Ce travail a été soutenu par des subventions de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (KA1270/3-1/2) et BONFOR (O-112.0040).

1. Animaux Mâles C57BL6 / J souris avec un poids moyen de 25 g ont été obtenus auprès de Harlan Winkelmann (Borchen, Allemagne). Toutes les expériences ont été effectuées en conformité avec la loi fédérale sur la protection des animaux. Les principes des soins des animaux de laboratoire ont été suivies. Les animaux ont été maintenus sur une lumière de 12 h cycle jour / nuit et muni rongeurs disponible dans le commerce chow et à volonté du robinet de l&#39;eau ad. Les animaux doivent être logés au moins 7 jours après l&#39;arrivée dans votre animalerie avant les expériences. Notez que toutes les expériences peuvent être facilement adaptés à des rats ou d&#39;autres espèces et avec de légères modifications dans les modèles animaux de grande taille. 2. Procédure opératoire <ol><li> L&#39;anesthésie est induite et maintenue avec de l&#39;isoflurane (Abbott, Wiesbaden, Allemagne) en oxygène. Après l&#39;apparition des animaux de lieux d&#39;anesthésie en position couchée et extrémités fixes avec du ruban adhésif (Leukosilk, Beiersdorf, Hambourg, Allemagne). </li&gt; <li> Après la désinfection, rasage et chirurgicale de la paroi abdominale, une laparotomie médiane est réalisée sur une longueur de 2 centimètres. Entrez la cavité abdominale par une incision le long de la ligne blanche. Placer les deux écarteurs stériles pour maintenir l&#39;abdomen ouvert. Soigneusement eventerate l&#39;intestin grêle vers la gauche et le placer sur une gaze de coton humide. </li><li> Évacuer tout le contenu luminal l&#39;intestin grêle avec deux applicateurs en coton humide et stérile (MaiMed, Neunkirchen, Allemagne) en appuyant simultanément rouler l&#39;applicateur du pylore le caecum. ATTENTION: Éviter les hémorragies de la paroi de l&#39;intestin grêle ou de lésions des vaisseaux intestinaux. Remettre le tube digestif dans la caverne péritonéale sans tordre pour éviter une ischémie ou une obstruction mécanique et fermer l&#39;incision abdominale à l&#39;aide d&#39;une couche de deux fixes 5/0 en polyamide non résorbables (Ethicon, Norderstedt, Allemagne). </li></ol> 3. Soins postopératoires <ol><li> Après la procédure de placer l&#39;animal sous une lampe chauffante, observing jusqu&#39;à ce qu&#39;il récupère de l&#39;anesthésie. Placez la souris de retour dans sa cage et permettre l&#39;accès à l&#39;eau et de la nourriture. En raison de la propriété d&#39;opioïdes pour influer sur le péristaltisme, nous effectuons une analgésie périopératoire des AINS (par exemple métamizol) dans l&#39;eau potable. </li></ol> 4. Des études fonctionnelles 24 heures après l&#39;IM <ol class="lalpha"><li> Transit gastro-intestinal (TGI) <ol><li> Anesthésier les souris légèrement avec de l&#39;isoflurane dans de l&#39;oxygène 22,5 heures après l&#39;IM. Soigneusement hyperextension de la tête de la souris et tirez la langue avec une pince à bouts ronds. Remplir une seringue de 1 ml avec au moins 100 pi marqué à la fluorescéine dextrane (FITC-dextran, 70.000 MW, Sigma Aldrich, Taufkirchen, Allemagne), connectez-le à un cathéter artériel (Vygon, Ecouen, France) et introduire le cathéter en tant que sonde gastrique dans l&#39;estomac. </li><li> En bref, injecter 100 ml de FITC-dextran et retirer le cathéter. Laissez l&#39;animal éveillé et attendre 90 min. Pendant ce temps, les souris ont accès à la nourriture ou de l&#39;eau. &lt;/ Li&gt; <li> Préparer quinze tubes de 2 ml de filature et de les étiqueter de façon consécutive. </li><li> Euthanasier les souris 90 minutes après gavage et retirez l&#39;ensemble du tractus gastro-intestinal de l&#39;estomac au rectum. Placez l&#39;intestin sur un bloc de polystyrène et d&#39;éviter les étirements. CAVE: Il est essentiel de retirer l&#39;intestin en douceur pour éviter un décalage de liquide FITC-dextran dans le segment voisin. Pour le début, il pourrait être utile d&#39;utiliser des clips au début et à la fin de chaque segment. </li><li> Mesurer la longueur totale de l&#39;intestin grêle et du côlon pleine longueur. Diviser l&#39;intestin grêle en 10 segments égaux de taille en le coinçant au pad polystyrène avec des canules. Diviser le côlon en 3 segments. Vous avez préparé 15 segments (estomac n ° 1), dix segments de taille égale intestin grêle (# 2-11), caecum (# 12) et trois 3 segments de taille égale coliques (# 13-15). </li><li> Transect l&#39;intestin aux positions marquées, le saisir avec une pince et les rincer une fois avec 1,0 ml KHB dans le préalablement préparé containi KHBng 2,0 ml tubes et vortexer vigoureusement pendant 20 secondes. L&#39;estomac et du caecum sont placés directement et couper dans les tubes préparés. Remplir ces tubes avec 1,0 ml KHB, ainsi traces de rinçage contenu luminal de la ciseaux dans les tubes. </li><li> Centrifuger les sondes à 12.000 rcf pendant 5 min à température ambiante dans une centrifugeuse de table. Pendant la centrifugation, préparer 15 autres numérotés consécutivement tubes de 1,5 ml. </li><li> Transférer les surnageants clairs dans le nouveau tube de 1,5 ml et conserver à l&#39;obscurité à 4 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse (étape suivante). Les sondes peuvent être stockées pendant plusieurs jours à 4 ° C sans perte significative du signal FITC. Pour un stockage prolongé ajouter 0,09% Natrium-azide ou stocker à &lt;-18 ° C. </li><li> Pipeter 100 duolets ul des surnageants sur un noir plaque de 96 puits (Greiner Bio One, Frickenhausen, Allemagne). Pipette deux 100 échantillons pi de KHB comme vierge. </li><li> Lire la plaque dans un lecteur de fluorescence (Safire, Tecan, Crailsheim, Allemagne) et de quantifier l&#39;fluorescence à 494 nm (absorption) / 521 nm (émission) de longueur d&#39;onde. Soustraire les valeurs à blanc des échantillons. </li><li> Calculer le centre géométrique (GC) de FITC-dextran de distribution, qui est en fait le centre de gravité de la distribution des marqueurs, par la formule suivante: GC = Σ (% du signal de fluorescence totale par segment numéro de segment *) / 100 </li></ol> Remarque: en multipliant le pourcentage de fluorescence de chaque segment avec son numéro de segment d&#39;une moyenne pondérée de la distribution de marqueur à l&#39;intérieur de l&#39;intestin est évaluée. Ce point est influencée à la fois par la distribution et la distance parcourue par le marqueur, mais n&#39;assume aucune distribution spécifique sous-jacente. 7 La valeur calculée GC est souvent présenté en combinaison avec un graphique montrant la répartition de FITC dextran sur le tractus gastro-intestinal (figure 1A). </li><li> Transit colique <ol><li> Les souris doivent être faiblement anesthésiés avec isoflurane 2% en oxygène. ATTENTION: Assurez-vous que l&#39;animal va se réveiller à moins de 40 sec. </li><li> Examinez attentivement la perméabilité colique par l&#39;insertion d&#39;une sonde de fistule (tige métallique, 2 mm de diamètre) par l&#39;anus dans le côlon. </li><li> Utilisation de la sonde fistule faire avancer une boule en verre de 2 mm 3 cm dans le colon et retirer la sonde immédiatement. Placez la souris dans une cage transparente et commencer à mesurer le temps au bout de la sonde fistule a été retiré du côlon. Gardez un oeil à la souris et arrêter le temps juste après la boule de verre est devenu excrété. </li></ol></li></ol> 5. Analyse histochimique des spécimens isolés ME <ol><li> Midjejunal segments sont découpés dans l&#39;intestin et immergé dans KHB froid dans un plat rempli d&#39;Sylgard. </li><li> Mésentère est épinglée sur le plat avec 0,2 mm d&#39;insectes aiguilles (Outils Fine Science, Heidelberg, Allemagne). </li><li> Couper le segment long de sa frontière mésentérique et étirer à environ 120% de sa longueur et de la largeur. Finaliser la fixation des insectesbroches sur le site en face du mésentère. Rincer la capsule Sylgard soigneusement avec KHB glacée fraîche, ce qui chasse tout le contenu luminal. ME peut désormais séparé mécaniquement de la tunique muqueuse de départ du mésentère. Lors de la préparation remplacer fraîches réfrigérées KHB plusieurs fois. </li><li> Muqueuse séparé peut être un choc congelés dans l&#39;azote liquide pour une analyse plus approfondie ou mis au rebut. </li><li> Fixer le montage isolé ME toute l&#39;éthanol à 100% pendant 10 min à température ambiante. Lavez l&#39;ensemble de montage à trois reprises avec KHB réfrigérés. Remarque: d&#39;autres fixateurs (soit 4% de formaldéhyde, l&#39;acide acétique, l&#39;acétone) peut également être utilisé après avoir testé sa compatibilité avec l&#39;analyse subséquente. </li><li> Les supports ME entières sont prêtes pour la coloration histochimique ou immunhistochemical plus loin: </li></ol><ol class="lalpha"><li> Histochimie: myéloperoxydase (MPO) coloration PMN infiltrés peuvent être examinés par le protocole de coloration MPO suivante. <ol><li> Résoudre 10 mg Hanker Yates réactif (Polyscience Europe, Eppelheim, Allemagne) dans 10 ml KHB et ajouter 100 ul de 3% de H 2 O 2. Préparer la solution fraîchement immédiatement avant l&#39;utilisation et ne pas réutiliser. </li><li> Incuber montures entières pendant 10 min à température ambiante. </li><li> Rincer abondamment avec KHB spécimens froid et incuber pendant 10 min. </li><li> Montez échantillons dans le milieu de montage aqueux (Aquatek, Merck, Darmstadt, Allemagne) Après séchage pendant 2 h à analyser diapositives sous un microscope optique. </li><li> Compter le nombre de cellules dans 5 domaines choisis au hasard et calculer comme MPO cellules positives / mm 2. </li></ol></li><li> Coloration immunohistochimique: En conséquence de la coloration histochimique MPO, colorations immunohistochimiques des montures entières peuvent être effectuées. Principalement, vos protocoles établis coloration immunohistochimique de cultures cellulaires ou des tranches de tissu peut être facilement adapté à une coloration de montage ensemble. Cependant, l&#39;optimisation de la procédure anti spécifiquecorps est fortement recommandé. <ol><li> Couper en morceaux les échantillons x 5 mm 5 et effectuer de coloration dans 2,0 ml rond tubes à centrifuger fond dans ~ 150 pl - 200 ul de solution d&#39;anticorps. </li><li> Fixation et blocage procédure (soit 3% de BSA dans du PBS pendant 1 heure à température ambiante) peut être réalisée dans le «plat Sylgard&quot;. </li><li> Les étapes de lavage dans du PBS ou d&#39;autres tampons peuvent être effectuées dans des plaques 12 puits. </li><li> Transférer les spécimens. Soigneusement avec une pince nettes entre les tubes et les plaques de coloration à laver. </li><li> Après les spécimens lavage final dans la procédure de montage anti-décoloration milieu de montage avec lamelles et d&#39;analyser au microscope à fluorescence. </li></ol></li></ol> 6. Culture organe de ME <ol><li> Tout l&#39;intestin grêle est réséqué 24 heures après l&#39;IM et placé dans KHB froide contenant 200 U / ml de pénicilline G et 100 pg / ml de streptomycine (KHB + P / S). </li><li> Couper le tube digestif en 3 cm de longueur et épingler chaque segment vers le bas pour un Sylgard contenant glaPlat art. </li><li> Retirez le mésentère avec des ciseaux fins et glisser l&#39;intestin sur une aiguille à tricoter. </li><li> Doucement inciser le ME avec une pince forte et enlevez de la sous-muqueuse à l&#39;aide d&#39;un applicateur en coton humide. La tunique muqueuse reste sur l&#39;aiguille à tricoter et peut être congelé pression pour complément d&#39;enquête. La ME est collectée dans le froid KHB + P / S. </li><li> Couper les bandes isolées ME en petits morceaux de 2 à 4 mm de longueur et de la mettre à incuber dans la glace froide KHB + P / S pour une demi-heure et rincer le spécimen à plusieurs reprises. </li><li> Transférer environ 50-60 mg ME (au moins la moitié ME d&#39;un intestin grêle) dans une solution stérile de 24 puits contenant 500 ul plaque de Dulbecco Eagle modifié (DMEM). </li><li> Incuber à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 24 heures Conditions supplémentaires. </li><li> Inspecter les cultures de cellules de contamination bactérienne ou fongique sous un microscope. </li><li> Recueillir le surnageant, ralentit pendant 5 min à 1000 rcf et refroidissement rapide dans l&#39;azote liquide. Pendant ce temps de sécher le muscle tissu sur un tissu propre pendant 30 sec et le poids. </li><li> Les surnageants peuvent être utilisés pour une analyse ultérieure des cytokines libérées (IL-6) par ELISA ou d&#39;autres métabolites (c.-à-nitrite) dans le surnageant en suivant les instructions du fabricant. </li><li> Normaliser les concentrations mesurées en poids de tissus ME. </li></ol> 7. Les résultats représentatifs <ol><li> Études fonctionnelles Le paramètre le plus important pour évaluer la gravité de POI est l&#39;examen de GIT in vivo. Figure 1A montre une distribution typique de FITC dextran le long du tractus gastro-intestinal chez les témoins non traités et manipulés intestinale, souris 24 heures après la chirurgie. «Sham exploité&quot; animaux ont montré un GIT normale avec un centre de calcul géométrique (GC) dans le caecum alors que IM a entraîné un retard significatif de GIT dans le jéjunum proximal (figure 1B) Motricité colique a été porté sur séparément par la mesure de la balle temps excrétion ofa 2 mm boule de verre. Une opération fictive souris montrent un temps d&#39;excrétion de 48 - 200 sec tandis que IM a conduit à une excrétion prolongée de temps entre 470 à 775 sec (figure 1C). </li><li> Des études morphologiques Pour décrire l&#39;inflammation s&#39;étend à l&#39;intérieur des phénotypes ME plusieurs de leucocytes pourraient être analysées à l&#39;aide histochimie ou immunohistochimie. Dans la figure 2A + B une faible présence des PMN dans «opération fictive» des animaux a été observée (39 ± 7 cellules / mm 2). IM de l&#39;intestin grêle a conduit à une forte infiltration des PMN (660 ± 86 cellules / mm 2) par rapport aux souris une opération fictive </li><li> Culture organes ME De nombreux médiateurs inflammatoires libérés par les cellules sont difficiles à détecter dans les lysats tissulaires. Des cultures d&#39;organes de permettre la détection des médiateurs libérés dans le surnageant de culture. Un médiateur représentant POI est NON, qui est aussi un neurotransmetteur inhibiteur majeur dans le tractus gastro-intestinal. 5 NO n&#39;a pas pu être détecté dans des cultures d&#39;organes MEsurnageants ture des animaux témoins non opérés (5 ± 6 uM / 24 h / mg de tissu). Dans une opération fictive (laparotomie) souris basale niveaux de NO de 53 ± 36 pM / 24 h / mg de tissus ont été observées. ME cultures de souris intestinale, manipulées (récoltées 24 heures après la chirurgie) produisent beaucoup plus de NO (2254 ± 853 pM / 24 h / mg de tissus) pendant 24 h de culture d&#39;organes ME (figure 3). </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig1.jpg" /> Figure 1. Effet de la GI sur le GIT (A + B) et de transit colique (C) GIT a été mesurée en pour cent de la non-absorbable marqué à la fluorescéine dextrane dans 15 segments gastro-estomac (Sto), l&#39;intestin grêle (SI 1-9 ), le caecum (Cec) et du côlon (Co) -90 min après l&#39;ingestion. Transit colique a été mesurée par le temps de tirer sur la sonde jusqu&#39;à ce que la fistule excrétion d&#39;une perle de verre de 2 mm. (A) la distribution gastro-intestinales de l&#39;isothiocyanate de fluorescéine dextran après imposture opération ou messagerie instantanée. Chez les animaux une opération fictive de plus le marqueur se trouve dans le caecum ou du côlon proximal par rapport à jéjunum proximal lieu chez les animaux manipulés. Les lignes en pointillé indiquent calculée GC. (B) Calcul de la GC fait preuve d&#39;un ralentissement du transit gastro-intestinal après IM. (C) temps de transit colique a montré un retard significatif chez les souris de messagerie instantanée par rapport aux animaux une opération fictive. GC pour les 15 segments intestinaux sont affichés sous forme de moyenne (n = 5). Temps de transit colique ont été affichées signifie que toutes les valeurs individuelles (n = 6). *** = P &lt;0,001, t de Student-test. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig2.jpg" /> Figure 2. Détection de cellules MPO positifs au sein de l&#39;intestin grêle ME. (A) ME montures entières ont été colorées avec Hanker Yates réactif pour la détection de MPO positifs PMN 24 heures après laparotomie (fictive) ou de la procédure IM. (B) Quantification des cellules positives MPO dans les 5 domaines choisis au hasard par la souris. n = 6 unnimals par groupe. *** = P &lt;0,001, t de Student-test. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4086/4086fig3.jpg" /> Figure 3. Production de NO dans les surnageants de culture de ME. Échantillons musculaires de contrôles non opérés, une opération fictive et souris GI ont été prises 24 heures après l&#39;opération et cultivées pendant 24 heures. Souris non traitées ont montré qu&#39;une très faible production basale de NO. Après laparotomie NO libération est augmentée sans mesurer des différences significatives entre le groupe témoin et souris témoins opérés. 24 heures après l&#39;IM production de NO est considérablement augmenté par rapport à des souris non traitées ou fictive exploités. n = 5 animaux par groupe. *** = P &lt;0,001, 1 ANOVA façon.

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	<li>Wehner, S., Behrendt, F. F., Lyutenski, B. N., Lysson, M., Bauer, A. J., Hirner, A., Kalff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+macrophage+function+prevents+intestinal+inflammation+and+postoperative+ileus+in+rodents.">Inhibition of macrophage function prevents intestinal inflammation and postoperative ileus in rodents.</a> Gut. 56, 176-185 (2007).</li><li>Kalff, J. C., Schwarz, N. T., Walgenbach, K. J., Schraut, W. H., Bauer, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+of+the+intestinal+muscularis:+their+phenotype+and+isolation.">Leukocytes of the intestinal muscularis: their phenotype and isolation.</a> J. Leukoc. Biol. 63, 683-691 (1998).</li><li>Kehlet, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postoperative+ileus.">Postoperative ileus.</a> Gut. 47, iv85-iv86 (2000).</li><li>Wehner, S., Schwarz, N. T., Hundsdoerfer, R., Hierholzer, C., Tweardy, D. J., Billiar, T. R., Bauer, A. J., Kalff, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+IL-6+within+the+rodent+intestinal+muscularis+after+intestinal+surgical+stress.">Induction of IL-6 within the rodent intestinal muscularis after intestinal surgical stress.</a> Surgery. 137, 436-446 (2005).</li><li>Kalff, J. C., Schraut, W. H., Billiar, T. R., Simmons, R. L., Bauer, A. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Une étude comparative analysant les différents niveaux de GI (éventration intestin grêle pendant 10 minutes par rapport doucement l&#39;inspection de l&#39;intestin grêle au moyen de deux applicateurs en coton par rapport à la messagerie instantanée avec évacuation du contenu de l&#39;intestin grêle dans le caecum) a révélé une corrélation entre l&#39;ampleur de la manipulation chirurgicale et POI. En comparaison avec les autres groupes IM a montré la plus grande quantité de leucocytes dans le ME (PNM, le...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif / Equipement </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Ethilon 5/0 </td><td> Ethicon </td><td> 1666H </td></tr><tr><td> Applicateurs en coton </td><td> Estropié </td><td> 71010 </td></tr><tr><td> Cathéter artériel </td><td> Vygon </td><td> 115-798 </td></tr><tr><td> Plaque de 96 puits (noir) </td><td> Greiner Bio One </td><td> 655096 </td></tr><tr><td> boule de verre (2 mm de diamètre) </td><td> Worf </td><td> sur demande </td></tr><tr><td> Broches insectes </td><td> Outils Fine Science </td><td> 26000-25 </td></tr><tr><td> Hanker Yates réactif </td><td> Polyscience </td><td> 560694 </td></tr><tr><td> Aquatek </td><td> Merck </td><td> HC109850 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-604 F </td></tr><tr><td> FITC-dextran (PM 70000) </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 46945-500MG-F </td></tr></tbody></table>

functional assessment of intestinal motility and gut wall inflammation in rodents: analyses in a standardized model of intestinal manipulation

L&#39;inflammation du tube digestif est un motif fréquent pour une variété de maladies humaines. Modèles de recherche animale sont essentielles dans l&#39;étude du complexe cellulaire et moléculaire de la pathologie intestinale. Bien que la muqueuse est souvent l&#39;organe d&#39;intérêt dans de nombreuses maladies inflammatoires, des travaux récents ont montré que la musculeuse externe (ME) est également un organe hautement immunocompétent qui abrite un réseau dense de immunocytes résidents. 1,2 Ces travaux ont été effectués au sein de l&#39;standardisé modèle de manipulation intestinale (GI) qui mène à l&#39;inflammation de la paroi intestinale, essentiellement limitée à la ME. Sur le plan clinique, cette inflammation entraîne troubles de la motilité intestinale prolongée, connu sous le nom iléus postopératoire (POI), qui est une complication fréquente et inévitable après une chirurgie abdominale. 3 L&#39;inflammation est caractérisée par la libération de médiateurs pro-inflammatoires telles que l&#39;IL-6 4 ou d&#39;IL-1β neurotransmetteurs inhibiteurs ou comme nitric azote (NO). 5 Par la suite, un nombre considérable de immunocytes s&#39;extravaser dans le ME, dominé par les polynucléaires neutrophiles (PMN) et les monocytes et enfin maintenir POI 2. durable pendant des jours, cette paralysie intestinale conduit à un risque accru d&#39;aspiration, la translocation bactérienne infectieuses et les complications allant jusqu&#39;à la septicémie et une défaillance organique multiple et provoque une forte charge économique 6. Dans ce manuscrit, nous démontrons le modèle standard de la messagerie instantanée et évaluation in vivo de transit gastro-intestinal (TGI) et de transit colique. En outre, nous démontrons une méthode pour la séparation de la ME de la muqueuse suivie d&#39;une analyse immunologique, ce qui est essentiel de faire la distinction entre les réponses inflammatoires dans ces deux compartiments très immunoactifs paroi intestinale. Toutes les analyses sont facilement transférables à toutes les autres modèles de recherche, affectant la fonction gastro-intestinale.

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Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Iléus postopératoire (POI) est une complication de la chirurgie abdominale conduisant à une morbidité accrue et un séjour prolongé à l&#39;hôpital. Parce que les stratégies prophylactiques ou thérapeutiques font défaut intensification de la recherche est nécessaire. Par conséquent, nous avons établi un modèle de souris standard et possible d&#39;étudier la physiopathologie de POI et d&#39;étudier les options possibles thérapeutiques.

D&#39;évaluation fonctionnelle de la motilité intestinale et inflammation de la paroi intestinale chez les rongeurs: analyses dans un modèle standardisé de la manipulation intestinale

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

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Research

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Medicine

21.9K vues.  University of Bonn. Iléus postopératoire (POI) est une complication de la chirurgie abdominale conduisant à une morbidité accrue et un séjour prolongé à l'hôpital. Parce que les stratégies prophylactiques ou thérapeutiques font défaut intensification de la recherche est nécessaire. Par conséquent, nous avons établi un modèle de souris standard et possible d'étudier la physiopathologie de POI et d'étudier les options possibles thérapeutiques.

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Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

Murin endoscopie pour<em&gt; In Vivo</em&gt; Guérison multimodale d&#39;imagerie de la cancérogenèse et de l&#39;évaluation de la plaie intestinale et l&#39;inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

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Médecine

Murine Model of Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, hypotension, necrotizing enterocolitis, bowel transplantation, trauma and chronic inflammation. Intestinal ischemia-reperfusion (IR) injury is a consequence of acute mesenteric ischemia, caused by inadequate blood flow through the mesenteric vessels, resulting in intestinal damage. Reperfusion following ischemia can further exacerbate damage of the intestine. The mechanisms of IR injury are complex and poorly understood. Therefore, experimental small animal models are critical for understanding the pathophysiology of IR injury and the development of novel therapies.
Here we describe a mouse model of acute intestinal IR injury that provides reproducible injury of the small intestine without mortality. This is achieved by inducing ischemia in the region of the distal ileum by temporally occluding the peripheral and terminal collateral branches of the superior mesenteric artery for 60 min using microvascular clips. Reperfusion for 1 hr, or 2 hr after injury results in reproducible injury of the intestine examined by histological analysis. Proper position of the microvascular clips is critical for the procedure. Therefore the video clip provides a detailed visual step-by-step description of this technique. This model of intestinal IR injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Here we describe the detailed procedure of intestinal ischemia-reperfusion in mice which results in reproducible injury without mortality to encourage the standardization of this technique across the field. This model of intestinal ischemia-reperfusion injury can be utilized to study the cellular and molecular mechanisms of injury and regeneration.

Modèle murin de Intestinal Ischémie-reperfusion

Intestinal ischemia is a life-threatening condition associated with a broad range of clinical conditions including atherosclerosis, thrombosis, ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

Tomographie médiée par fluorescence pour la détection et la Quantification de l’Inflammation intestinale Murine axés sur les macrophages

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Intestinal Stem Cell Isolation and Culture in a Porcine Model of Segmental Small Intestinal Ischemia

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ischemia, when the blood supply and therefore oxygen is decreased to the intestine. This leads to intestinal barrier loss and damage to the underlying tissue. Intestinal stem cells reside at the base of the crypts of Lieberk&#252;hn and are responsible for intestinal renewal during homeostasis and following injury. Ex vivo cell culture techniques have allowed for the successful study of epithelial stem cell interactions by establishing culture conditions that support the growth of three-dimensional epithelial organ-like systems (termed "enteroids" and "colonoids" from the small and large intestine, respectively). These enteroids are composed of crypt and villus-like domains and mature to contain all of the cell types found within the epithelium. Historically, murine models have been utilized to study intestinal injury. However, a porcine model offers several advantages including similarity of size as well as gastrointestinal anatomy and physiology to that of humans. By utilizing a porcine model, we establish a protocol in which segmental loops of intestinal ischemia can be created within a single animal, enabling the study of differing time points of ischemic injury and repair in vivo. Additionally, we describe a method to isolate and culture the intestinal stem cells from the ischemic loops of intestine, allowing for the continued study of epithelial repair, modulated by stem cells, ex vivo.

This protocol will enable readers to successfully establish a porcine model of segmental intestinal ischemia and subsequently isolate and culture intestinal stem cells for the study of epithelial repair following injury.

Isolement de cellules souches intestinales et de la Culture dans un modèle porcin de l’ischémie intestinale segmentaire petit

Intestinal ischemia remains a major cause of morbidity and mortality in human and veterinary patients. Many disease processes result in intestinal ...

Using a Chemical Biopsy for Graft Quality Assessment

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated with an increased survival rate and greater quality of patient&#8217;s life when compared to conventional dialysis. Regrettably, transplantology suffers from a lack of reliable methods for organ quality assessment. Standard diagnostic techniques are limited to macroscopic appearance inspection or invasive tissue biopsy, which do not provide comprehensive information about the graft. The proposed protocol aims to introduce solid phase microextraction (SPME) as an ideal analytical method for comprehensive metabolomics and lipidomic analysis of all low molecular compounds present in kidneys allocated for transplantation. The small size of the SPME probe enables performance of a chemical biopsy, which enables extraction of metabolites directly from the organ without any tissue collection. The minimum invasiveness of the method permits execution of multiple analyses over time: directly after organ harvesting, during its preservation, and immediately after revascularization at the recipient&#8217;s body. It is hypothesized that the combination of this novel sampling method with a high-resolution mass spectrometer will allow for discrimination of a set of characteristic compounds that could serve as biological markers of graft quality and indicators of possible development of organ dysfunction.

The protocol presents utilization of the chemical biopsy approach followed by comprehensive metabolomic and lipidomic analysis for quality assessment of kidney grafts allocated for transplantation.

Utilisation d’une biopsie chimique pour l’évaluation de la qualité de la greffe

Kidney transplantation is a life-saving treatment for a large number of people with end-stage renal dysfunction worldwide. The procedure is associated ...

Standardized Histomorphometric Evaluation of Osteoarthritis in a Surgical Mouse Model

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, primarily in the hip and knee joints, which results in significant impacts on patient mobility and quality of life. To date, there are no existing curative therapies for OA able to slow down or inhibit cartilage degeneration. Presently, there is an extensive body of ongoing research to understand OA pathology and discover novel therapeutic approaches or agents that can efficiently slow down, stop, or even reverse OA. Thus, it is crucial to have a quantitative and reproducible approach to accurately evaluate OA-associated pathological changes in the joint cartilage, synovium, and subchondral bone. Currently, OA severity and progression are primarily assessed using the Osteoarthritis Research Society International (OARSI) or Mankin scoring systems. In spite of the importance of these scoring systems, they are semiquantitative and can be influenced by user subjectivity. More importantly, they fail to accurately evaluate subtle, yet important, changes in the cartilage during the early disease states or early treatment phases. The protocol we describe here uses a computerized and semiautomated histomorphometric software system to establish a standardized, rigorous, and reproducible quantitative methodology for the evaluation of joint changes in OA. This protocol presents a powerful addition to the existing systems and allows for more efficient detection of pathological changes in the joint.

The current protocol establishes a rigorous and reproducible method for quantification of morphological joint changes that accompany osteoarthritis. Application of this protocol can be valuable in monitoring disease progression and evaluating therapeutic interventions in osteoarthritis.

Évaluation histomorphométrique normalisée de l’arthrose dans un modèle chirurgical de souris

One of the most prevalent joint disorders in the United States, osteoarthritis (OA) is characterized by progressive degeneration of articular cartilage, ...

A Murine Model of Fetal Exposure to Maternal Inflammation to Study the Effects of Acute Chorioamnionitis on Newborn Intestinal Development

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing enterocolitis (NEC). However, a mechanistic link between these two conditions remains yet to be discovered. We have adopted a murine model of chorioamnionitis involving lipopolysaccharide (LPS)-induced fetal exposure to maternal inflammation (FEMI). This model of FEMI induces a sterile maternal, placental, and fetal inflammatory cascade, which is also present in many cases of clinical chorioamnionitis. Although models exist that utilize live bacteria and more accurately mimic the pathophysiology of an ascending infection resulting in chorioamnionitis, these methods may cause indirect effects on development of the immature intestinal tract and the associated developing microbiome. Using this protocol, we have demonstrated that LPS-induced FEMI results in a dose-dependent increase in pregnancy loss and preterm birth, as well as disruption of normal intestinal development in offspring. Further, we have demonstrated that FEMI significantly increases intestinal injury and serum cytokines in offspring, while simultaneously decreasing goblet and Paneth cells, both of which provide a first line of innate immunity against intestinal inflammation. Although a similar model of LPS-induced FEMI has been used to model the association between chorioamnionitis and subsequent abnormalities of the central nervous system, to our knowledge, this protocol is the first to attempt to elucidate a mechanistic link between chorioamnionitis and later perturbations in intestinal development as a potential link between chorioamnionitis and NEC.

We developed a model of chorioamnionitis to simulate fetal exposure to maternal inflammation (FEMI) without complications of live organisms to examine the effects of FEMI on development of the offspring&#8217;s intestinal tract. This allows for study of mechanistic causes for development of intestinal injury following chorioamnionitis.

Un modèle murin d’exposition foetale à l’inflammation maternelle pour étudier les effets de la chorioamnionite aiguë sur le développement intestinal nouveau-né

Chorioamnionitis is a common precipitant of preterm birth and is associated with many of the morbidities of prematurity, including necrotizing ...

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable health and financial burden on individuals and society. Therefore, it is critical to investigate the mechanisms underlying the pathogenesis and development of IBD. Here, a gut microbiota antigen-specific T cell transfer colitis model is described. CBir1 flagellin has been recognized as the immunodominant gut bacterial antigen in experimental colitis and patients with Crohn&#39;s disease. CBir1 TCR transgenic na&#970;ve CD4+ T cells, specific to CBir1 flagellin, can induce chronic colitis after adoptive transfer into immune-deficient Rag1-/- mice. The disease severity is assessed by histopathology. The CD4+ T cell phenotypes in colonic lamina propria are also determined. This model closely resembles the development of IBD, which provides an ideal murine model for investigating the mechanisms driving the pathogenesis of IBD and testing the potential drugs for treating IBD.

Induction of Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of CBir1 TCR Transgenic CD4+ T Cells to Immunodeficient Mice

In this protocol, a gut microbiota antigen-specific T cell adoptive transfer colitis model is described. CD4+ T cells are isolated from CBir1 TCR transgenic mice. These are specific for an immunodominant gut microbiota antigen CBir1 flagellin, which is transferred into recipient Rag1-/- mice, leading to intestinal inflammation.

Induction de l’inflammation intestinale par transfert adoptif de lymphocytes T CD4+ transgéniques CBir1 TCR à des souris immunodéficientes

With the increase of incidence, inflammatory bowel diseases (IBD), which are chronic diseases affecting the gastrointestinal tract, impose a considerable ...

Isolation of Murine Intestinal Mesenchyme Resulting in a High Yield of Telocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, fibroblasts, myofibroblasts, smooth muscle cells, immune cells, and the recently identified cell type, telocytes. Telocytes are unique mesenchymal cells with long cytoplasmic processes, reaching a distance of tens to hundreds of microns from the cell body. Telocytes have recently emerged as an important intestinal stem cell niche component, providing Wnt proteins that are essential for stem and progenitor cell proliferation.
Although protocols on how to isolate mesenchyme from the mouse intestine are available, it is not clear whether these procedures allow the efficient isolation of telocytes. Isolating telocytes efficiently requires special protocol adjustments that would allow dissociation of the strong cell-cell contact between telocytes and neighboring cells without affecting their viability. Here, available intestinal mesenchyme isolation protocols were adjusted to support the successful isolation and culture of mesenchyme containing a relatively high yield of viable single-cell telocytes.
The obtained single-cell suspension can be analyzed by several techniques, such as immunostaining, cell sorting, imaging, and mRNA experiments. This protocol yields mesenchyme with sufficiently conserved antigenic and functional properties of telocytes, and can be used for several applications. For example, they can be used for co-culture with mouse- or human-derived organoids to support organoid growth with no growth factor supplementation, to better reflect the situation in the original tissue.

Here, we present a protocol to isolate murine intestinal mesenchyme, including telocytes. These can be used for several applications, such as co-culture with mouse or human-derived organoids, to support growth and better reflect the situation in the original tissue.

Isolement du mésenchyme intestinal murin entraînant un rendement élevé en télocytes

The murine small intestine, or colon mesenchyme, is highly heterogenous, containing distinct cell types including blood and lymphatic endothelium, nerves, ...

Manipulation standardisée du Tuina pour l’arthrose du genou chez le rat

Tuina Manipulation to Reduce Inflammation and Cartilage Loss in Knee Osteoarthritis Rats

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its mechanism. Therefore, the manipulation of animal models of knee osteoarthritis is critical. This protocol provides a standard process for Tuina manipulation on KOA rats and a preliminary exploration of the mechanism of Tuina for KOA. The press and kneading manipulation method (a kind of Tuina manipulation that refers to pressing and kneading the specific area of the body surface) is applied on 5 acupoints around the knee joint of rats. The force and frequency of the manipulation were standardized by finger pressure recordings, and the position of the rat during manipulation is described in detail in the protocol. The effect of manipulation can be measured by pain behavior tests and microscopic findings in synovial and cartilage. KOA rats showed significant improvement in pain behavior. The synovial tissue inflammatory infiltration was reduced in the Tuina group, and the expression of tumor necrosis factor (TNF)-&#945; was significantly lower. Compared to the control group, chondrocyte apoptosis was less in the Tuina group. This study provides a standardized protocol for Tuina manipulation on KOA rats and preliminary proof that the therapeutic effects of Tuina may be related to reducing synovial inflammation and delayed chondrocyte apoptosis.

Pleins feux sur l’auteur : Comprendre le mécanisme de manipulation du tuina chez le rat 

We present a protocol for Tuina manipulation performed on plaster-immobilized-induced knee osteoarthritis rats. Based on the preliminary results, it suggested that the efficacy of the method relied on the reduction of inflammation and cartilage loss.

Manipulation du tuina pour réduire l’inflammation et la perte de cartilage chez les rats souffrant d’arthrose du genou

Clinical trials suggest that Tuina manipulation is effective in treating knee osteoarthritis (KOA), while further studies are required to discover its ...