Nombreux sont ceux qui ont contribué à ce travail et la plupart sont de la membrane structurale et fonctionnelle groupe de biologie, les deux membres passés et présents. Pour tout ce que nous adressons nos plus vifs remerciements et son appréciation. Ce travail a été financé en partie par des subventions de la Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), le National Institutes of Health (GM75915, P50GM073210 et U54GM094599), et le 7e PC CM0902 Action COST.

1. Préparation de la plaque de cristallisation Mise en place de faire un essai de cristallisation robot commence par la préparation de la plaque de base de la plaque de cristallisation du verre sandwich (figure 2), décrit en détail dans la référence 2. La plaque de base doit d&#39;abord être traité au silane et le bâton perforé double entretoise qui crée les puits, il faut appliquer à la plaque. Les matériaux et les fournitures nécessaires à cet effet sont détaillés sous la rubrique Matériel. <ol><li> Placez la plaque sur une serviette en papier, appliquer quelques gouttes de solution de silanisation et répartissez sur toute la surface de la plaque avec un mouchoir en papier. </li><li> Retirer l&#39;excès de solution de silanisation par immersion de la plaque dans un récipient rempli d&#39;eau. </li><li> Prenez la plaque de la bécher, placez-le sur une serviette en papier, côté silanisé en place, et sécher la surface exposée en frottant légèrement avec une serviette en papier. </li><li> Retirez le couvercle de protection sur la perforation, double-bâton entretoiseet appliquer l&#39;entretoise, côté adhésif vers le bas, à la surface sèche et silanisée de la plaque de verre. Assurez-vous que l&#39;entretoise est positionné correctement sur la plaque de base, avec le coin supérieur gauche et les deux côtés adjacents de l&#39;entretoise et la plaque, en même temps. </li><li> Utiliser un rouleau ou rouleau-tampon pour aplatir l&#39;entretoise sur la plaque de base et à créer un joint étanche entre eux. </li></ol> Plaques préfabriquées sont disponibles dans le commerce (HR3-151, Hampton Research; MD11-55-100, dimensions moléculaires et LCP96T-UVP70U, Swissci). Pour des raisons de coût, on préfère monter nos propres plaques suivant le protocole ci-dessus. 2. En Méso Robot 1 Le premier robot à méso être démontré dans cet article la vidéo est celle actuellement en usage dans les États membres et FB Group (figure 3). Tous les détails du robot peut être trouvé sous Matériaux et dans l&#39;article 5 de référence. Les matériaux et equipment nécessaire de mettre en place un essai de cristallisation en utilisant le robot sont détaillés sous la rubrique Matériel. <ol><li> Placer la plaque de base avec espacement préparés dans la section 1 sur le pont du robot. Il a sa propre plate-forme marquée avec des positions et à des fins de plaque de base d&#39;alignement. La plaque doit être étiqueté aux fins d&#39;identification. </li><li> Fixer le bloc 96-précipitant ainsi dans sa propre plate-forme sur la plate-forme du robot à côté de la plaque de cristallisation. </li><li> Ouvrez le bloc soigneusement en enlevant le bouchon d&#39;étanchéité en plastique. </li><li> Activer l&#39;humidificateur et diriger le courant d&#39;air humide et de l&#39;autre côté sur la plaque de base sur le pont du robot. L&#39;humidificateur a été montré pour réduire l&#39;évaporation de la solution de précipitant et d&#39;améliorer la reproductibilité de l&#39;autre côté de la plaque 5 cristallisation. Il peut être mis en marche avant de mettre en place une pré-humidifier la zone où l&#39;humidité relative ambiante est faible, ou non, juste avant la distribution de mésophase commence. </li><li> Initialiser le robot en suivant les instructions du fabricant. Instructions spécifiques de l&#39;instrument ne sera pas décrit ici en détail parce que les procédures exactes va changer au fil du temps. Pour l&#39;essentiel, ce qui se produit pendant l&#39;initialisation est que la distribution de mésophase bras du robot est muni d&#39;positions de référence dans trois directions orthogonales X, Y et Z. </li><li> Fixez la mésophase protéines chargées dans une seringue Hamilton, avec distribution d&#39;aiguilles, à Bras 1 du robot (figure 3). Tous les détails de la façon de préparer la mésophase et comment le charger dans la seringue ont été décrits dans les références 3,7-10. </li><li> Retirez le couvercle de protection supérieure de l&#39;entretoise sur la cristallisation plaque de base et alignez les puits de la plaque avec des repères sur la plate-forme de base de la plaque. Remarque, dans le but de cette vidéo, le couvercle de protection a été laissé en place pour aider à la visionneuse lors de l&#39;étape d&#39;alignement. </li><li> Alignez la pointe de l&#39;aiguille de la distribution syringe avec le fond de la couche supérieure et dans le coin gauche de la plaque de cristallisation (puits A1). Ceci est réalisé en ajustant la hauteur des yeux ou de coordonnée Z du bras de distribution tout en regardant la proximité de la pointe de l&#39;aiguille vient au fond du puits. Que la pointe est juste de toucher le fond du puits peut être jugée en déplaçant la plaque de gauche à droite sur la plate-forme tandis que très légèrement le réglage en hauteur du bras de distribution. </li><li> Entrer dans l&#39;ordinateur la coordonnée Z du bras de distribution lorsque les contacts d&#39;extrémité de la plaque. Distribution est programmé pour avoir lieu avec la pointe de l&#39;aiguille 80 micromètres à partir de cette référence Z-position qui correspond à la surface de la plaque de base. </li><li> Position à l&#39;œil nu la pointe de l&#39;aiguille au centre du puits A1. A conserver dans l&#39;ordinateur de contrôle de la référence X, coordonnée Y du bras de distribution lorsque la pointe est centrée. Cette coordonnée est utilisée pour définir le centre des puits restants sur la plaque. </li><li> Prime la seringue en utilisant la commande appropriée sur l&#39;ordinateur du robot afin de s&#39;assurer que mésophase frais remplit l&#39;aiguille de distribution et que les premiers puits et ensuite recevoir leur gamme complète de mésophase. Essuyez mésophase extrudé sur la pointe de l&#39;aiguille avec un mouchoir. </li><li> Démarrez le Robot Run (X-AP) programme d&#39;initier un cycle de rinçage étapes où les conseils précipitants de distribution sur le bras 2 du robot sont lavés et sont prêts à aspirer des solutions à partir du bloc de précipitation. </li><li> Activer l&#39;. Dispenser fonction sur le robot pour mettre en mouvement le chargement séquentiel de puits avec des protéines chargé de mésophase (habituellement 50 nl) d&#39;abord, une colonne de huit puits à la fois, suivie par des solutions précipitants (généralement 800 Nl) Entre les colonnes de chargement, les rendements mésophase bras distributeur à une position de stationnement où l&#39;extrémité de l&#39;aiguille est placée dans une éponge humide pour éviter la mésophase à la pointe de sécher. Le processus de distribution mésophase et précipitant est répété11 fois à travers la plaque jusqu&#39;à ce que la plaque est remplie. Le chargement d&#39;une plaque de 96 puits avec mésophase et précipitant prend 5 minutes à remplir. </li><li> Dès que la plaque est remplie et les bras du robot sont retournés à leurs postes parc, retirez la plaque sur le pont du robot et placez-le sur une surface plane et solide. </li><li> Immédiatement, sceller la plaque avec un couvercle en verre pour minimiser le temps dépendant de changements dans la composition bien. Il est important de veiller à ce que tous les puits 96 sont entièrement recouverts, que le couvre-objet est aligné avec le carré de plaque de base et que aucun des couvre-objet s&#39;étend au-delà de l&#39;empreinte de la plaque de base. Un galet ou rouleau-tampon est utilisé pour créer un joint étanche et un uniforme entre la lamelle et la pièce d&#39;écartement. </li><li> Inspecter la plaque pour s&#39;assurer que la mise en place est allé comme il se doit. Ce que l&#39;on cherche est un &quot;oeuf sur le plat sur une plaque &#39;apparition dans chaque puits. Le jaune de l&#39;oeuf sur le plat correspond à la mésophase. Le blanc de l&#39;œuf est le précipitant solutiet sur le bord de la cuve est le périmètre de la cristallisation bien. Idéalement, les trois sont concentriques. </li><li> Placer la plaque dans une zone de stockage à température contrôlée pour la croissance cristalline. </li><li> Si aucun des plaques plus doivent être mis en place, retirez le bloc précipitant à partir du pont du robot, fermez-le complètement et de le remettre dans le stockage. </li><li> Retirez la seringue contenant la mésophase du bras de distribution du robot, la démonter et laver ses parties, y compris l&#39;aiguille de distribution et la virole, soigneusement avec du méthanol et sec en préparation pour la prochaine utilisation. </li></ol> 3. En Méso Robot 2. Mosquito LCP Le Mosquito LCP robot (figure 4) comprend un distributeur de mésophase similaire à celle utilisée par Robot 1. Contrairement à Robot 1, il distribue précipitant par l&#39;intermédiaire d&#39;embouts jetables. Logiciel de programmation est utilisé pour configurer l&#39;instrument pour travailler avec des plaques de cristallisation particuliers et precipitblocs de fourmis, et pour distribuer des volumes définis par l&#39;utilisateur de mésophase et de précipitation dans un ordre spécifié. Ces détails sont fournis par le fabricant et ne seront pas décrits ici. <ol><li> Préparer une seringue de Hamilton, avec son aiguille et rempli de protéines chargé de mésophase, comme décrit ci-dessus sous robot 1 et à l&#39;article JoVE 1712 1. </li><li> Serrer la seringue en position sur le bras de distribution du robot. </li><li> Utilisez la plate-forme montée capteur laser pour établir les coordonnées X et Y de l&#39;aiguille sur la seringue de distribution. Il s&#39;agit d&#39;une étape importante nécessaire pour s&#39;assurer que la mésophase est distribué avec précision au centre de chaque puits de la plaque. </li><li> Avec le toucher d&#39;un bouton sur le panneau de commande, purger la seringue pour expulser mésophase de l&#39;aiguille. Retirer mésophase extrudé à partir de la pointe de l&#39;aiguille avec un mouchoir en vue de l&#39;utilisation du robot pour charger puits. </li><li> Avant de placer la plaque de cristallisation sur le pont de l&#39;humidité de roboten la surface de la plate-forme avec quelques gouttes d&#39;eau pour aider à maintenir la plaque en place par capillarité. </li><li> Retirez le couvercle de protection de l&#39;entretoise sur la plaque de base en verre et le placer sur sa plate-forme fermement pour assurer une bonne adhérence. Utiliser les trois repères sur la plate-forme pour aligner les 3 puits d&#39;angle, assurant ainsi un positionnement correct des puits de la plaque par rapport à la pointe de l&#39;aiguille de distribution. L&#39;instrument est alors commandé pour entrer dans un cycle de distribution. </li><li> Le cycle commence par une étape d&#39;amorçage seconde où mésophase est distribué sur une petite plaque de verre juste avant de passer à charger puits avec mésophase frais. Les charges mésophase premier robot avec une colonne verticale de 8 puits sur la plaque, puis utilise les embouts jetables pour dispenser solution de précipitant au-dessus du bol mésophase. Le processus est répété 11 fois sur la longueur de la plaque jusqu&#39;à ce que tous les puits sont remplis. L&#39;ensemble du processus prend environ 5 minutes à compléter. </li><li> Enleverla plaque remplie de la plate-forme du robot et de le sceller avec un couvercle en verre comme décrit ci-dessus en vertu de robot 1. </li><li> Placer la plaque, bien marquée, dans un environnement à température contrôlée pour la croissance cristalline. </li></ol> 4. En Méso Robot 3. Gryphon LCP Le Gryphon LCP robot (figure 5) comprend un système de distribution mésophase similaire à celle décrite ci-dessus pour Robot 1 et 2. Ce qui la distingue des deux autres, c&#39;est que les 96 solutions précipitants sont distribués simultanément. <ol><li> Préparer la mésophase protéines charge et chargez-le dans la seringue de distribution, tel que décrit ci-dessus, sous Robots 1 et 2, et à l&#39;article JoVE 1712 1. </li><li> Serrer la seringue en position sur le bras de distribution du robot. </li><li> Placer le bloc de solution de précipitant et de la plaque de cristallisation sur le pont du robot. </li><li> Chargez le hea 96-pointed avec des solutions de précipitation. Défini par l&#39;utilisateur le temps de retard est prévu pour faciliter l&#39;aspiration précipitants visqueux. </li><li> Commander l&#39;appareil pour saisir un cycle de distribution. Le cycle commence avec la mésophase être distribuée de manière séquentielle dans les 96 puits dans un processus qui prend environ 1 minute pour terminer. La tête 96-pointe distribue ensuite tous les 96 solutions précipitant à la fois au-dessus des bolus de mésophase dans les puits de cristallisation. Le processus plaque entière chargement est terminé en 2 min. </li><li> Retirer la plaque remplie à partir de la plate-forme du robot et de le sceller avec un couvercle en verre, comme décrit ci-dessus sous 1 Robot. </li><li> Placer la plaque, bien marquée, dans un environnement à température contrôlée pour la croissance cristalline. </li></ol> 5. Les résultats représentatifs Le but de cet article vidéo est de montrer comment mettre en place des essais de cristallisation automatiquement avec un liquide visqueux, protéine membranaire chargé de mésophase en verre Sandwicplaques de cristallisation h à 96 puits. L&#39;accent est mis sur l&#39;automatisation grâce à l&#39;utilisation de robots spécialisés qui nécessitent un minimum d&#39;intervention manuelle. Reproductibilité et la précision, en termes de volumes de mésophase et précipitant distribuée et la mise en place de l&#39;intérieur du puits, on s&#39;attend quand un robot est utilisé. Elles sont importantes du point de vue d&#39;un dépistage efficace des conditions qui favorisent la cristallogenèse. Ils sont également essentiels pour la prochaine étape dans le pipeline d&#39;analyse qui consiste à évaluer la croissance des cristaux se fait souvent avec l&#39;équipement d&#39;imagerie. Lieu de dépose ou de bolus est essentielle pour le processus d&#39;imagerie, et le placement irrégulier et incorrect de bolus dans le puits nécessite habituellement intervention de l&#39;utilisateur pour corriger et prend du temps. A titre d&#39;illustration, des exemples de plaques correctement et incorrectement chargées sont présentés dans la figure 6. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig1.jpg" alt="Figure 1" /> <html> Figure 1. L&#39;organigramme résume les étapes de la production, de récolte et de cryo-refroidissement à méso-cultivés cristaux de protéines membranaires. Étapes, entourée par la ligne pointillée rouge font l&#39;objet de cet article JoVE. Les robots ont été utilisés pour distribuer des solutions mésophase et précipitant dans les étapes 29-32. De la référence 3. <a href="http://jove.com/files/ftp_upload/4000/4000fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir la figure</a> . <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. A pleine charge et scellé plaque de 96 puits de cristallisation du verre sandwich. Chaque puits contient 50 nl phase cubique et 1 ul de solution de précipitation. Pour plus de clarté, la phase cubique a été coloré avec le rouge Soudan et la solution de précipitant comprend le bleu de méthylène. De la référence 5. _upload/4000/4000fig3.jpg &quot;alt =&quot; Figure 3 &quot;/&gt; Figure 3. Dans méso robot (Robot 1). Le robot a deux bras. Bras 1 dispense le mésophase protéines chargé lipidique. Bras 2 distribue des solutions précipitants. Pendant le remplissage, la plaque 96-puits reste fixe en position sur la plate-forme du robot lui-même qui est à l&#39;arrêt. Les deux bras se déplacent pour offrir des solutions mésophase et de précipitation. De la référence 3. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Le Mosquito LCP robot (Robot 2). Contrairement à Robot 1, le pont de la LCP Mosquito, sur laquelle asseoir la plaque de 96 puits et le bloc de solution de précipitant, se déplace horizontalement pendant le remplissage. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig5.jpg" alt="Figure 5" /> Figure 5. Le Gryphon LCP robot (Robot 3). Au cours d&#39;unemis en place, le distributeur phase lipidique cubique se déplace pour fournir des protéines chargé de mésophase sur la plaque de 96 puits. La plate-forme se traduit ensuite horizontalement afin de positionner la plaque sous la tête de pointe solution de précipitant. Les 96 solutions précipitants sont distribués simultanément. Image provenant du fabricant ( <a href="http://www.artrobbins.com/" target="_blank">http://www.artrobbins.com/</a> ) et étiquetés. <img src="/files/ftp_upload/4000/4000fig6.jpg" alt="Figure 6" /> Figure 6. A pleine charge et scellé de 96 puits en plaque sandwich verre (A) et les puits correctement (B) et mal (C, D) rempli en utilisant le méso en robot (Robot 1). L&#39;étiquette code à barres sur la plaque A est utilisé pour suivre la plaque de la plaque incubateur / appareil d&#39;imagerie. Dans les panneaux de BD, la solution de précipitant et de mésophase sont marquées P et M, respectivement. La attendu &#39;oeuf sur le plat sur une plaque&#39;aspect du puits en B est caractéristique d&#39;un correctement chargé et scellé bien. En C, la précipitation a été distribuée dans le puits de façon irrégulière en une position excentrée et est entré en contact avec l&#39;entretoise. En C, il semblerait aussi que le volume de mésophase est inférieure à ce qu&#39;elle devrait être. Un exemple de chargement incomplet avec une solution de précipitant est représenté sur la D. Pour l&#39;échelle, le diamètre de tous les puits est de 6 mm.

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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cet article, nous avons montré la vidéo comment utiliser un robot pour configurer automatiquement dans des essais de cristallisation méso dans des plaques 96 puits en sandwich verre à l&#39;aide d&#39;une mésophase protéines chargé lipidique. Les robots utilisés dans ce travail ont été spécialement conçus pour inclure une seringue volumétrique en verre pour une distribution précise et reproductible de volumes nanolitre de la mésophase visqueuse et collante, comme décrit à l&#39;origine 7. Exactitude et précision sont des caractéristiques importantes d&#39;un robot. Toutefois, ces caractéristiques sont seulement aussi bon que le degré et la régularité performances du robot qui est évalué et l&#39;étalonnage est effectué. Il va sans dire que les performances du robot doivent être évalués tandis que les plaques individuelles sont mises en place. Il n&#39;est pas approprié de supposer que le robot fonctionne parfaitement et de laisser le robot pour fonctionner sans surveillance. L&#39;opérateur attentif et observateur doit être en position de noter par un bruit ou une apparence quand quelque chose ne fonctionne pas correctement et de le corriger immédiatement. En outre, chaque plaque doit être soigneusement contrôlé par l&#39;oeil de l&#39;uniformité de contenu et dès que la plaque et avant d&#39;être mis de côté pour des essais de cristallisation. Ce ne devrait nécessiter que quelques secondes à réaliser et peut se faire alors que la plaque suivante est en cours de chargement. Remarquant, par exemple, que les puits particuliers ne sont pas correctement rempli peut mettre en évidence le fait qu&#39;une certaine précipitation embout de distribution ne fonctionne pas correctement. Si la livraison de mésophase être considérée comme irrégulière, l&#39;élément pertinent défectueux devra être corrigée immédiatement. En notant ces questions et de faire les ajustements nécessaires au cours de mise en place permettra d&#39;économiser du temps et de matériaux, y compris les lipides et les protéines de membrane précieuse. Si un imageur est utilisé pour suivre la croissance des cristaux, l&#39;exactitude et la précision peut également être surveillée pendant l&#39;imagerie. Par exemple, les problèmes systématiques avec chute rapide ou en boluslieu par l&#39;imageur indiquer que quelque chose ne va pas et que des mesures correctives quelque part en amont dans le protocole est nécessaire. Dans un souci de performances fiables signifie que le robot doit être étalonné sur une base régulière et selon les besoins. Étalonnages devraient inclure volume de précipitation et de mésophase livrés ainsi que le placement de bolus et précipitant dans le puits. Évidemment, là où l&#39;étalonnage doit être fait en utilisant des volumes et des matériaux semblables à celles qui seront utilisées dans les essais effectués pendant la période couverte par l&#39;exercice de contrôle de la qualité. Aussi important que l&#39;étalonnage est donc trop d&#39;avoir en stock un nombre suffisant de pièces de robots et de fournitures. Échecs catastrophiques et inattendue, les blocages et plantages peuvent et se produisent. Dans un tel cas, disposant d&#39;une pointe de livraison de remplacement précipitant, par exemple, peut vouloir dire qu&#39;une préparation de membrane extrêmement précieuse protéine est utilisée comme il se doit etn&#39;est pas gaspillé. Parmi les avantages d&#39;un robot, notamment le fait qu&#39;il fonctionne essentiellement de manière continue et qu&#39;il ne souffre pas d&#39;ou &#39;se plaignent de la «fatigue. Un robot peut également être utilisé dans des conditions qui ne sont pas considérés humain-amical, comme dans l&#39;obscurité, sous un éclairage contrôlé et les conditions environnementales et à des températures extrêmes. Les robots présentés dans cet article ont tous été utilisés dans des conditions ambiantes à ~ 20 ° C. Cependant, il ya des protéines et des projets qui nécessitent températures non ambiantes, de la lumière contrôlée et un oxydant 11,12 ou à un environnement réduisant 13. Tous ces éléments peuvent être pris en compte, avec une relative facilité, quand un robot de cristallisation est utilisé. Dans un article antérieur vidéo JoVE nous a montré comment des essais de cristallisation par la méthode de méso sont mis en place manuellement 1. Le volume minimum de mésophase qui peut être distribuée de manière fiable à la main est limitée by l&#39;acuité visuelle et constante impartialité de la personne mise en place des essais. D&#39;après notre expérience, les volumes de mésophase aussi faibles que 100 nl sont faciles à manipuler. Nous connaissons un laboratoire où le volume par défaut délivrée manuellement est d&#39;environ 40 nl. Cependant, les volumes considérablement plus petites sont possibles en utilisant un robot. Par ailleurs, nous avons montré que les volumes de mésophase aussi faibles que 550 picolitres peut être distribuée de manière robotisée 14. A partir de ce travail, il était clair que la miniaturisation est possible par un robot qui, si elles étaient appliquées, conduiraient à une réduction importante de la quantité de protéine membranaire précieux nécessaire de procéder à un essai de cristallisation. Dans cet article, vidéo, trois robots disponibles dans le commerce ont été utilisés pour démontrer à haut débit cristallisation des protéines de membrane en utilisant mésophases lipidiques. Le premier d&#39;entre eux a été élaboré par le Groupe MS &amp; FB basée sur notre expérience mise en place d&#39;essais manuellement, comme décrit dans JoVE 1712 1. C&#39;est l&#39;instrumentment nous avons le plus familiarité et la majeure partie de l&#39;actuel article est consacré à son utilisation. Les deux autres robots étaient en démonstration dans le groupe MS &amp; FB au moment où l&#39;article a été écrit et les images pertinentes sont incluses ici dans l&#39;intérêt de l&#39;exhaustivité. Les trois robots utilisent beaucoup la mésophase même système de distribution, la caractéristique essentielle est une seringue volumétrique en verre 5,7. Ils diffèrent plus significativement en ce qui concerne la prestation de précipitation. Robots 1 et 2 peut se passer précipitant simultanément dans 8 puits, une colonne unique, sur une plaque de cristallisation à la fois. En revanche, Robot 3 dispense les 96 solutions précipitant en une seule action. Robot 2 est le seul instrument à usage unique précipitants seringue. Il ya des avantages et des inconvénients associés aux différents instruments qui dépendent de l&#39;application particulière; ils ne seront pas élaborés ici. Qu&#39;il suffise de dire que tous les travaux de trois et ont produit des cristaux de moimbrane protéines par la méthode de méso. Les prochaines étapes dans le processus global de détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire sont à la récolte et à la cryo-cool cristaux à partir de plaques mises en place comme décrit dans cet article la vidéo et d&#39;enregistrer et de processus de diffraction des rayons X d&#39;eux. Ces sujets sont traités dans les différents articles de cette série Jove 1,15.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Composants </td></tr><tr><td> Brayer (rouleau) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 50820937 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Seringues étanches au gaz </td><td> Hamilton </td><td> 81030 </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Lamelles de verre </td><td> Marienfeld </td><td> 01029990911 </td><td> Jetable </td></tr><tr><td> Plaques de verre </td><td> Marienfeld </td><td> 1527127092 </td><td> Jetable </td></tr><tr><td> Gryphon LCP Robot </td><td> Art Robbins </td><td> NA </td><td> Outil </td></tr><tr><td> En méso robots </td><td> Anachem / Gilson </td><td> NA </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Cahier de laboratoire </td><td> Divers </td><td> NA </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Mosquito LCP Robot </td><td> TTP Labtech </td><td> NA </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Ruban perforé entretoise double-bâton </td><td> Saunders Corporation (perforés) </td><td> personnalisée </td><td> Jetable </td></tr><tr><td> Solutions précipitants </td><td> Divers </td><td> Divers </td><td> Réactif </td></tr><tr><td> L&#39;eau purifiée </td><td> Millipore </td><td> NA </td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Rain-X </td><td> Entretien automobile Shell </td><td> 80199200 </td><td> Réactif </td></tr><tr><td> Embouts de seringue </td><td> Hamilton </td><td> 7770-020 (calibre 22) </td><td> Outil </td></tr><tr><td> Tissus </td><td> Divers </td><td> Divers </td><td> Jetable </td></tr><tr><td> Bouteille d&#39;eau </td><td> divers </td><td> NA </td><td> Réactif </td></tr></tbody></table>

use of a robot for high-throughput crystallization of membrane proteins in lipidic mesophases

Études structure-fonction des protéines membranaires ayant grandement bénéficier de disponibles en haute résolution des structures 3-D du type prévu par macromoléculaire cristallographie aux rayons X (MX). Une composante essentielle de MX est un approvisionnement régulier de l&#39;idéal de diffraction des cristaux de qualité. Le méso ou lipidique dans la phase cubique (LCP) Méthode de cristallisation de protéines membranaires est l&#39;une des nombreuses méthodes disponibles pour la cristallisation des protéines membranaires. Il fait usage d&#39;une mésophase bicontinue dans laquelle faire croître des cristaux. En tant que méthode, il a eu quelques succès spectaculaires de la fin et a attiré beaucoup d&#39;attention aux nombreux groupes de recherche s&#39;intéressent maintenant à l&#39;utiliser. L&#39;un des défis associés à la méthode, c&#39;est que la mésophase hébergement est extrêmement visqueuse et collante, qui rappelle un dentifrice d&#39;épaisseur. Ainsi, le distribuer manuellement de façon reproductible dans de petits volumes dans des puits de cristallisation exige des compétences, de la patience et une main ferme. Un protocole pour faire juer qui a été développé dans la membrane structurale et fonctionnelle Biologie (MS &amp; FB) 1-3. Articles Jove vidéo décrivant la méthode sont disponibles 1,4. L&#39;approche manuelle pour la mise en place de méso essais a des avantages distincts avec des applications spécialisées, telles que l&#39;optimisation de cristal et dérivatisation. Il ne souffrent cependant d&#39;être une méthode à faible débit. Ici, nous démontrons un protocole pour effectuer des essais de cristallisation méso robotique. Un robot offre les avantages de la rapidité, l&#39;exactitude, la précision, la miniaturisation et être capable de travailler en continu pendant des périodes prolongées dans ce qui pourrait être considéré comme des conditions hostiles, comme dans l&#39;obscurité, dans une atmosphère réductrice ou à des températures basses ou élevées. Un de méso robot, lorsqu&#39;il est utilisé correctement, peut grandement améliorer la productivité de structure des protéines membranaires et de recherche sur la fonction, en facilitant la cristallisation qui est l&#39;une des étapes lentes dul&#39;ensemble du pipeline détermination de la structure. Dans cet article, vidéo, nous démontrons l&#39;utilisation de trois robots disponibles dans le commerce qui peuvent dispenser la mésophase visqueuse et collante partie intégrante de cristallogenèse méso. Le premier robot a été développé dans le MS &amp; FB Group 5,6. Les deux autres sont récemment devenus disponibles et sont incluses ici par souci d&#39;exhaustivité. Un aperçu du protocole abordés dans cet article sont présentés dans la figure 1. Toutes les manipulations ont été effectuées à température ambiante (~ 20 ° C) dans des conditions ambiantes.

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Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Ici est décrit une approche robotique à haut débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques pour une utilisation dans la détermination de la structure macromoléculaire à l&#39;aide cristallographie aux rayons X. Trois robots capables de gérer la protéine visqueuse et collante chargé de mésophase partie intégrante de la méthode sont présentés.

Utilisation d&#39;un robot pour haut-débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques

Structure-function studies of membrane proteins greatly benefit from having available high-resolution 3-D structures of the type provided through ...

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Research

JoVE Journal

Biology

17.4K vues.  Trinity College Dublin. Ici est décrit une approche robotique à haut débit cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidiques pour une utilisation dans la détermination de la structure macromoléculaire à l'aide cristallographie aux rayons X. Trois robots capables de gérer la protéine visqueuse et collante chargé de mésophase partie intégrante de la méthode sont présentés.

Vidéo: Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Crystallizing Membrane Proteins for Structure Determination using Lipidic Mesophases

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the lipidic cubic phase or in meso method. The method has been shown to be quite versatile in that it has been used to solve X-ray crystallographic structures of prokaryotic and eukaryotic proteins, proteins that are monomeric, homo- and hetero-multimeric, chromophore-containing and chromophore-free, and alpha-helical and beta-barrel proteins. Recent successes using in meso crystallization are the human engineered beta2-adrenergic and adenosine A2a G protein-coupled receptors. Protocols are presented for reconstituting the membrane protein into the monoolein-based mesophase, and for setting up crystallizations in the manual mode. Additional steps in the overall process, such as crystal harvesting, are to be addressed in future video articles. The time required to prepare the protein-loaded mesophase and to set up a crystallization plate manually is about one hour.

Herein is described the procedure implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to set up manually crystallization trials of membrane proteins in lipidic mesophases.

Cristallisant protéines membranaires pour déterminer la structure à l&#39;aide mésophases lipidique

A detailed protocol for crystallizing membrane proteins by using lipidic mesophases is described. This method has variously been referred to as the ...

Recherche

Biologie

Assessing Two-dimensional Crystallization Trials of Small Membrane Proteins for Structural Biology Studies by Electron Crystallography

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray crystallography to study structure-function questions of membrane proteins, as well as soluble proteins. Screening for two-dimensional (2D) crystals by transmission electron microscopy (EM) is the critical step in finding, optimizing, and selecting samples for high-resolution data collection by cryo-EM. Here we describe the fundamental steps in identifying both large and ordered, as well as small 2D arrays, that can potentially supply critical information for optimization of crystallization conditions.
By working with different magnifications at the EM, data on a range of critical parameters is obtained. Lower magnification supplies valuable data on the morphology and membrane size. At higher magnifications, possible order and 2D crystal dimensions are determined. In this context, it is described how CCD cameras and online-Fourier Transforms are used at higher magnifications to assess proteoliposomes for order and size.
While 2D crystals of membrane proteins are most commonly grown by reconstitution by dialysis, the screening technique is equally applicable for crystals produced with the help of monolayers, native 2D crystals, and ordered arrays of soluble proteins. In addition, the methods described here are applicable to the screening for 2D crystals of even smaller as well as larger membrane proteins, where smaller proteins require the same amount of care in identification as our examples and the lattice of larger proteins might be more easily identifiable at earlier stages of the screening.

Evaluating two-dimensional (2D) crystallization trials for the formation of ordered membrane protein arrays is a highly critical and difficult task in electron crystallography. Here we describe our approach in screening for and identifying 2D crystals of predominantly small membrane proteins in the range of 15 &#x2013; 90kDa.

L&#39;évaluation des essais de cristallisation bidimensionnelle de protéines membranaires petites pour les études en biologie structurale par cristallographie électronique

Electron crystallography has evolved as a method that can be used either alternatively or in combination with three-dimensional crystallization and X-ray ...

Protein Crystallization for X-ray Crystallography

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The availability of atomic resolution structures provides a deep and unique understanding of protein function, and helps to unravel the inner workings of the living cell. To date, 86% of the Protein Data Bank (rcsb-PDB) entries are macromolecular structures that were determined using X-ray crystallography.
To obtain crystals suitable for crystallographic studies, the macromolecule (e.g. protein, nucleic acid, protein-protein complex or protein-nucleic acid complex) must be purified to homogeneity, or as close as possible to homogeneity. The homogeneity of the preparation is a key factor in obtaining crystals that diffract to high resolution (Bergfors, 1999; McPherson, 1999).
Crystallization requires bringing the macromolecule to supersaturation. The sample should therefore be concentrated to the highest possible concentration without causing aggregation or precipitation of the macromolecule (usually 2-50 mg/ mL). Introducing the sample to precipitating agent can promote the nucleation of protein crystals in the solution, which can result in large three-dimensional crystals growing from the solution. There are two main techniques to obtain crystals: vapor diffusion and batch crystallization. In vapor diffusion, a drop containing a mixture of precipitant and protein solutions is sealed in a chamber with pure precipitant. Water vapor then diffuses out of the drop until the osmolarity of the drop and the precipitant are equal (Figure 1A). The dehydration of the drop causes a slow concentration of both protein and precipitant until equilibrium is achieved, ideally in the crystal nucleation zone of the phase diagram. The batch method relies on bringing the protein directly into the nucleation zone by mixing protein with the appropriate amount of precipitant (Figure 1B). This method is usually performed under a paraffin/mineral oil mixture to prevent the diffusion of water out of the drop.
Here we will demonstrate two kinds of experimental setup for vapor diffusion, hanging drop and sitting drop, in addition to batch crystallization under oil.

The 3-D structure of a molecule provides a unique understanding of how the molecule functions. The principal method for structure determination at near-atomic resolution is X-ray crystallography. Here, we demonstrate the current methods for obtaining three-dimensional crystals of any given macromolecule that are suitable for structure determination by X-ray crystallography.

Cristallisation des protéines pour la cristallographie aux rayons X

Using the three-dimensional structure of biological macromolecules to infer how they function is one of the most important fields of modern biology. The ...

Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are implicated in a multitude of malfunctions and diseases. However, a structural and functional understanding of membrane proteins is strongly lagging behind that of their soluble partners, mainly, due to difficulties associated with their solubilization and generation of diffraction quality crystals. Crystallization in lipidic mesophases (also known as in meso or LCP crystallization) is a promising technique which was successfully applied to obtain high resolution structures of microbial rhodopsins, photosynthetic proteins, outer membrane beta barrels and G protein-coupled receptors. In meso crystallization takes advantage of a native-like membrane environment and typically produces crystals with lower solvent content and better ordering as compared to traditional crystallization from detergent solutions. The method is not difficult, but requires an understanding of lipid phase behavior and practice in handling viscous mesophase materials. Here we demonstrate a simple and efficient way of making LCP and reconstituting a membrane protein in the lipid bilayer of LCP using a syringe mixer, followed by dispensing nanoliter portions of LCP into an assay or crystallization plate, conducting pre-crystallization assays and harvesting crystals from the LCP matrix. These protocols provide a basic guide for approaching in meso crystallization trials; however, as with any crystallization experiment, extensive screening and optimization are required, and a successful outcome is not necessarily guaranteed.

The protocols describe the essential steps for obtaining diffraction quality crystals of a membrane protein starting from reconstitution of the protein in a lipidic cubic phase (LCP), finding initial conditions with LCP-FRAP pre-crystallization assays, setting up LCP crystallization trials and harvesting crystals.

La cristallisation des protéines membranaires dans des mésophases lipidique

Membrane proteins perform critical functions in living cells related to signal transduction, transport and energy transformations, and, as such, are ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane bilayer that surrounds all cells and organelles. Alterations in the function of MPs result in many human diseases and disorders; thus, an intricate understanding of their structures remains a critical objective for biological research. However, structure determination of MPs remains a significant challenge often stemming from their hydrophobicity. 
MPs have substantial hydrophobic regions embedded within the bilayer. Detergents are frequently used to solubilize these proteins from the bilayer generating a protein-detergent micelle that can then be manipulated in a similar manner as soluble proteins. Traditionally, crystallization trials proceed using a protein-detergent mixture, but they often resist crystallization or produce crystals of poor quality. These problems arise due to the detergent&prime;s inability to adequately mimic the bilayer resulting in poor stability and heterogeneity. In addition, the detergent shields the hydrophobic surface of the MP reducing the surface area available for crystal contacts. To circumvent these drawbacks MPs can be crystallized in lipidic media, which more closely simulates their endogenous environment, and has recently become a de novo technique for MP crystallization.
Lipidic cubic phase (LCP) is a three-dimensional lipid bilayer penetrated by an interconnected system of aqueous channels1. Although monoolein is the lipid of choice, related lipids such as monopalmitolein and monovaccenin have also been used to make LCP2. MPs are incorporated into the LCP where they diffuse in three dimensions and feed crystal nuclei. A great advantage of the LCP is that the protein remains in a more native environment, but the method has a number of technical disadvantages including high viscosity (requiring specialized apparatuses) and difficulties in crystal visualization and manipulation3,4. Because of these technical difficulties, we utilized another lipidic medium for crystallization-bicelles5,6 (Figure 1). Bicelles are lipid/amphiphile mixtures formed by blending a phosphatidylcholine lipid (DMPC) with an amphiphile (CHAPSO) or a short-chain lipid (DHPC). Within each bicelle disc, the lipid molecules generate a bilayer while the amphiphile molecules line the apolar edges providing beneficial properties of both bilayers and detergents. Importantly, below their transition temperature, protein-bicelle mixtures have a reduced viscosity and are manipulated in a similar manner as detergent-solubilized MPs, making bicelles compatible with crystallization robots. 
Bicelles have been successfully used to crystallize several membrane proteins5,7-11 (Table 1). This growing collection of proteins demonstrates the versatility of bicelles for crystallizing both alpha helical and beta sheet MPs from prokaryotic and eukaryotic sources. Because of these successes and the simplicity of high-throughput implementation, bicelles should be part of every membrane protein crystallographer&prime;s arsenal. In this video, we describe the bicelle methodology and provide a step-by-step protocol for setting up high-throughput crystallization trials of purified MPs using standard robotics.

Bicelles are lipid/amphiphile mixtures that maintain membrane proteins (MPs) within a lipid bilayer but have unique phase behavior that facilitates high-throughput screening by crystallization robots. This technique has successfully produced a number of high-resolution structures from both prokaryotic and eukaryotic sources. This video describes protocols for generating the lipidic bicelle mixture, incorporating MPs into the bicelle mixture, setting up crystallizations trials (manually as well as robotically) and harvesting crystals from the medium.

Haut débit cristallisation des protéines membranaires en utilisant la méthode lipidique Bicelle

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at atomic resolution. Presently, there is only one way to capture such information as applied to integral membrane proteins (Figure 1), and the complexes they form, and that method is macromolecular X-ray crystallography (MX). To do MX diffraction quality crystals are needed which, in the case of membrane proteins, do not form readily. A method for crystallizing membrane proteins that involves the use of lipidic mesophases, specifically the cubic and sponge phases1-5, has gained considerable attention of late due to the successes it has had in the G protein-coupled receptor field6-21 (<a href="http://www.mpdb.tcd.ie" target="_blank">www.mpdb.tcd.ie</a>). However, the method, henceforth referred to as the in meso or lipidic cubic phase method, comes with its own technical challenges. These arise, in part, due to the generally viscous and sticky nature of the lipidic mesophase in which the crystals, which are often micro-crystals, grow. Manipulating crystals becomes difficult as a result and particularly so during harvesting22,23. Problems arise too at the step that precedes harvesting which requires that the glass sandwich plates in which the crystals grow (Figure 2)24,25 are opened to expose the mesophase bolus, and the crystals therein, for harvesting, cryo-cooling and eventual X-ray diffraction data collection.
The cubic and sponge mesophase variants (Figure 3) from which crystals must be harvested have profoundly different rheologies4,26. The cubic phase is viscous and sticky akin to a thick toothpaste. By contrast, the sponge phase is more fluid with a distinct tendency to flow. Accordingly, different approaches for opening crystallization wells containing crystals growing in the cubic and the sponge phase are called for as indeed different methods are required for harvesting crystals from the two mesophase types. Protocols for doing just that have been refined and implemented in the Membrane Structural and Functional Biology (MS&amp;FB) Group, and are described in detail in this JoVE article (Figure 4). Examples are given of situations where crystals are successfully harvested and cryo-cooled. We also provide examples of cases where problems arise that lead to the irretrievable loss of crystals and describe how these problems can be avoided. In this article the Viewer is provided with step-by-step instructions for opening glass sandwich crystallization wells, for harvesting and for cryo-cooling crystals of membrane proteins growing in cubic and in sponge phases.

Herein is described procedures implemented in the Caffrey Membrane Structural and Functional Biology Group to harvest and cryo-cool membrane protein crystals grown in lipidic cubic and sponge phases for use in structure determination using macromolecular X-ray crystallography.

Cristaux de récolte et de Cryo-refroidissement de protéines membranaires cultivées dans des mésophases lipidiques pour la détermination de la structure par cristallographie macromoléculaire

An important route to understanding how proteins function at a mechanistic level is to have the structure of the target protein available, ideally at ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further biochemical analyses to obtain detailed insights into structure/function relationships. Advances in oligonucleotide- and gene synthesis technology make large-scale mutagenesis strategies increasingly feasible, including the substitution of target residues by all 19 other amino acids. Gain- or loss-of-function phenotypes then allow systematic conclusions to be drawn, such as the contribution of particular residues to catalytic activity, protein stability and/or protein-protein interaction specificity.
In order to attribute the different phenotypes to the nature of the mutation - rather than to fluctuating experimental conditions - it is vital to purify and analyse the proteins in a controlled and reproducible manner. High-throughput strategies and the automation of manual protocols on robotic liquid-handling platforms have created opportunities to perform such complex molecular biological procedures with little human intervention and minimal error rates1-5.
Here, we present a general method for the purification of His-tagged recombinant proteins in a high-throughput manner. In a recent study, we applied this method to a detailed structure-function investigation of TFIIB, a component of the basal transcription machinery. TFIIB is indispensable for promoter-directed transcription in vitro and is essential for the recruitment of RNA polymerase into a preinitiation complex6-8. TFIIB contains a flexible linker domain that penetrates the active site cleft of RNA polymerase9-11. This linker domain confers two biochemically quantifiable activities on TFIIB, namely (i) the stimulation of the catalytic activity during the 'abortive' stage of transcript initiation, and (ii) an additional contribution to the specific recruitment of RNA polymerase into the preinitiation complex4,5,12 . We exploited the high-throughput purification method to generate single, double and triple substitution and deletions mutations within the TFIIB linker and to subsequently analyse them in functional assays for their stimulation effect on the catalytic activity of RNA polymerase4. Altogether, we generated, purified and analysed 381 mutants - a task which would have been time-consuming and laborious to perform manually. We produced and assayed the proteins in multiplicates which allowed us to appreciate any experimental variations and gave us a clear idea of the reproducibility of our results.
This method serves as a generic protocol for the purification of His-tagged proteins and has been successfully used to purify other recombinant proteins. It is currently optimised for the purification of 24 proteins but can be adapted to purify up to 96 proteins.

We describe a method for the affinity-tagged purification of recombinant proteins using liquid-handling robotics. This method is generally applicable to the small-scale purification of soluble His-tagged proteins in a high-throughput format.

À haut débit Affinity Purification de protéines recombinantes-étiquette

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

Biochimique et High Throughput évaluation microscopique de la masse grasse dans<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

A High-throughput Method for Measurement of Glomerular Filtration Rate in Conscious Mice

The measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function assessment. Currently, investigators determine GFR by measuring the level of the endogenous biomarker creatinine or exogenously applied radioactive labeled inulin (3H or 14C). Creatinine has the substantial drawback that proximal tubular secretion accounts for ~50% of total renal creatinine excretion and therefore creatinine is not a reliable GFR marker. Depending on the experiment performed, inulin clearance can be determined by an intravenous single bolus injection or continuous infusion (intravenous or osmotic minipump). Both approaches require the collection of plasma or plasma and urine, respectively. Other drawbacks of radioactive labeled inulin include usage of isotopes, time consuming surgical preparation of the animals, and the requirement of a terminal experiment. Here we describe a method which uses a single bolus injection of fluorescein isothiocyanate-(FITC) labeled inulin and the measurement of its fluorescence in 1-2 &mu;l of diluted plasma. By applying a two-compartment model, with 8 blood collections per mouse, it is possible to measure GFR in up to 24 mice per day using a special work-flow protocol. This method only requires brief isoflurane anesthesia with all the blood samples being collected in a non-restrained and awake mouse. Another advantage is that it is possible to follow mice over a period of several months and treatments (i.e. doing paired experiments with dietary changes or drug applications). We hope that this technique of measuring GFR is useful to other investigators studying mouse kidney function and will replace less accurate methods of estimating kidney function, such as plasma creatinine and blood urea nitrogen.

Measurement of glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard for kidney function assessment. Here we describe a high-throughput method which allows the determination of GFR in conscious mice by using a single bolus injection, determination of fluorescein isothiocyanate (FITC)-inulin in plasma and calculation of GFR by a two-phase exponential decay model.

Une méthode à haut débit pour la mesure de débit de filtration glomérulaire chez des souris conscientes

The measurement of  glomerular filtration rate (GFR) is the gold standard in kidney function  assessment. Currently, investigators determine GFR by ...

High Throughput Microinjections of Sea Urchin Zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of treatment solution is loaded into a microinjection needle that is used to physically inject individual immobilized cells or embryos. Despite the need for initial training to perform this procedure for high-throughput delivery, microinjection offers maximum efficiency and reproducible delivery of a wide variety of treatment solutions (including complex mixtures of samples) into cells, eggs or embryos. Applications to microinjections include delivery of DNA constructs, mRNAs, recombinant proteins, gain of function, and loss of function reagents. Fluorescent or colorimetric dye is added to the injected solution to enable instant visualization of efficient delivery as well as a tool for reliable normalization of the amount of the delivered solution. The described method enables microinjection of 100-400 sea urchin zygotes within 10-15 min.

Microinjection is a common technique used to deliver DNA constructs, mRNAs, morpholino antisense oligonucleotides or other treatments into eggs, embryos, and cells of various species.

À haut débit microinjections oursins zygotes

Microinjection into cells and embryos is a common technique that is used to study a wide range of biological processes. In this method a small amount of ...