protéines. NOTE: Le rapport de plaquettes: CGR dans les réactions finales est de 20:1. Ceci est important car on permet la maximeum fréquence agglutination d&#39;un échantillon à déterminer. Si le nombre de plaquettes sont ajoutés dans les contrôles alors pas tous pRBCs agglutination pourraient avoir la chance de touffe. </li><li> De la même façon de préparer les commandes suivantes, les globules rouges non infectés et PRP, et CGR avec PPP pour déterminer le rôle des plaquettes dans l&#39;agglutination des pRBCs. </li><li> Transférer la suspension dans un flacon conique ml 1,5-2,0 bouchon à vis. </li><li> Placer le flacon sous agitation douce en roulant à 10-12 min à température ambiante. </li><li> Vérifiez la formation de touffe par une lame humide préparé par pipetage 10 pi de pRBC ± mélange des plaquettes sur une lame de verre, couvrir avec un glissement d&#39;un verre et d&#39;examiner sous fluorescence. </li><li> Le prélèvement peut être effectué à intervalles de 15-20 minutes pour un total de 120 min. Un bloc est considéré comme un agrégat de trois ou plus érythrocytes infectés. </li></ol>

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons décrit un test agglutination des plaquettes médiée utilisé pour l&#39;étude pRBC dans des isolats cliniques directement sur le terrain. Agglutination des plaquettes induite, un comportement caractéristique de P. isolats cliniques falciparum, a été identifié comme un phénotype adhésif distinct, fréquents dans les isolats CD36 contraignantes 12,23-24. Nous avons utilisé ce test pour identifier les trois points principaux: 1) une forte agglutination dans le phénotype in vitro de P. falciparum isolé enfants malawites qui est associé à la gravité de la maladie et le diagnostic 2) de nouveaux récepteurs de mediaties P-sélectine agglutination sur les plaquettes avec CD36, 3) le degré de thrombocytopénie présente chez les patients atteints CM est suffisante pour limiter la formation ultérieure des touffes CGR dans vitro 12. L&#39;implication des plaquettes dans la formation de touffe est démontrée par l&#39;examen d&#39;une préparation humide glissière comme décrit dans la section 6. Les plaquettes peuvent être isolés à partir de PRP par centrifugation à grande vitesseafin de minimiser les réactions antigéniques des groupes sanguins, mais nous avons utilisé toute la PRP afin de minimiser prématuré activation plaquettaire d&#39;une manipulation excessive et de la centrifugation à grande vitesse. L&#39;activité plaquettaire peut être mesurée par un test d&#39;agrégation plaquettaire en utilisant faibles agonistes plaquettaires, l&#39;adrénaline ou l&#39;adénosine diphosphate (ADP) 25 comme décrit dans 26. Il ya plusieurs aspects de l&#39;essai qui ont déjà été mal caractérisées, l&#39;un d&#39;entre eux étant l&#39;importance de la sélection des sources PRP et l&#39;effet des groupes d&#39;antigènes sanguins sur les résultats de l&#39;analyse. Nous avons préparé PRP de personnes qui étaient du groupe sanguin O + et n&#39;avait pas pris de médicaments dans les derniers jours 7-10 avant de sang est prélevé comme certains médicaments peuvent affecter le comportement des plaquettes. D&#39;autres facteurs qui peuvent influer sur l&#39;agglutination succès incluent pRBC hématocrite, les niveaux de parasitémie et la durée de l&#39;essai agglutination. Utiliser hématocrite élevé et co plaquettairesUNT, il serait difficile de dire si le groupe est vraiment une touffe ou si trop de cellules sont simplement assis ensemble parce qu&#39;ils sont denses 15. Généralement agglutination augmente également avec des temps d&#39;incubation plus longs. Ce sont toutes des indications utiles qui devraient être considérés lors de la conception des études en suspension. Nous constatons que les échantillons provenant de différents groupes cliniques peuvent être analysés en parallèle en utilisant PRP provenant du même donneur s&#39;il est possible de le faire, mais dans des contextes de ressources limitées telles que les sites sur le terrain de la piscine de transfusion est généralement limitée. Il est donc difficile d&#39;avoir un seul donateur + O pour standardiser les tests. Nous avons donc identifié plusieurs O + donateurs pour assurer la compatibilité du groupe sanguin mesure du possible. L&#39;utilisation de plusieurs bailleurs de fonds est également utile dans les cas de grandes tailles d&#39;échantillons de sorte que le fardeau du don de sang ne tombe pas sur une seule personne. Les points de prélèvement à 15-20 min sont beaucoup plus réalisable que si une seule person effectue les dosages, ce qui permet des préparations humide diapositives et effectuer cinétique de dosage sans temps d&#39;échantillonnage qui se chevauchent. La plupart des données microscopique est visuel et peu objective, par conséquent, il est important que le comptage des cellules est vérifiée par plus d&#39;une personne. Dans ce cas, la manipulation d&#39;un échantillon à la fois peut permettre une analyse complète de trois à quatre échantillons par jour en fonction de l&#39;efficacité personnelle. Agglutination des plaquettes à médiation peut être effectuée en utilisant les deux isolats cliniques et de laboratoire. Pour les lignes de laboratoire, il est recommandé de CD36 parasites obligatoires sont utilisés pour optimiser les fréquences agglutination. Le dosage peut être couplé avec d&#39;autres tests d&#39;agglutination comme rosettes ou utilisés dans l&#39;agglutination des essais d&#39;inhibition qui permettraient à l&#39;étude des récepteurs sur les plaquettes qui peuvent médier contraignant pRBC, un aspect mal connu et étudié de ce phénotype.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of the reagent</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>RPMI 1640</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>21870-092</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Acridine orange</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>A3568</td>
 <td>10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gelofusine</td>
 <td>B Braun</td>
 <td>Gelofusine</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1 M HEPES</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15630</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycin</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15750045</td>
 <td>50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Albumax</td>
 <td>GIBCO</td>
 <td>1102-037</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sodium citrate vacutainer</td>
 <td>BD</td>
 <td>362760</td>
 <td>4 ml capacity</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Inverted Microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>MD16000 B</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Fluorescent microscope</td>
 <td>Leica</td>
 <td>EL6000</td>
 <td>Contains blue and green light fluorescent filters for acridine orange and ethidium bromide </td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

a simple protocol for platelet-mediated clumping of plasmodium falciparum-infected erythrocytes in a resource poor setting

P. falciparum est responsable de la majorité des infections paludéennes graves. Les mécanismes physiopathologiques qui sous-tendent le neuropaludisme (CM) ne sont pas entièrement comprises et plusieurs hypothèses ont été avancées, notamment une obstruction mécanique des microvaisseaux par P. globules rouges parasités falciparum (CGR). En effet, lors de la phase intra-érythrocytaire de son cycle de vie, P. falciparum a la capacité unique de modifier la surface des érythrocytes infectés par l&#39;exportation des antigènes de surface avec différentes propriétés d&#39;adhérence sur la membrane des globules rouges. Cela permet à la séquestration de CGR dans de nombreux tissus et organes par adhésion aux cellules endothéliales qui tapissent la microvascularisation des veinules post-capillaires 1. Ce faisant, les formes matures du parasite éviter dégagement splénique des globules rouges déformés infectés 2 et limitent leur environnement pour une plus favorable faible pression d&#39;oxygène 3. En conséquence de cette sequestration, il est seulement parasites et les gamétocytes qui peuvent être détectés dans le sang périphérique asexués immatures. Cytoadhérence et la séquestration du pRBC mature pour les nombreux récepteurs de l&#39;hôte exprimées sur des lits microvasculaires survient dans la maladie grave et sans complication. Toutefois, plusieurs éléments de preuve suggèrent que seuls les phénotypes adhésifs spécifiques sont susceptibles d&#39;être associées à des résultats pathologiques graves de paludisme. Un exemple de ces interactions hôte-parasite spécifique a été démontrée in vitro, où la capacité de la molécule-1 d&#39;adhésion intercellulaire pour soutenir liaison de pRBC avec notamment des propriétés adhésives a été liée au développement du neuropaludisme 4,5. Le placenta a également été reconnu comme un site d&#39;accumulation pRBC préférentiel chez les femmes enceintes infectées par le paludisme, avec chondroïtine sulfate A exprimée sur syncytiotrophoblastes qui bordent la chambre intervilleuse placentaire que le récepteur principal 6. Rosettes de pRBC to érythrocytes non infectés par le récepteur du complément 1 (CD35) 7,8 a également été associée à une maladie grave 9. Un des P. décrit plus récemment falciparum phénotypes cytoadhérence est la capacité de la décharge afin de former des touffes à médiation plaquettaire in vitro. La formation de ces amas CGR nécessite CD36, une glycoprotéine exprimée à la surface des plaquettes. Un autre récepteur humain, gC1qR/HABP1/p32, exprimée sur divers types de cellules, y compris les cellules endothéliales et les plaquettes, a également été montré pour faciliter l&#39;adhérence pRBC sur les plaquettes à former des amas 10. Si elles s&#39;agrègent in vivo reste incertain, mais il pourrait expliquer l&#39;accumulation importante de plaquettes décrites dans microvascularisation cérébrale des enfants du Malawi qui sont morts de CM 11. En outre, la capacité d&#39;isolat clinique cultures à s&#39;agglutiner in vitro est directement liée à la gravité de la maladie dans malawite 12 </sup&gt; Et patients mozambicains 13, (mais pas dans malien 14). Avec plusieurs aspects du phénotype agglutination pRBC mal caractérisés, les études actuelles sur ce sujet n&#39;ont pas suivi une procédure standardisée. C&#39;est une question importante en raison de la grande variabilité inhérente connue dans le test 15. Ici, nous présentons une méthode in vitro pour agglutination des plaquettes médiée par P. falciparum avec l&#39;espoir qu&#39;elle fournira une plate-forme pour une méthode cohérente pour les autres groupes et de sensibiliser les limitations à enquêter sur ce phénotype dans les études futures. Étant basé au Malawi, nous fournissons un protocole spécifiquement conçu pour une mise de ressources limitées, avec l&#39;avantage que les isolats cliniques fraîchement récoltées peuvent être examinées pour phénotype sans avoir besoin de cryoconservation.

Un exemple d&#39;un test de touffe plaquettaire induite par l&#39;utilisation d&#39;environ 70% stades matures de P. falciparum après enrichissement par flottation plasmagel est montré à la figure 2. Un bloc est un ensemble de trois ou plus érythrocytes infectés. La coloration à l&#39;acridine orange ou du bromure d&#39;éthidium peut être visualisé par microscopie à fluorescence. L&#39;acridine orange est spectralement semblable à de la fluorescéine, avec un maximum d&#39;excitation à 502 nm et un maximum d&#39;émission à 525 nm (vert), alors que le bromure d&#39;éthidium présente un maximum d&#39;excitation à 493 nm et un maximum d&#39;émission à 620 nm (proche de colorants rhodamine, rouge ). Les bouquets sont facilement repérables au microscope comme sous une lumière normale, ils apparaissent comme des agrégats de cellules et sous fluorescence des taches de vert ou rouge lorsqu&#39;ils sont colorés à l&#39;acridine orange ou éthidium colorants de bromure, respectivement, comme le montre la figure 2 (30 point de temps de minutes en utilisant l&#39;acridine orange ). Plus les amas, plus l&#39;agrégat de cellules apparaît ONUder la lumière normale et plus les taches de vert ou rouge sous fluorescence pour les colorants respectifs. Depuis l&#39;ADN des colorants cible et donc noyaux tache, plaquettes et non infectés RBC ne sont pas détectés par microscopie fluorescente en raison de leur manque de noyaux. Formation aléatoire de petites touffes CGR de 4,7 ± 1,6 pRBCs / touffe surviennent après 30 min. La taille de l&#39;amas augmente de manière significative à une moyenne de&gt; 15 / CGR touffes après une incubation de 120 min avec quelques bouquets contenant de nombreux pRBC / touffe qui ne pouvait être compté visuellement. La fréquence du phénotype agglutination est calculé comme étant le nombre de cellules infectées présentent en touffes / 1000 cellules infectées, compté dans les dosages en double. <img alt="Figure 1" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig1.jpg" /> Figure 1. Le flux de travail agglutination expérience. Plaquettes rich et pauvres plasma (A) et un P. culture érythrocytes infectés par P. falciparum (B) sont préparés et ensuite combiné pour le dosage agglutination (C). <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/4316/4316fig2.jpg" /> Figure 2. Agglutination des globules rouges parasités par P. falciparum laboratoire isoler. touffes formées par HB3 au temps 0, 30 et 120 min en plasma riche en plaquettes (A) et une mauvaise formation de touffe en plasma pauvre en plaquettes (B). Limitations de dosage Il ya des limites qui affectent spécifiquement la fonction plaquettaire ou influence les résultats et la plupart ont déjà été mis en évidence par Arman et Rowe 15. Ici, nous mentionnons quelques-uns des problèmes qui pourraient être rencontrés à différent étapes de l&#39;essai: <ol><li> Adaptation isolats cliniques de la culture in vitro peut être un défi que parfois des périodes de culture plus longs sont nécessaires afin d&#39;atteindre assez parasitémie élevée pour permettre la formation de grumeaux. Avec des taux de variation antigénique élevé dans P. falciparum, le phénotype adhésif de la culture adaptée parasite peut ne pas refléter la population d&#39;origine de l&#39;infection parasite après des périodes prolongées dans la culture. </li><li> Afin d&#39;éviter l&#39;agglutination non spécifique due à des antigènes de groupes sanguins, les donneurs de plaquettes doivent être adaptées pour l&#39;antigène de groupe sanguin avec des isolats cliniques utilisés dans le même essai, ou le groupe d&#39;antigène dans le sang de donneur universel O-utilisé. Toutefois, les personnes atteintes de groupe sanguin O-sont rares dans les sites africains comme le Malawi et plaquettes donc couramment utilisées sont obtenues à partir de sang du groupe O + et les bailleurs de fonds doivent être assorties de groupe sanguin. </li><li> Compter sur un amas de préparation des lames humide est lourde et difficile pour la capture d&#39;image que le cElls sont en mouvement constant. Habituellement, pRBC s&#39;accumuler sur les bords de la lamelle ou ils ont tendance à coller ensemble pour former des touffes de «fausses» qui peuvent être facilement confondus avec de vrais grumeaux. Afin de réduire le mouvement des cellules, permettre aux cellules de sédiments pendant 15 min à température ambiante avant l&#39;analyse. </li><li> Le test agglutination est sensible au temps et donc ne permet qu&#39;un seul échantillon à analyser par personne à la fois pour une précision optimale. Échantillonnage points dans le temps pour deux échantillons différents peut facilement se chevaucher, ce qui entraîne des points de temps d&#39;échantillonnage ne correspondent pas entre les échantillons pour manipuler plus d&#39;un échantillon en même temps. Dans de telles circonstances, le logiciel quantitatif sophistiqué pourrait calculer la taille de touffe ou bien encore des anticorps spécifiques des cellules pourrait être utilisé pour analyser la composition des bouquets. Bien que ces techniques peuvent améliorer considérablement l&#39;importance des données, dans les milieux pauvres en ressources où ce test est susceptible d&#39;être utilisée, ces techniques et de l&#39;équipement ne sont pas facilement disponibles. </li></ol>

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A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

Cette méthode étudie le phénotype agglutination des plaquettes induite par des<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Infectées érythrocytes (CGR) dans les isolats cliniques. Ceci est réalisé en isolant et en co-incubation de plasma riche en plaquettes et d&#39;une suspension de CGR.

Un protocole simple pour agglutination des plaquettes induite par des<em&gt; Plasmodium falciparum</emLes érythrocytes&gt; infectées dans une ressource Mauvais réglage

P. falciparum causes the majority of severe malarial infections. The pathophysiological mechanisms underlying cerebral malaria (CM) are not fully ...

a-simple-protocol-for-platelet-mediated-clumping-plasmodium

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Simple Protocol for Platelet-mediated Clumping of Plasmodium falciparum-infected Erythrocytes in a Resource Poor Setting

18.6K vues.  Malawi-Liverpool-Wellcome Trust Clinical Research Programme. Cette méthode étudie le phénotype agglutination des plaquettes induite par des Plasmodium falciparum Infectées érythrocytes (CGR) dans les isolats cliniques. Ceci est réalisé en isolant et en co-incubation de plasma riche en plaquettes et d'une suspension de CGR.

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Protocol for Production of a Genetic Cross of the Rodent Malaria Parasites

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to successful identification of genes or loci underlying various traits in malaria parasites of rodents1-3 and humans4-6. The malaria parasite Plasmodium yoelii is one of many malaria species isolated from wild African rodents and has been adapted to grow in laboratories. This species reproduces many of the biologic characteristics of the human malaria parasites; genetic markers such as microsatellite and amplified fragment length polymorphism (AFLP) markers have also been developed for the parasite7-9. Thus, genetic studies in rodent malaria parasites can be performed to complement research on Plasmodium falciparum. Here, we demonstrate the techniques for producing a genetic cross in P. yoelii that were first pioneered by Drs. David Walliker, Richard Carter, and colleagues at the University of Edinburgh10.

Genetic crosses in P. yoelii and other rodent malaria parasites are conducted by infecting mice Mus musculus with an inoculum containing gametocytes of two genetically distinct clones that differ in phenotypes of interest and by allowing mosquitoes to feed on the infected mice 4 days after infection. The presence of male and female gametocytes in the mouse blood is microscopically confirmed before feeding. Within 48 hrs after feeding, in the midgut of the mosquito, the haploid gametocytes differentiate into male and female gametes, fertilize, and form a diploid zygote (Fig. 1). During development of a zygote into an ookinete, meiosis appears to occur11. If the zygote is derived through cross-fertilization between gametes of the two genetically distinct parasites, genetic exchanges (chromosomal reassortment and cross-overs between the non-sister chromatids of a pair of homologous chromosomes; Fig. 2) may occur, resulting in recombination of genetic material at homologous loci. Each zygote undergoes two successive nuclear divisions, leading to four haploid nuclei. An ookinete further develops into an oocyst. Once the oocyst matures, thousands of sporozoites (the progeny of the cross) are formed and released into mosquito hemoceal. Sporozoites are harvested from the salivary glands and injected into a new murine host, where pre-erythrocytic and erythrocytic stage development takes place. Erythrocytic forms are cloned and classified with regard to the characters distinguishing the parental lines prior to genetic linkage mapping. Control infections of individual parental clones are performed in the same way as the production of a genetic cross.

Genetic crosses of rodent malaria parasites are performed by feeding two genetically distinct parasites to mosquitoes. Recombinant progeny are cloned from mouse blood after allowing mosquitoes to bite infected mice. This video shows how to produce genetic crosses of Plasmodium yoelii and is applicable to other rodent malaria parasites.

Protocole pour la production d&#39;un croisement génétique des parasites du paludisme des rongeurs

Variation in response to antimalarial drugs and in pathogenicity of malaria parasites is of biologic and medical importance. Linkage mapping has led to ...

Recherche

Immunologie et infection

Genotypic Inference of HIV-1 Tropism Using Population-based Sequencing of V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her viral population uses the CCR5 coreceptor for cellular entry, and not an alternative coreceptor. One approach to tropism testing is to examine the sequence of the V3 region of the HIV envelope, which interacts with the coreceptor.
Methods: Viral RNA is extracted from blood plasma. The V3 region is amplified in triplicate with nested reverse transcriptase-PCR. The amplifications are then sequenced and analyzed using the software, RE_Call. Sequences are then submitted to a bioinformatic algorithm such as geno2pheno to infer viral tropism from the V3 region. Sequences are inferred to be non-R5 if their geno2pheno false positive rate falls below 5.75%. If any one of the three sequences from a sample is inferred to be non-R5, the patient is unlikely to respond to a CCR5-antagonist.

HIV tropism can be inferred from the V3 region of the viral envelope. V3 is PCR amplified in triplicate using nested RT-PCR, sequenced, and interpreted using bioinformatic software. Samples with with 1 or more sequence(s) with low g2P scores are classified as non-R5 virus.

Inférence génotypique de tropisme du VIH-1 en utilisant la population basée séquençage du V3

Background: Prior to receiving a drug from CCR5-antagonist class in HIV therapy, a patient must undergo an HIV tropism test to confirm that his or her ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Mosquitoes are vectors for a number of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites and filarial worms. Laboratories are investigating anti-pathogen components of the innate immune system in disease vector species in the hopes of generating transgenic mosquitoes that are refractory to such pathogens1, 2. The innate immune system of mosquitoes consists of several lines of defense 3. Pathogens that manage to escape the barrier imposed by the epithelium-lined mosquito midgut 4 enter the hemolymph and encounter circulating hemocytes, important cellular components that encapsulate and engulf pathogens 5, 6. Researchers have not found evidence for hematopoietic tissues in mosquitoes and current evidence suggests that the number of hemocytes is fixed at adult emergence and numbers may actually decline as the mosquito ages 7. The ability to properly collect and identify hemocytes from medically important insects is an essential step for studies in cellular immunity. However, the small size of mosquitoes and the limited volume of hemolymph pose a challenge to collecting immune cells. 
Two established methods for collecting mosquito hemocytes include expulsion of hemolymph from a cut proboscis 8, and volume displacement (perfusion), in which saline is injected into the membranous necklike region between the head and thorax (i.e., cervix) and the perfused hemolymph is collected from a torn opening in a distal region of the abdomen 9, 10. These techniques, however, are limited by low recovery of hemocytes and possible contamination by fat body cells, respectively 11. More recently a method referred to as high injection/recovery improved recovery of immunocytes by use of anticoagulant buffers while reducing levels of contaminating scales and internal tissues 11. While that method allows for an improved method of collecting and maintaining hemocytes for primary culture, it entails a number of injection and collecting steps that are not necessary if the downstream goal is to collect, fix and stain hemocytes for diagnostics. Here, we demonstrate our method of collecting mosquito hemolymph that combines the simplicity of perfusion, using anticoagulant buffers in place of saline solution, with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes.

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A simplified yet accurate method to collect and stain mosquito hemocytes is described. Our method combines the simplicity of perfusion with the accuracy of high injection techniques to isolate clean preparations of hemocytes in Aedes mosquitoes. This method facilitates studies requiring knowledge of the types of hemocytes and their abundance.

Un protocole pour le recueil et la coloration hémocytes du moustique Fièvre jaune Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and vector mosquitoes, as an integral part of their control programs1,2,3,4,5. For sustainable establishment of these accurate approaches in operations research to strengthen malaria control and elimination efforts, simple and affordable methods, with parsimonious reagent and equipment requirements are essential6,7,8. Here we present a simple Chelex-based technique for extracting malaria parasite and vector DNA from field collected mosquito specimens.
We morphologically identified 72 Anopheles gambiae sl. from 156 mosquitoes captured by pyrethrum spray catches in sleeping rooms of households within a 2,000 km2 vicinity of the Malaria Institute at Macha. After dissection to separate the head and thorax from the abdomen for all 72 Anopheles gambiae sl. mosquitoes, the two sections were individually placed in 1.5 ml microcentrifuge tubes and submerged in 20 &mu;l of deionized water. Using a sterile pipette tip, each mosquito section was separately homogenized to a uniform suspension in the deionized water. Of the ensuing homogenate from each mosquito section, 10 &mu;l was retained while the other 10 &mu;l was transferred to a separate autoclaved 1.5 ml tube. The separate aliquots were subjected to DNA extraction by either the simplified Chelex or the standard salting out extraction protocol9,10. The salting out protocol is so-called and widely used because it employs high salt concentrations in lieu of hazardous organic solvents (such as phenol and chloroform) for the protein precipitation step during DNA extraction9.
Extracts were used as templates for PCR amplification using primers targeting arthropod mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase (NADH) subunit 4 gene (ND4) to check DNA quality11, a PCR for identification of Anopheles gambiae sibling species10 and a nested PCR for typing of Plasmodium falciparum infection12. Comparison using DNA quality (ND4) PCR showed 93% sensitivity and 82% specificity for the Chelex approach relative to the established salting out protocol. Corresponding values of sensitivity and specificity were 100% and 78%, respectively, using sibling species identification PCR and 92% and 80%, respectively for P. falciparum detection PCR. There were no significant differences in proportion of samples giving amplicon signal with the Chelex or the regular salting out protocol across all three PCR applications. The Chelex approach required three simple reagents and 37 min to complete, while the salting out protocol entailed 10 different reagents and 2 hr and 47 min' processing time, including an overnight step. Our results show that the Chelex method is comparable to the existing salting out extraction and can be substituted as a simple and sustainable approach in resource-limited settings where a constant reagent supply chain is often difficult to maintain.

A Simple Chelex Protocol for DNA Extraction from Anopheles spp.

A rapid and affordable way to extract quality malaria parasite and vector DNA from mosquito specimens is described. Capitalizing on chelating properties of Chelex resin, the simple method enables genotyping of malaria parasites in mosquito mid-gut and salivary gland phases, as well as molecular identification of the Anopheles sibling species by PCR.

Un protocole Chelex simple pour l&#39;extraction d&#39;ADN à partir de<em&gt; Anopheles</em&gt; Spp.

Endemic countries are increasingly adopting molecular tools for  efficient typing, identification and surveillance against malaria parasites and  vector ...

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the &asymp;40% limit, the investigator usually keeps the percentage at around 10%. In many cases it is necessary to isolate the parasite-containing red blood cells (RBCs) from the uninfected ones, to enrich the culture and proceed with a given experiment. 
When P. falciparum infects the erythrocyte, the parasite degrades and feeds from haemoglobin 2, 3. However, the parasite must deal with a very toxic iron-containing haem moiety 4, 5. The parasite eludes its toxicity by transforming the haem into an inert crystal polymer called haemozoin 6, 7. This iron-containing molecule is stored in its food vacuole and the metal in it has an oxidative state which differs from the one in haem 8. The ferric state of iron in the haemozoin confers on it a paramagnetic property absent in uninfected erythrocytes. As the invading parasite reaches maturity, the content of haemozoin also increases 9, which bestows even more paramagnetism on the latest stages of P. falciparum inside the erythrocyte.
Based on this paramagnetic property, the latest stages of P. falciparum infected-red blood cells can be separated by passing the culture through a column containing magnetic beads. These beads become magnetic when the columns containing them are placed on a magnet holder. Infected RBCs, due to their paramagnetism, will then be trapped inside the column, while the flow-through will contain, for the most part, uninfected erythrocytes and those containing early stages of the parasite.
Here, we describe the methodology to enrich the population of late stage parasites with magnetic columns, which maintains good parasite viability 10. After performing this procedure, the unattached culture can be returned to an incubator to allow the remaining parasites to continue growing.

Separation of Plasmodium falciparum Late Stage-infected Erythrocytes by Magnetic Means

The paramagnetic properties of hemozoin are used to isolate late stages of Plasmodium falciparum-infected red blood cells growing in culture. The method is simple and fast and does not affect the subsequent invasive capabilities of the parasites.

Séparation de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Late Phase érythrocytes infectés par des moyens magnétiques

Unlike other Plasmodium species, P. falciparum can be cultured in the lab, which facilitates its study 1. While the parasitemia achieved can reach the ...

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and hepatocellular carcinoma. HCV is an enveloped RNA virus belonging to the family Flaviviridae. Current treatment is not fully effective and causes adverse side effects. There is no HCV vaccine available. Thus, continued effort is required for developing a vaccine and better therapy. An HCV cell culture system is critical for studying various stages of HCV growth including viral entry, genome replication, packaging, and egress. In the current procedure presented, we used a wild-type intragenotype 2a chimeric virus, FNX-HCV, and a recombinant FNX-Rluc virus carrying a Renilla luciferase reporter gene to study the virus replication. A human hepatoma cell line (Huh-7 based) was used for transfection of in vitro transcribed HCV genomic RNAs. Cell-free culture supernatants, protein lysates and total RNA were harvested at various time points post-transfection to assess HCV growth. HCV genome replication status was evaluated by quantitative RT-PCR and visualizing the presence of HCV double-stranded RNA. The HCV protein expression was verified by Western blot and immunofluorescence assays using antibodies specific for HCV NS3 and NS5A proteins. HCV RNA transfected cells released infectious particles into culture supernatant and the viral titer was measured. Luciferase assays were utilized to assess the replication level and infectivity of reporter HCV. In conclusion, we present various virological assays for characterizing different stages of the HCV replication cycle.

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

Un protocole pour l&#39;analyse de l&#39;hépatite C de réplication

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of free merozoites from the blood by phagocytic cells. However assessing the functional efficacy of merozoite specific opsonizing antibodies is challenging due to the short half-life of merozoites and the variability of primary phagocytic cells. Described in detail herein is a method for generating viable merozoites using the E64 protease inhibitor, and an assay of merozoite opsonin-dependent phagocytosis using the pro-monocytic cell line THP-1. E64 prevents schizont rupture while allowing the development of merozoites which are released by filtration of treated schizonts. &#160;Ethidium bromide labelled merozoites are opsonized with human plasma samples and added to THP-1 cells. Phagocytosis is assessed by a standardized high throughput protocol. Viable merozoites are a valuable resource for assessing numerous aspects of P. falciparum biology, including assessment of immune function. Antibody levels measured by this assay are associated with clinical immunity to malaria in naturally exposed individuals. The assay may also be of use for assessing vaccine induced antibodies. &#160;

High Yield Purification of Plasmodium falciparum Merozoites For Use in Opsonizing Antibody Assays

Measuring antibody function is key to understanding immunity to Plasmodium falciparum malaria. This method describes the purification of viable merozoites, and measurement of opsonization-dependent phagocytosis by flow cytometry.

High Yield purification de<em&gt; Plasmodium falciparum</em&gt; Mérozoïtes Pour utilisation en opsonisants Anticorps dosages

Plasmodium falciparum merozoite antigens are under development as potential malaria vaccines. One aspect of immunity against malaria is the removal of ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l&#39;analyse des lymphocytes infiltrant

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The molecular basis of this resistance, which is known to be multifactorial, remains incompletely understood. Recent studies found that the differential expression of erythrocyte microRNAs, once translocated into malaria parasites, affect both gene regulation and parasite growth. These miRNAs were later shown to inhibit mRNA translation by forming a chimeric RNA transcript via 5&#39; RNA fusion with discreet subsets of parasite mRNAs. Here, the techniques that were used to study the functional role and putative mechanism underlying erythrocyte microRNAs on the gene regulation and translational potential of P. falciparum, including the transfection of modified synthetic microRNAs into host erythrocytes, will be detailed.&#160; Finally, a polysome gradient method is used to determine the extent of translation of these transcripts. Together, these techniques allowed us to demonstrate that the dysregulated levels of erythrocyte microRNAs contribute to cell-intrinsic malaria resistance of sickle erythrocytes.

Methods to Investigate the Regulatory Role of Small RNAs and Ribosomal Occupancy of Plasmodium falciparum

Human microRNAs translocate from host erythrocytes to Plasmodium falciparum parasites. Here, the techniques used to transfect synthetic microRNAs into host erythrocytes and isolate all RNAs from P. falciparum are described. In addition, this paper will detail a method of polysome isolation in P. falciparum to determine the ribosomal occupancy and translational potential of parasite transcripts.

Méthodes pour étudier le rôle de réglementation de petits ARN ribosomal et l&#39;occupation des<em&gt; Plasmodium falciparum</em

The genetic variation responsible for the sickle cell allele (HbS) enables erythrocytes to resist infection by the malaria parasite, P. falciparum. The ...

A Simple and Efficient Approach to Construct Mutant Vaccinia Virus Vectors

The CRISPR-associated endonuclease Cas9 can edit particular genomic loci directed by a single guide RNA (gRNA). The CRISPR/Cas9 system has been successfully employed for editing genomes of various organisms. Here we describe a protocol for editing the vaccinia virus (VV) genome in the cytoplasm of VV-infected CV-1 cells using the RNA-guided Cas9. RNA-guided Cas9 induces double-stranded DNA breaks facilitating homologous recombination efficiently and specifically in the targeted site of VV and a transgene can be incorporated into these sites by homologous recombination. By using a site-specific homologous vector with transgene(s), a N1L gene-deleted VV with the red fluorescence protein (RFP) gene incorporated in this region was generated with a successful recombination efficiency 10 times greater than that obtained from the conventional homologous recombination method. This protocol demonstrates successful use of RNA-guided Cas9 system to generate mutant VVs with enhanced efficiency.

Vaccinia virus (VV) has been widely used in biomedical research and the improvement of human health. This article describes a simple, highly efficient method to edit the VV genome using a CRISPR-Cas9 system.