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1. Isolement des mitochondries de cœur de souris <ol><li> Pour isoler les mitochondries cardiaques, anesthésier et le sacrifice des souris, selon les procédures en vigueur de protection des animaux et du Comité institutionnel locale utilisation. </li></ol> Remarque: Toutes les étapes du protocole d&#39;isolement des mitochondries doivent être effectuées sur la glace. Utiliser des tampons glacées et pré-réfrigérés boîtes de Pétri, tubes et tubes Falcon Eppendorf. Les volumes indiqués dans le protocole sont pour un échantillon contenant 2 coeurs de souris. <ol start="2"><li> Retirez les cœurs, les placer dans le tampon d&#39;isolation froid mitochondries (300 mM de saccharose, 10 mM de Na-HEPES, 200 pM d&#39;EDTA, pH 7,4) et rincer le sang. </li></ol> Note: Pour des résultats optimaux, le pH des tampons mitochondriales doit être ajusté avec KOH et l&#39;acide acétique. <ol start="3"><li> Placer les coeurs sur un plat froid Petri, enlever la graisse et les oreillettes, et émincer finement à l&#39;aide d&#39;une lame jusqu&#39;à obtenirtion d&#39;un produit homogène. </li><li> Transfert cœur hachées dans un tube Falcon de 50 ml, ajouter 10 ml de tampon d&#39;isolement mitochondries avec 0,1 mg / ml de trypsine et de permettre à l&#39;échantillon à digérer sur la glace pendant 10 min. </li></ol> Remarque: La trypsine pendant la procédure d&#39;isolement augmente le rendement des mitochondries isolées et doit être maintenue constante entre les préparations mitochondriales. Nous recommandons de tester les fonctions mitochondriales sur les préparations isolées, c&#39;est l&#39;absence de trypsine afin de s&#39;assurer que l&#39;enzyme ne pas interférer avec la fonctionnalité. <ol start="5"><li> Ajouter 10 ml de tampon d&#39;isolement mitochondries avec 0,1% d&#39;acides gras libres BSA et 5 mg d&#39;inhibiteur de trypsine (soja) et mélanger par inversion fois le tube plusieurs pour neutraliser la trypsine. </li></ol> Remarque: tampon d&#39;isolement mitochondries peuvent être préparés à l&#39;avance et peuvent être conservés à -20 ° C. Vérifier le pH lors de la décongélation. Trypsine, inhibiteur de la trypsine ou de BSA doit être undded dans le tampon d&#39;isolement Mitochondries le jour de l&#39;expérience. <ol start="6"><li> Récupérez le tissu digéré par centrifugation à faible vitesse et à moyen pendant 1 min à 4 ° C. </li><li> Tissus Resuspendre dans 8 ml de tampon d&#39;isolement mitochondries avec des acides gras libres 0,1% de BSA et homogénéiser à l&#39;aide d&#39;un homogénéisateur Dounce motorisé avec un pilon en téflon (4-6 passes à 1,200-14,00 rpm). Conserver l&#39;échantillon sur la glace tout en homogénéisant. </li><li> Transfert homogénat dans un tube Falcon de 15 ml et centrifuger à 800xg pendant 10 min à 4 ° C à noyaux granulés et les débris de tissu. </li><li> Récupérer le surnageant contenant les mitochondries dans des tubes Eppendorf et centrifuger à 8000 xg pendant 15 min, à 4 ° C. </li><li> Retirez soigneusement la couche supérieure blanche et laver le culot contenant plus sombre restant de la mitochondrie dans 1 ml de tampon d&#39;isolement mitochondries. </li><li> Centrifuger à 8000xg pendant 15 min à 4 ° C. Rejeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans la mitochondrie 150 pi Isola mitochondrialtion tampon. Gardez mitochondries sur la glace pour d&#39;autres essais. </li></ol> Remarque: Pour obtenir de meilleurs résultats lors des tests fonctionnels, utiliser des mitochondries dans les 4 heures de l&#39;isolement. <ol start="12"><li> Quantifier les protéines mitochondriales en utilisant le dosage de Bradford. </li></ol> 2. Contrôle de la qualité des mitochondries isolées 2,1. Mesure du rapport de contrôle respiratoire (RCR) <ol><li> Étalonner l&#39;électrode à oxygène avec Oxytherm eau saturée d&#39;air pour établir la conduite d&#39;oxygène maximale. Quand un niveau stable d&#39;oxygène est obtenue, ajouter 100 ul d&#39;une solution fraîchement préparée une solution à 10 mM de sodium hydrosulfite de mettre en place la ligne zéro oxygène. Effectuer des mesures à 30 ° C. </li><li> Ajouter 2 ml de tampon de respiration mitochondries (125 mM de KCl, 20 mM d&#39;HEPES, MgCl2 3 mM, EGTA 400 uM, 300 uM DTT 5 mM KH 2 PO 4, pH 7,2) avec 1 uM roténone à la chambre Oxytherm, sceller la chambre et enre débutding. </li><li> Lorsque le signal d&#39;oxygène est stable, ajouter 250 mg mitochondries et enregistrer la respiration basale pendant 1 min. La respiration à ce point devrait être très faible, comme les mitochondries sont respirants sur des substrats endogènes (respiration Etat 1). </li><li> Ajouter 5 mM de succinate et de signal d&#39;enregistrement pendant 1 min. La consommation d&#39;oxygène devrait augmenter au cours de la respiration Etat 2. </li><li> Induire la respiration État 3 par addition de 150 uM d&#39;ADP. A ce point de la consommation d&#39;oxygène devraient augmenter en raison de la synthèse d&#39;ATP par phosphorylation oxydative. Signal d&#39;enregistrement jusqu&#39;à ce que la respiration ralentit, ce qui indique la consommation d&#39;ADP et la transition vers l&#39;état 4 respiration. Etat disque 4 respiration pendant au moins 1 min. </li><li> Ajouter 1 CCCP uM et signal d&#39;enregistrement pendant 1 min. Respiration découplée doit être maximale. </li></ol> Remarque: L&#39;effet de CCCP sur la respiration mitochondriale est dose-dépendante: des concentrations élevées de CCCP peut inhiber la consommation d&#39;oxygène et doivent donc être soigneusement titrated. <ol start="7"><li> Calculer le rapport de contrôle respiratoire (RCR) en divisant le taux de consommation d&#39;oxygène lors de la respiration État 3 par le taux de consommation d&#39;oxygène pendant la respiration État 4. Un RCR cible doit être ≥ 4. </li></ol> 2,2. Évaluation de l&#39;intégrité membranaire mitochondrial (cytochrome c test) <ol><li> Laver soigneusement la chambre Oxytherm avec de l&#39;éthanol à 70% et à l&#39;eau et répétez les étapes 2.1.2 -2.1.4. </li><li> Ajouter 1 mM d&#39;ADP et de la consommation d&#39;oxygène record de 1 min. </li><li> Ajouter 10 uM cytochrome c. Depuis le cytochrome c est imperméable à l&#39;intactes les membranes mitochondriales, une augmentation de la respiration indique cassés ou endommagés membranes mitochondriales. </li></ol> 3. La mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité mitochondriale <ol><li> Configurez le spectrofluorimètre pour la mesure multi-paramètres de l&#39;ouverture mtPTP. Utilisation du programme FelixGx, créer une nouvelle configuration matérielle (Quanta maître sta stablete) comprenant la source de lumière, monochromateur d&#39;excitation, un compartiment d&#39;échantillon et deux détecteurs positionnés à 90 ° et 270 ° par rapport à la monochromateur d&#39;excitation (Figure 4). Pour obtenir une résolution maximale de temps, les deux monochromateurs d&#39;émission (90 ° et 270 °) doit être désactivé et les filtres d&#39;émission à 90 ° et 270 ° dans le compartiment échantillon activé dans le menu de configuration matérielle. Cette étape permet de supprimer le contrôle moteur des longueurs d&#39;onde d&#39;émission et de fixer chaque monochromateur à une longueur d&#39;onde particulière. Si les monochromateurs d&#39;émission ne sont pas désactivés, chaque détecteur de cycle entre deux longueurs d&#39;onde et des mesures en double seront enregistrées. </li><li> Créer un protocole d&#39;acquisition à l&#39;aide du type Multi Dye et entrez les colorants suivants: <ul><li> Fura (haute Ca + +): excitation 340 nm, émission 525 nm (détecteur 1) </li><li> Fura (faible teneur en Ca + +): excitation 380 nm, émission 525 nm (détecteur 1) </li><li> JC1 (total): excitation 543 nm, Émission 595 nm (détecteur 2) </li><li> JC1 (monomère): excitation 498 nm, émission 525 nm (détecteur 1) </li><li> Gonflement: excitation 525 nm, émission 525 nm (détecteur 1) </li></ul></li><li> Définissez les fentes d&#39;excitation et d&#39;émission à 1 nm et la température à 37 ° C. </li><li> Pour obtenir le signal ratiométrique pour Fura et JC-1, de générer deux traces dérivés: Fura (haute Ca + +) / Fura (faible teneur en Ca + +) et JC1 (total) / JC1 (monomère). </li><li> Ajuster manuellement la longueur d&#39;onde d&#39;émission de détecteurs 1 et 2 à 525 nm et 595 nm, respectivement. </li><li> Mélanger 1 ml du tampon de dosage mitochondries (120 mM de KCl, 10 mM NaCl, 1 mM KH 2 PO 4, 20 mM HEPES-Tris, pH 7,2) avec 1 uM roténone, 5 mM de succinate et 800 nM Fura FF dans un jetable 4-faces le méthacrylate de cuvette. Ajouter un échantillon de 250 mg mitochondries et les placer dans le compartiment échantillon. Assurez-vous que l&#39;agitateur magnétique est activé. </li><li> Démarrez l&#39;enregistrement. Après 1 min, mettre en pause l&#39;acquisition, ajouter 500 nM JC-1, puis redémarrez l&#39;unecquisition. Le signal de JC-1 ratio devrait augmenter, indiquant absorption du colorant par les mitochondries actif. L&#39;enregistrement jusqu&#39;à JC-1 signal a atteint un plateau (généralement moins de 5 minutes). </li><li> Ajouter 20 uM CaCl 2. Une augmentation instantanée du signal Fura rapport FF doit être observé par l&#39;augmentation de Ca 2 + dans la présence du tampon de dosage, suivie d&#39;une diminution progressive due à mitochondriale de Ca 2 + absorption. Le signal de JC-1 ratio devrait présenter une diminution transitoire brève indicatif de dépolarisation de la membrane mitochondriale légère. </li><li> Attendre le retour de signal FF Fura rapport au niveau de base avant l&#39;addition d&#39;une autre impulsion CaCl 2 (1-1.5 min). Continuer impulsions à intervalles fixes jusqu&#39;à ce que les mitochondries ne peuvent pas s&#39;accumuler Ca 2 + et commencent à libérer le Ca 2 + dans le tampon de dosage. ouverture mtPTP est visualisée par une augmentation simultanée du signal Fura rapport FF en raison de la libération de Ca 2 +, une diminution du rapport signal JC-1 en raison de pote membranential effondrement, et une diminution de la diffusion de la lumière due à un gonflement des mitochondries (figure 5). </li><li> Après activation mtPTP, vérifier la spécificité de Fura FF, JC-1 et les signaux de gonflement respectivement avec 1 mM d&#39;EGTA, 1 uM CCCP et 5 ug / ml alaméthicine. </li><li> Pour vérifier la spécificité de l&#39;ouverture mtPTP, répéter les étapes de 3,6 à 3,9 en présence de 1 pM de la cyclosporine A cyclophiline D inhibiteur (cyclophiline D est un composant de la mtPTP). En présence de cyclosporine A, l&#39;ouverture de la mtPTP nécessite beaucoup plus de CaCl 2 impulsions que les échantillons de contrôle (figure 6). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs La figure 2 montre un contrôle typique respiratoire des mitochondries isolées cœur de souris. 3 état respiration est réalisé par addition d&#39;ADP à respirant mitochondries de succinate, et se caractérise par une consommation d&#39;oxygène sensiblement augmentée par rapport à la SUBSTRAte seul. L&#39;appauvrissement de l&#39;ADP ajouté État initiés 4 respiration, au cours de laquelle la consommation d&#39;oxygène ralentit et est comparable aux taux obtenus avant l&#39;addition d&#39;ADP. RCR est obtenu en divisant le taux de consommation d&#39;oxygène pour la respiration Etat 3 par celui de la respiration Etat 4. Le test de cytochrome c est utilisé pour doser l&#39;intégrité de la membrane mitochondriale externe: lorsque le cytochrome c est ajouté à la mitochondrie qui respire le succinate et de l&#39;ADP, aucune augmentation de la respiration est observée, indiquant une intactes extérieures membranes mitochondriales (figure 3). Une image représentative de l&#39;ouverture mtPTP dans les mitochondries isolées coeur est représenté sur la figure 4. Dans ce cas, l&#39;ouverture mtPTP a été déclenchée par l&#39;addition de 4 CaCl 2 impulsions (20 uM de chacun) à intervalles de 1,5 min. ouverture mtPTP est évident par la libération simultanée de près mitochondrial Ca 2 + (augmentation du signal Fura rapport FF), l&#39;effondrement de mitochondpotentiel de membrane de rials (diminution de JC-1 rapport signal) et une augmentation du volume mitochondrial (diminution du signal de gonflement). Lorsque la cyclosporine A est ajouté, qui se lie à la composante cyclophiline D de mtPTP, ouverture mtPTP nécessite 7 impulsions de CaCl 2 au lieu de 4 (figure 5). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma du multi-paramètre protocole de transition de perméabilité mitochondriale des pores d&#39;ouverture de cœur mitochondries isolées. Cœur est récoltée à partir des souris et les mitochondries sont isolées par centrifugation différentielle. La préparation mitochondriale est ensuite évaluée par la mesure qualitative polarographique de la commande de rapport et respiratoire intact membrane mitochondriale en présence de cytochrome c. Mitochondrial ouverture de pore de transition de perméabilité dans les mitochondries isolées est déclenchée par séquentiel CaCl 2 ajouts et est mesurée avec un spectrofluorimètre en surveillant libération de Ca 2 + de l&#39;effondrement membrane des mitochondries, le potentiel et le gonflement de la matrice mitochondriale. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig2.jpg" /> Figure 2. Mesure d&#39; rapport de contrôle respiratoire (RCR) de coeur mitochondries isolées. La consommation d&#39;oxygène par les mitochondries isolées coeur est mesurée au cours de la respiration Etat 3 en présence de succinate et de l&#39;ADP, et pendant 4 Etat respiration après consommation ADP. La réponse de mitochondries isolées de découpleurs est mesuré par l&#39;addition de CCCP. Les chiffres sur le graphique sont les taux de consommation d&#39;oxygène par les mitochondries isolées en nmol / min / mg de protéine. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig3.jpg" /> Figure 3. Mesure<html> tion de l&#39;intégrité membranaire des mitochondries isolées de cœur. Intégrité de la membrane mitochondriale est déterminée en mesurant la consommation d&#39;oxygène dans les mitochondries isolées en présence de succinate et de l&#39;ADP et après l&#39;addition de cytochrome c. Les chiffres sur le graphique sont les taux de consommation d&#39;oxygène par les mitochondries isolées en nmol / min / mg de protéine. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig4.jpg" /> Figure 4. Configuration matérielle Spectrofluorimètre pour la mesure multi-paramètres de l&#39;ouverture mtPTP. La configuration matérielle du spectrofluorimètre comprend une source lumineuse, un monochromateur d&#39;excitation, un compartiment pour un échantillon et deux détecteurs de longueurs d&#39;onde d&#39;émission fixe à 525 nm et 595 nm. Détecteur 1 est utilisé pour la détection du signal de Fura FF haute et faible teneur en Ca 2 +, JC-1 monomère, et le signal de gonflement. Détecteur 2 mesure le signal JC-1 global. jove_content &quot;fo: keep-together.within pages =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig5.jpg" /> Figure 5. Multi-paramètre de mesure de l&#39;ouverture mtPTP dans le cœur des mitochondries isolées. mtPTP ouverture a été déclenchée par additions successives de 20 M CaCl 2 et a été caractérisé par la libération de Ca 2 + par les mitochondries, l&#39;effondrement du potentiel de membrane mitochondriale et une augmentation du volume de la matrice mitochondriale (gonflement). Extramitochondriale Ca 2 + et le potentiel de membrane ont été mesurées avec des indicateurs ratiométriques Fura FF (vert trace) et JC-1 (rouge trace). Gonflement des mitochondries a été mesurée en enregistrant la diffusion de la lumière à 525 nm (trace noire). Spécificité de JC-1 et les signaux de gonflement a été testé avec 1 uM CCCP et 5 ug / ml alaméthicine (une toxine microbienne). <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/4131/4131fig6.jpg" /> Figure 6. Multi-Paramètre de mesure de l&#39;ouverture mtPTP dans le cœur des mitochondries isolées en présence de cyclosporine A. cyclosporine A (1 uM) augmente le nombre de CaCl 2 impulsions nécessaires à l&#39;ouverture mtPTP dans le cœur des mitochondries isolées.

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A., Hoffman, D. L., de Mesy Bentley, K. L., Molkentin, J. D., Sheu, S. S., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+permeability+transition+pore+controls+cardiac+mitochondrial+maturation+and+myocyte.">The permeability transition pore controls cardiac mitochondrial maturation and myocyte.</a> 21, 469-478 (2011).</li><li>Halestrap, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore.">What is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 46, 821-831 (2009).</li><li>Wei, A. C., Liu, T., Cortassa, S., Winslow, R. 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The demonstration of functional coupling to oxidative phosphorylation in an inner membrane-matrix preparation.</a> J. Biol. Chem. 260, 7757-7764 (1985).</li><li>Boehm, E. A., Jones, B. E., Radda, G. K., Veech, R. L., Clarke, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+uncoupling+proteins+and+decreased+efficiency+in+palmitate-perfused+hyperthyroid+rat+heart.">Increased uncoupling proteins and decreased efficiency in palmitate-perfused hyperthyroid rat heart.</a> AJP - Heart. 280, 977-983 (2001).</li><li>Fontaine, E., Eriksson, O., Ichas, F., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+the+Permeability+Transition+Pore+in+Skeletal+Muscle+Mitochondria.">Regulation of the Permeability Transition Pore in Skeletal Muscle Mitochondria.</a> J. Biol. 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T., Rosenfeld, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-+and+tissue-specific+relationships+between+mitochondrial+permeability+transition+and+generation+of+ROS+in+brain+and+liver+mitochondria+of+rats+and+mice.">Species- and tissue-specific relationships between mitochondrial permeability transition and generation of ROS in brain and liver mitochondria of rats and mice.</a> Am. J. Physiol. 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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole présenté ici décrit les étapes nécessaires expérimentales pour évaluer ouverture de pore de transition de perméabilité dans le cœur des mitochondries isolées (Figure 1 et Figure 4): la procédure d&#39;isolement de cœur de souris mitochondries, les contrôles des voies respiratoires en assurer l&#39;intégrité et la fonctionnalité, les paramètres mitochondriaux surveillés pendant ouverture mtPTP et les colorants utilisés pour leur évaluation, la mise en pl...

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom du réactif </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T3030 </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la trypsine (soja) </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T9128 </td></tr><tr><td> Hydrosulfite de sodium </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 71699 </td></tr><tr><td> La roténone </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R8875 </td></tr><tr><td> Cytochrome c </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7752 </td></tr><tr><td> Alaméthicine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> A4665 </td></tr><tr><td> CCCP </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C2759 </td></tr><tr><td> Cyclosporine A </td><td> Calbiochem </td><td> 239835 </td></tr><tr><td> Fura FF </td><td> Invitrogen </td><td> F14180 </td></tr><tr> &lt;td&gt; JC-1 </td><td> Invitrogen </td><td> T3168 </td></tr><tr><td> Broyeur de tissu Potter-Elvehjem de Téflon pilon 15 ml </td><td> Industries Wheaton </td><td></td></tr><tr><td> Agitateur à hélice </td><td> Industries Wheaton </td><td> 903475 </td></tr><tr><td> Oxytherm (électrode à oxygène à température contrôlée) </td><td> Hansatech Instruments </td><td></td></tr><tr><td> QuantaMaster 80 spectrofluorimètre double émission </td><td> Photon Technology International, Inc </td><td></td></tr></tbody></table>

multi-parameter measurement of the permeability transition pore opening in isolated mouse heart mitochondria

Le pore de transition de perméabilité mitochondriale (mtPTP) est un canal non spécifique qui se forme dans la membrane mitochondriale interne pour transporter les solutés de masse moléculaire inférieure à 1,5 kDa. Bien que l&#39;identité définitive moléculaire du pore est encore en débat, des protéines telles que la cyclophiline D, VDAC et ANT contribuer à mtPTP formation. Alors que la participation de l&#39;ouverture mtPTP dans la mort cellulaire est bien établi 1, l&#39;accumulation de preuves indique que le mtPTP joue un rôle physiologique pendant mitochondrial homéostasie du Ca 2 + 2, la bioénergétique et de signalisation redox 3. mtPTP ouverture est déclenchée par la matrice Ca 2 +, mais son activité peut être modulée par de nombreux autres facteurs tels que le stress oxydatif, l&#39;adénine nucléotide épuisement, de fortes concentrations de Pi, dépolarisation de la membrane mitochondriale ou de désaccouplement, et les acides gras à longue chaîne 4. In vitro, mtPTP l&#39;ouverture peut être achieved en augmentant la concentration de Ca + 2 à l&#39;intérieur de la matrice mitochondriale par des ajouts exogènes de Ca 2 + (capacité de rétention de calcium). Lorsque les niveaux de Ca 2 + à l&#39;intérieur des mitochondries atteindre un certain seuil, la mtPTP ouvre et facilite libération de Ca 2 +, la dissipation de la force proton motrice, l&#39;effondrement du potentiel de membrane et une augmentation de volume de la matrice mitochondriale (gonflement) qui conduit finalement à la rupture de la la membrane externe mitochondriale et la perte irréversible de la fonction des organites. Nous décrivons ici un essai fluorimétrique qui permet une caractérisation complète de l&#39;ouverture mtPTP dans le cœur de souris mitochondries isolées. Le test consiste à mesurer simultanément les 3 paramètres mitochondriaux qui sont modifiés lors de l&#39;ouverture se produit mtPTP: mitochondrial Ca 2 + (absorption et de libération, telle que mesurée par la concentration de Ca 2 + dans le milieu d&#39;essai), le potentiel de membrane mitochondriale, et mitochole volume ndrial. Les colorants utilisés pour la mesure de Ca 2 + dans le milieu d&#39;essai et le potentiel de membrane mitochondrial sont Fura FF, une membrane imperméant, indicateur logométrique qui subit un changement de la longueur d&#39;onde d&#39;excitation en présence de Ca 2 +, et JC-1, cationique, Indicateur ratiométrique qui forme monomères verts ou rouges agrégats au potentiel de membrane haute et basse, respectivement. Les variations de volume mitochondrial sont mesurées par diffusion de la lumière par l&#39;enregistrement de la suspension mitochondriale. Depuis de haute qualité, les mitochondries fonctionnelles sont nécessaires pour l&#39;essai d&#39;ouverture mtPTP, nous décrivons également les mesures nécessaires pour obtenir intacte, le cœur fortement couplé et fonctionnelles des mitochondries isolées.

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Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l&#39;ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Manipulation, le volume potentiel de la membrane mitochondriale et mitochondrial. La procédure pour l&#39;obtention de coeur et de grande qualité fonctionnelle des mitochondries est également décrit.

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

The mitochondrial permeability transition pore (mtPTP) is a non specific channel that forms in the inner mitochondrial membrane to transport solutes with ...

multi-parameter-measurement-permeability-transition-pore-opening

Research

JoVE Journal

Biology

21.4K vues.  University of Washington, Seattle. Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l'ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries Ca 2 + Manipulation, le volume potentiel de la membrane mitochondriale et mitochondrial. La procédure pour l'obtention de coeur et de grande qualité fonctionnelle des mitochondries est également dé...

Vidéo: Multi-parameter Measurement of the Permeability Transition Pore Opening in Isolated Mouse Heart Mitochondria

Preparation of Highly Coupled Rat Heart Mitochondria

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there have been significant advances in our understanding of the functions of mitochondria other than the generation of energy. These include their role in apoptosis, acting as signalling organelles, mammalian development and ageing as well as their contribution to the coordination between cell metabolism and cell proliferation. Our understanding of biological processes modulated by mitochondria is based on robust methods for isolation and handling of intact mitochondria from tissues of the laboratory animals. Mitochondria from rat heart is one of the most common preparations for past and current studies of cellular metabolism including studies on knock-out animals.
Here we describe a detailed rapid method for isolation of intact mitochondria with a high degree of coupling. Such preparation of rat heart mitochondria is an excellent object for functional and structural research on cellular bioenergetics, transport of biomolecules, proteomic studies and analysis of mitochondrial DNA, proteins and lipids.

We describe &#1072; protocol for isolation of pure, highly coupled rat heart mitochondria for functional or structural studies of cellular bioenergetics, biophysical measurements, proteomics or mitochondrial DNA and lipids analysis.

Préparation de coeur de rat fortement couplées Mitochondries

The function of mitochondria in generation of cellular ATP in the process of oxidative phosphorylation is widely recognised. During the past decades there ...

Recherche

Biologie

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial dysfunction often accompanies and contributes to human disease. Majority of the approaches that have been developed to evaluate mitochondrial function and dysfunction are based on in vitro or ex vivo measurements. Results from these experiments have limited ability in determining mitochondrial function in vivo. Here, we describe a novel approach that utilizes confocal scanning microscopy for the imaging of intact tissues in live aminals, which allows the evaluation of single mitochondrial function in a real-time manner in vivo. First, we generate transgenic mice expressing the mitochondrial targeted superoxide indicator, circularly permuted yellow fluorescent protein (mt-cpYFP). Anesthetized mt-cpYFP mouse is fixed on a custom-made stage adaptor and time-lapse images are taken from the exposed skeletal muscles of the hindlimb. The mouse is subsequently sacrificed and the heart is set up for Langendorff perfusion with physiological solutions at 37 &deg;C. The perfused heart is positioned in a special chamber on the confocal microscope stage and gentle pressure is applied to immobilize the heart and suppress heart beat induced motion artifact. Superoxide flashes are detected by real-time 2D confocal imaging at a frequency of one frame per second. The perfusion solution can be modified to contain different respiration substrates or other fluorescent indicators. The perfusion can also be adjusted to produce disease models such as ischemia and reperfusion. This technique is a unique approach for determining the function of single mitochondrion in intact tissues and in vivo.

Confocal Imaging of Single Mitochondrial Superoxide Flashes in Intact Heart or In Vivo

Confocal scanning microscopy is applied for imaging single mitochondrial events in perfused heart or skeletal muscles in live animal. Real-time monitoring of single mitochondrial processes such as superoxide flashes and membrane potential fluctuations enables the evaluation of mitochondrial function in a physiologically relevant context and during pathological perturbations.

Imagerie confocale de simples mitochondriales superoxyde Flashs à coeur Intact ou<em&gt; In Vivo</em

Mitochondrion is a critical intracellular organelle responsible for energy production and intracellular signaling in eukaryotic systems. Mitochondrial ...

Quantifying Single Microvessel Permeability in Isolated Blood-perfused Rat Lung Preparation

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with real time imaging, it becomes feasible to determine permeability changes in individual pulmonary microvessels. Herein we describe steps to isolate rat lungs and perfuse them with autologous blood. Then, we outline steps to infuse fluorophores or agents via a microcatheter into a small lung region. Using these procedures described, we determined permeability increases in rat lung microvessels in response to infusions of bacterial lipopolysaccharide. The data revealed that lipopolysaccharide increased fluid leak across both venular and capillary microvessel segments. Thus, this method makes it possible to compare permeability responses among vascular segments and thus, define any heterogeneity in the response. While commonly used methods to define lung permeability require postprocessing of lung tissue samples, the use of real time imaging obviates this requirement as evident from the present method. Thus, the isolated lung preparation combined with real time imaging offers several advantages over traditional methods to determine lung microvascular permeability, yet is a straightforward method to develop and implement.

The isolated blood-perfused lung preparation makes it feasible to visualize microvessel networks on the lung surface. Here we describe an approach to quantify permeability of single microvessels in isolated lungs using real time fluorescence imaging.

Quantifier simple microvaisseaux perméabilité d&#39;isolement de poumon de rat Préparation du sang perfusé

The isolated blood-perfused lung preparation is widely used to visualize and define signaling in single microvessels. By coupling this preparation with ...

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient (Pf) of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is a simple and very efficient method for the determination of the osmotic water permeability coefficient (Pf) in plant protoplasts, applicable in principle also to other spherical cells such as frog oocytes. The first step of the assay is the isolation of protoplasts from the plant tissue of interest by enzymatic digestion into a chamber with an appropriate isotonic solution. The second step consists of an osmotic challenge assay: protoplasts immobilized on the bottom of the chamber are submitted to a constant perfusion starting with an isotonic solution and followed by a hypotonic solution. The cell swelling is video recorded. In the third step, the images are processed offline to yield volume changes, and the time course of the volume changes is correlated with the time course of the change in osmolarity of the chamber perfusion medium, using a curve fitting procedure written in Matlab (the &#8216;PfFit&#8217;), to yield Pf.

Measuring the Osmotic Water Permeability Coefficient Pf of Spherical Cells: Isolated Plant Protoplasts as an Example

Measuring the osmotic water permeability coefficient (Pf) of cells can help understand the regulatory mechanisms of aquaporins (AQPs). Pf determination in spherical plant cell protoplasts presented here involves protoplasts isolation and numerical analysis of their initial rate of volume change as a result of an osmotic challenge during constant bath perfusion.

La mesure de la perméabilité à l&#39;eau Coefficient osmotique (P<sub&gt; F</sub&gt;) Des cellules sphériques: protoplastes de plantes isolées comme un exemple

Studying AQP regulation mechanisms is crucial for the understanding of water relations at both the cellular and the whole plant levels. Presented here is ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

Immunodétection de la membrane externe de protéines par cytométrie en flux de mitochondries isolées

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Mesure de la fonction musculaire lisse dans les tissus isolés Bath-applications à la pharmacologie de recherche

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Isolation of Mitochondria from Minimal Quantities of Mouse Skeletal Muscle for High Throughput Microplate Respiratory Measurements

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial respirometric assays from isolated mitochondrial preparations allow for the assessment of mitochondrial function, as well as determination of the mechanism(s) of action of drugs and proteins that modulate metabolism. Current isolation procedures often require large quantities of tissue to yield high quality mitochondria necessary for respirometric assays. The methods presented herein describe how high quality purified mitochondria (~ 450 &#181;g) can be isolated from minimal quantities (~75-100 mg) of mouse skeletal muscle for use in high throughput respiratory measurements. We determined that our isolation method yields 92.5&#177; 2.0% intact mitochondria by measuring citrate synthase activity spectrophotometrically. In addition, Western blot analysis in isolated mitochondria resulted in the faint expression of the cytosolic protein, GAPDH, and the robust expression of the mitochondrial protein, COXIV. The absence of a prominent GAPDH band in the isolated mitochondria is indicative of little contamination from non-mitochondrial sources during the isolation procedure. Most importantly, the measurement of O2 consumption rate with micro-plate based technology and determining the respiratory control ratio (RCR) for coupled respirometric assays shows highly coupled (RCR; &#62;6 for all assays) and functional mitochondria. In conclusion, the addition of a separate mincing step and significantly reducing motor driven homogenization speed of a previously reported method has allowed the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle that results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Here, we present a modification of a previously reported method that allows for the isolation of high quality and purified mitochondria from smaller quantities of mouse skeletal muscle. This procedure results in highly coupled mitochondria that respire with high function during microplate based respirometirc assays.

Isolement des mitochondries à partir des quantités minimes de souris muscle squelettique pour les mesures à haut débit microplaques respiratoires

Dysfunctional skeletal muscle mitochondria play a role in altered metabolism observed with aging, obesity and Type II diabetes. Mitochondrial ...

Methods for the Determination of Rates of Glucose and Fatty Acid Oxidation in the Isolated Working Rat Heart

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of myocardial metabolism have been linked to the development of contractile dysfunction and heart failure. Therefore, unraveling the link between metabolism and contraction should shed light on some of the mechanisms governing cardiac adaptation or maladaptation in disease states. The isolated working rat heart preparation can be used to follow, simultaneously and in real time, cardiac contractile function and flux of energy providing substrates into oxidative metabolic pathways. The present protocol aims to provide a detailed description of the methods used in the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of the rates of oxidation for glucose and fatty acids, the main energy providing substrates of the heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed. In brief, the technique is based on the supply of 14C- radiolabeled glucose and a 3H- radiolabeled long-chain fatty acid to an ex vivo beating heart via normothermic crystalloid perfusion. 14CO2 and 3H2O, end byproducts of the enzymatic reactions involved in the utilization of these energy providing substrates, are then quantitatively recovered from the coronary effluent. With knowledge of the specific activity of the radiolabeled substrates used, it is then possible to individually quantitate the flux of glucose and fatty acid in the oxidation pathways. Contractile function of the isolated heart can be determined in parallel with the appropriate recording equipment and directly correlated to metabolic flux values. The technique is extremely useful to study the metabolism/contraction relationship in response to various stress conditions such as alterations in pre and after load and ischemia, a drug or a circulating factor, or following the alteration in the expression of a gene product.

The following protocol describes the preparation and utilization of buffers for the quantitative measurement of rates of glucose and fatty acid oxidation in the isolated working rat heart. The methods used for sample analysis and data interpretation are also discussed.

Méthodes pour la détermination des taux de glucose et oxydation des acides gras dans le coeur isolé de rat de travail

The mammalian heart is a major consumer of ATP and requires a constant supply of energy substrates for contraction. Not surprisingly, alterations of ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La perfusé Technique du rein de souris isolé

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

MitoCeption: Transferring Isolated Human MSC Mitochondria to Glioblastoma Stem Cells

Mitochondria play a central role for cell metabolism, energy production and control of apoptosis. Inadequate mitochondrial function has been found responsible for very diverse diseases, ranging from neurological pathologies to cancer. Interestingly, mitochondria have recently been shown to display the capacity to be transferred between cell types, notably from human mesenchymal stem cells (MSC) to cancer cells in coculture conditions, with metabolic and functional consequences for the mitochondria recipient cells, further enhancing the current interest for the biological properties of these organelles.
Evaluating the effects of the transferred MSC mitochondria in the target cells is of primary importance to understand the biological outcome of such cell-cell interactions. The MitoCeption protocol described here allows the transfer of the mitochondria isolated beforehand from the donor cells to the target cells, using MSC mitochondria and glioblastoma stem cells (GSC) as a model system. This protocol has previously been used to transfer mitochondria, isolated from MSCs, to adherent MDA-MB-231 cancer cells. This mitochondria transfer protocol is adapted here for GSCs that present the specific particularity of growing as neurospheres in vitro. The transfer of the isolated mitochondria can be followed by fluorescence-activated cell sorting (FACS) and confocal imaging using mitochondria vital dyes. The use of mitochondria donor and target cells with distinct haplotypes (SNPs) also allows detection of the transferred mitochondria based on the concentration of their circular mitochondrial DNA (mtDNA) in the target cells. Once the protocol has been validated with these criteria, the cells harboring the transferred mitochondria can be further analyzed to determine the effects of the exogenous mitochondria on biological properties such as cell metabolism, plasticity, proliferation and response to therapy.

Here, a protocol (MitoCeption) is presented to transfer mitochondria, isolated from human mesenchymal stem cells (MSC), to glioblastoma stem cells (GSC), with the goal of studying their biological effects on GSC metabolism and functions. A similar protocol can be adapted to transfer mitochondria between other cell types.