La recherche financée par le ministère de la Défense (Defense Advanced Research Projects Agency, Faculty Award Young, Grant Nombre N66001-09-1-2117) et NINDS (R15NS070734).

1. Préparation chirurgicale des animaux 1. Sujets expérimentaux Utilisez la souris de l&#39;B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J lignée transgénique 9; souche JAX # 7612) ou d&#39;autres souris exprimant le canal cationique sensible à la lumière bleue, channelrhodopsin-2, dans les neurones corticaux cérébraux. Application de la lumière bleue dans le cortex cérébral du B6.Cg-Tg (Thy1-COP4/eYFP) 18Gfng / J lignée transgénique provoque les neurones pyramidaux exprimant channelrhodopsin-2 pour dépolariser et subissent les potentiels d&#39;action 9,10. À la suite de l&#39;activation des cellules pyramidales, interneurones locaux sont activés, et la variation de potentiel est propagée vers les neurones au-delà du site de stimulation 10. Opérer dans des conditions stériles dans le respect des directives réglementaires applicables: autoclave des instruments chirurgicaux et softpacks (champ opératoire, des tampons de gaze); chaud cordon stériliser tous les appareils résistants à la chaleur métalliques implantés (canules, les vis et les fils)pour 30 s; Désinfecter la chaleur intolérants dispositifs implantables (câble à fibre optique, connecteur en plastique) avec un pendage de 10 secondes dans de l&#39;éthanol; coup d&#39;éthanol par immersion articles sèche en application de l&#39;air comprimé. 2. Anesthésie, de placement stéréotaxique et le dédouanement des Skull Utilisez le IMPAC 6 intégré des patients (Multi Vet Equip Inc) Système d&#39;anesthésier la souris. Utiliser 5% d&#39;oxygène Isoflurane/95% pour l&#39;induction et 3% d&#39;oxygène Isoflurane/97% pour l&#39;entretien pendant la chirurgie. Placez l&#39;animal sur une couverture à circulation d&#39;eau réglé à 37 ° C. Il n&#39;est pas nécessaire de surveiller la température du corps si la couverture est maintenue à cette température. 3. Préparation du crâne pour l&#39;implantation Préparer le site d&#39;incision en se rasant tous les poils du haut du crâne. La zone rasée devrait s&#39;étendre latéralement jusqu&#39;aux oreilles et antéro-postérieur de l&#39;œil à l&#39;extrémité postérieure du crâne. Désinfecter la peau exposée avec trois CONSÉCUTIFStampons e de la bétadine puis de l&#39;éthanol. Faire une incision médiane sur le sommet du crâne, entre les yeux de l&#39;arrière du crâne. Nettoyez le crâne avec du peroxyde d&#39;hydrogène et une solution saline stérile (NaCl 0,9%). Contrôler le saignement avec un outil de cautérisation. Repérez et marquez bregma et lambda pour déterminer les coordonnées stéréotaxiques. Coordonnées stéréotaxiques pour les configurations d&#39;électrodes de stimulation / optogenetic que nous avons utilisées sont présentées dans le tableau 1 et schématisé sur la figure 1A. 4. Préparation des sites d&#39;implantation sur Skull Utiliser une perceuse à grande vitesse dentaire avec un peu 0.5mm balle bavure d&#39;établir chaque site d&#39;implantation dans le crâne. Chanfreiner le bord externe de chaque trou avec une balle de 0,7 mm bavure bits pour faciliter l&#39;insertion de vis. 5. Insertion et fixation des canules, EMG Leads et prospects EEG Insérer les vis EEG (0,8 mm de longueur, avec 2 cm de 3 non couché0-jauge conserve-bus en cuivre fil pré-soudé à la tête de vis) dans les trous et les enfoncer avec un tournevis manuel à fentes révolutions environ 4-5 pour obtenir la profondeur désirée. Tenez canules guides en place d&#39;un support stéréotaxique canule et fixez-les sur le crâne et les ancres avec du ciment acrylique. Chaque canule guide devrait contenir un mannequin canule / stylet (Plastics One, pièce n ° C312 DC \ 1) à partir du moment de la chirurgie de la période d&#39;expérimentation (10-14 jours) pour maintenir la perméabilité. 6. La fermeture du site opératoire Une fois que l&#39;EEG et des canules de guidage sont positionnés dans le crâne, les coller ensemble avec du ciment acrylique dentaire (Dental Lang - Ortho-Jet ciment). Après prise du ciment, positionner le connecteur en plastique (qui fait partie de la technologie Pinnacle # 8402) au-dessus du monticule ciment séché. Souder les extrémités des fils conducteurs provenant de l&#39;EEG sur les contacts sur le connecteur en plastique. Enveloppez les fils conducteurs dans le ciment. Ensuite, tirer les fils EMG dans le muscle nuques en les faisant coulisser dans le cylindre d&#39;une aiguille 21ga percé muscle. Attachez noeud de chirurgien à deux de de 5-0 suture de nylon autour de ces fils juste en aval de l&#39;endroit où ils sortent le muscle. Suturer la peau ainsi que fut rentré pour accéder au tissu musculaire avec noeuds simples chirurgien interrompus, à l&#39;aide d&#39;un revers de coupe P-3 et 5-0 aiguille de suture en nylon. 7. L&#39;analgésie post-opératoire et la récupération Administrer la buprénorphine comme un analgésique (0,1 mg / kg, sous-cutanée) et la flunixine méglumine (0,1 mg / kg, sous-cutanée) comme un anti-inflammatoire immédiatement après la chirurgie, et tous les jours sur les jours 1-2 après la chirurgie. Permettre aux animaux de récupérer dans des conditions standard de logement colonie pendant au moins sept jours avant l&#39;expérimentation. En l&#39;absence de soins supplémentaires au-delà du logement colonie standard, canules peuvent s&#39;attendre à rester brevet pour au moins deux semaines avec les stylets à demeure fixé en place. Capteurs EEG et EMG peut également s&#39;attendre à conserverfonctionnalité de cette durée. 2. Génération d&#39;impulsions lumineuses Timed 1. Programmation de l&#39;unité de stimulation de MC Connectez l&#39;unité MC-stimulation (systèmes multi-canaux) via une connexion USB à un ordinateur de bureau. Utilisez la feuille de calcul-comme l&#39;interface utilisateur MC-stimulation de programmer l&#39;appareil de stimulation de MC. Entrer la valeur désirée TTL (logique transistor-transistor) de tension pour la période de suite, les durées de stimulus et à l&#39;extérieur des périodes, le nombre de cycles par seconde désirés et le nombre total de cycles répétés de la session de stimulation entier. Pour de plus amples détails, voir MC-stimulation manuel technique: 3. Fabrication / Assemblage de fibres optiques Probé pour Light Delivery au cortex cérébral <ol><li> Fournitures et le matériel nécessaires sont disponibles sur: <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a> </li><li> Taille et de polissage de la fibre optique. <a href="http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf" target="_blank">http://www.thorlabs.com/Thorcat/1100/1166-D02.pdf</a> </li></ol> 4. Assemblée des rongeurs système de stimulation optogenetic 1. Interface de MC-stimulation de l&#39;unité et Laser Une fois que l&#39;unité de MC-stimulation est programmé, exécutez-le en tant que générateur de signal autonome d&#39;un binaire de 5 volts signal ON / OFF. Connectez l&#39;unité MC-stimulation à l&#39;unité de puissance compatible TTL du laser avec connecteurs BNC. 2. Produire Sortie du laser par fibre optique Utilisez l&#39;affichage numérique et variable cadran puissance de sortie de l&#39;unité de puissance du laser au manuelly ajuster la puissance de sortie du laser. Connecter l&#39;unité de puissance de laser pour le laser par l&#39;intermédiaire d&#39;un câble ruban. Connecter le FC femelle (embout de connecteur) adaptateur de fibre du laser sur le connecteur mâle FC sur le câble de raccordement à fibres optiques (3 m de longueur, 200 mm diamètre de fibre de verre encastrée dans la conduction de réflexion de lumière de polymère d&#39;acrylate de gainage). 3. Transport du laser à l&#39;animal: Commutateur rotatif Branchez le câble à fibres optiques d&#39;origine (3 m de longueur) et le câble à fibres optiques livraison (45 cm de longueur) aux extrémités opposées du joint rotatif optique enfermant deux lentilles de collimation (Doric Lenses). La fibre optique joint rotatif sert de collecteur: comme l&#39;animal se déplace de sa cage, le joint rotatif tourne pour empêcher la rupture des câbles à fibres optiques. Utiliser des colliers en matière plastique pour fixer le collecteur à un support en métal placé au-dessus de la cage cylindrique, dans lequel l&#39;animal est logé. 4. Fixation Fiber Optic livraisonÀ la tête de câble Restreindre la souris en utilisant une seule main à la broche de la souris sous un palmier en forme de coupe. Orientez la tête entre le milieu de l&#39;expérimentateur et l&#39;index. Retirer la canule factice de la canule de guidage placé pour la canule fibre optique. Effacer la canule de guidage de débris à l&#39;aide d&#39;une aiguille stérile 25ga. Insérez le câble à fibre optique à la main et le fixer à la canule guide à fibres optiques avec un bouchon fileté récupéré à partir d&#39;une canule factice. Contrôler la profondeur d&#39;insertion du câble à fibre optique dans le cerveau d&#39;un noeud de suture attaché sur le câble de fibre optique à une distance fixe de l&#39;extrémité plate-fendues. L&#39;ensemble du dispositif expérimental est représenté sur la figure 1B. 5. Mesure de l&#39;EEG défini sommeil et de la concentration de lactate pendant la stimulation optogenetic 1. Précalibration du capteur de lactate Pré-étalonnage du capteur est effectué avec le lactate in vitroKit (partie Pinnacle Technology # 7000-K1-T). Le capteur est équilibrée en tampon phosphate salin (pH 7,4), puis exposées à trois concentrations de L-lactate de manière progressive selon les protocoles du fabricant. 2. L&#39;insertion de la sonde et du câble Lactate EEG Insérer le capteur pré-calibré dans le crâne monté sur la canule guide de lactate d&#39;une manière identique à la fibre optique câble d&#39;insertion procédure (section 4.4). Connecter le capteur de lactate au préamplificateur de la Pinnacle 8400 biocapteur avec connecteurs bipolaires. Fixez ce préamplificateur sur le connecteur à 8 broches sur la headmount chirurgicalement implanté. 3. Établir Intensité de stimulation optogenetic Avant la collecte de données, utilisez le bouton de commande laser d&#39;intensité pour régler l&#39;intensité du stimulus optogenetic. L&#39;amplitude de la réponse EEG variera selon les animaux, en raison de facteurs qui n&#39;ont pas été étudiés de façon systématique, une<html> d doit être vérifiée par inspection visuelle au début de la stimulation. Dans la pratique, une intensité de 80-120 μWatts produit généralement une augmentation de l&#39;amplitude EEG d&#39;environ 50% à la fréquence de stimulation. Post-hoc transformée de Fourier rapide analyse (voir section 5.5) est nécessaire pour quantifier l&#39;ampleur absolue de la réponse. 4. Collecte des données Recueillir des données en utilisant le système Pinnacle 8400: <a href="http://pinnaclet.com/pal-8400.html" target="_blank">http://pinnaclet.com/pal-8400.html</a> . 5. Traitement des données avec Neuroscore Annotez états de sommeil par inspection visuelle des données EEG et EMG avec l&#39;interface Neuroscore (DataSciences, international: <a href="http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp" target="_blank">http://www.datasci.com/products/software/NeuroScore_CNS_Software.asp</a> ) ou l&#39;interface des siréniens (Pinnacle Technology:f = &quot;http://www.pinnaclet.com/sirenia.html&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; http://www.pinnaclet.com/sirenia.html). Données de process dans dix secondes époques comme suite, non-rapid eye movement sommeil ou sommeil à mouvements oculaires rapides basées sur l&#39;EEG et EMG. Sauvegardez les données que Microsoft Excel pour une analyse supplémentaire et des tests statistiques.

<ol>
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Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Les méthodes présentées ici permettent de mesurer la relation entre le sommeil et les changements dans la concentration dans le cerveau du lactate glycolytique intermédiaire sur une échelle de temps n&#39;était pas possible auparavant. Animaux subissent des transitions spontanées entre sillage, NREMS et REMS. En outre, nous sommes en mesure d&#39;appliquer des stimuli optogenetic alors que les animaux subissent ces transitions. Les données recueillies à ce jour montrent que l&#39;impact à la fois spontané et ...

<table border="1"><tbody><tr><td> Composant </td><td> Entreprise </td><td> Numéro de catalogue </td><td> Commentaires (optionnel) </td></tr><tr><td> BASi Souris Guide canule </td><td> Pinnacle Technology / BASi Inc </td><td> 7032 </td><td></td></tr><tr><td> Biocapteur lactate </td><td> Pinnacle Technology </td><td> 7004 </td><td></td></tr><tr><td> Montage en tête </td><td> Pinnacle Technology </td><td> 8402 </td><td></td></tr><tr><td> Veille / Système d&#39;enregistrement des biocapteurs </td><td> Pinnacle Technology </td><td> 8400-K1-SL </td><td> 2 canaux EEG EMG, 1 canal, &amp; 1 biocapteur </td></tr><tr><td> Souris captif in vitro kit d&#39;étalonnage </td><td> Pinnacle Technology </td><td> K1-7000-T </td><td></td></tr><tr><td> Fibre optique Guide canule </td><td> Plastics One </td><td> C312G </td><td> Grosseur 21 Guide de canule </td></tr><tr><td> Canule Dummy </td><td> Plastics One </td><td> C312DC </td><td> 21 Dummy Gauge </td></tr><tr><td> Scribe fibre de diamant </td><td> Thorlabs </td><td> S90W </td><td></td></tr><tr><td> Connecteur de fibre à sertir </td><td> Thorlabs </td><td> CT042 </td><td></td></tr><tr><td> Tubes furcation </td><td> Thorlabs </td><td> FT030 </td><td> 03,0 mm </td></tr><tr><td></td><td> Thorlabs </td><td> T10S13 </td><td> Dia. 0,012 </td></tr><tr><td> Décapant Tube furcation </td><td> Thorlabs </td><td> FTS3 </td><td></td></tr><tr><td> Bare Fiber Revêtement dur multimode </td><td> Thorlabs </td><td> BFL37-200 </td><td> 200 Diamètre um, 0,37 NA </td></tr><tr><td> Fil Cisailles / Kevlar Ciseaux </td><td> Thorlabs </td><td> T865 </td><td></td></tr><tr><td> Fibre optique époxy </td><td> Thorlabs </td><td> F112 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> Outil à dénuder fibre </td><td> Thorlabs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Plaque de polissage de verre </td><td> Thorlabs </td><td> CTG913 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de polissage en caoutchouc </td><td> Thorlabs </td><td> NRS913 </td><td></td></tr><tr><td> Eye Loupe </td><td> Thorlabs </td><td> JEL10 </td><td></td></tr><tr><td> Kim Wipes </td><td> Thorlabs </td><td> KW32 </td><td></td></tr><tr><td> Air comprimé </td><td> Thorlabs </td><td> CA3 </td><td></td></tr><tr><td> Polissage Puck </td><td> Thorlabs </td><td> D50-xx </td><td></td></tr><tr><td> Portée inspection de la fibre </td><td> Thorlabs </td><td> CL-200 </td><td></td></tr><tr><td> Films de polissage </td><td> Thorlabs </td><td> LFG5P, LFG3P, LFG1P, LFG03P </td><td></td></tr><tr><td> Extrémité du connecteur FC / PC </td><td> Thorlabs </td&gt; <td> 30126G2-240 </td><td> 240 Alésage um, SS Ferrule </td></tr><tr><td> Unité de stimulation de MC </td><td> Multi-Channel Systems </td><td> STG-4002 </td><td></td></tr><tr><td> Logiciel de stimulation de MC </td><td> Multi-Channel Systems </td><td> MC-stimulation V 2.1.5 </td><td></td></tr><tr><td> Blue Laser </td><td> CrystaLaser </td><td> CL473-050-0 </td><td></td></tr><tr><td> Alimentation Laser </td><td> CrystaLaser </td><td> CL2005 </td><td></td></tr><tr><td> Fiber Optic Rotary Joint </td><td> Doric Lenses </td><td> FRJ-v4 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tableau 2. Matériel et équipements. </td></tr></tbody></table>

simultaneous electroencephalography, real-time measurement of lactate concentration and optogenetic manipulation of neuronal activity in the rodent cerebral cortex

Bien que le cerveau représente moins de 5% de la masse du corps, il utilise environ un quart du glucose utilisé par le corps au repos 1. La fonction de non sommeil à mouvements oculaires rapides (NREMS), la plus grande partie du sommeil par le temps, est incertain. Cependant, un trait saillant de NREMS est une réduction significative du taux d&#39;utilisation du glucose cérébral par rapport à l&#39;état de veille 2-4. Ceci et d&#39;autres constatations ont conduit à la croyance largement répandue que le sommeil a une fonction liée au métabolisme cérébral. Cependant, les mécanismes sous-jacents à la réduction du métabolisme du glucose cérébral pendant NREMS restent à élucider. Un phénomène lié à NREMS qui pourraient avoir une incidence sur le taux métabolique cérébrale est l&#39;apparition d&#39;ondes lentes, des oscillations à des fréquences de moins de 4 Hz, à l&#39;électroencéphalogramme 5,6. Ces ondes lentes détectées au niveau de la boîte crânienne ou cérébrale surface corticale refléter laoscillations de neurones sous-jacents entre un état ​​dépolarisé / et un état ​​hyperpolarisé / bas 7. Pendant l&#39;état bas, les cellules ne subissent pas de potentiels d&#39;action pour des intervalles allant jusqu&#39;à plusieurs millisecondes cents. Restauration des gradients de concentration ionique à la suite de potentiels d&#39;action représente une charge importante du métabolisme de la cellule 8; absence de potentiels d&#39;action pendant les états associés à la baisse de NREMS peuvent contribuer au métabolisme réduit par rapport à réveiller. Deux défis techniques ont dû être résolues pour que cette relation hypothétique à tester. Tout d&#39;abord, il était nécessaire de mesurer cérébrale métabolisme glycolytique avec une résolution temporelle reflète la dynamique de l&#39;EEG cérébrale (soit plus de quelques secondes plutôt qu&#39;en quelques minutes). Pour ce faire, nous avons mesuré la concentration de lactate, le produit de la glycolyse aérobie, et donc une lecture de la vitesse du métabolisme du glucose dans le cerveau des souris. Lactate étaitmesurée à l&#39;aide d&#39;un capteur à base de lactate oxydase temps réel incorporée dans le cortex frontal. Le mécanisme de détection comprend une électrode de platine-iridium entouré d&#39;une couche de molécules de lactate oxydase. Métabolisme du lactate par la lactate oxydase produisant du peroxyde d&#39;hydrogène, qui produit un courant dans l&#39;électrode de platine-iridium. Si une montée en puissance de la glycolyse cérébrale permet une augmentation de la concentration en substrat pour la lactate oxydase, qui est ensuite réfléchie en courant accrue à l&#39;électrode de détection. Il était en outre nécessaire de mesurer ces variables tout en manipulant l&#39;excitabilité du cortex cérébral, afin d&#39;isoler cette variable à partir d&#39;autres facettes de NREMS. Nous avons conçu un système expérimental pour la mesure simultanée de l&#39;activité neuronale par l&#39;intermédiaire du elecetroencephalogram, la mesure du flux glycolytique par l&#39;intermédiaire d&#39;un biocapteur lactate, et la manipulation de l&#39;activité neuronale cérébrale corticale via l&#39;activation de la pyramide optogeneticMidal neurones. Nous avons utilisé ce système pour documenter la relation entre le sommeil liés à des formes d&#39;onde électroencéphalographique et la dynamique moment-à-moment de la concentration de lactate dans le cortex cérébral. Le protocole peut être utile pour toute personne qui s&#39;intéresse à l&#39;étude, à se comporter librement les rongeurs, la relation entre l&#39;activité neuronale mesurée au niveau électroencéphalographique et énergétique cellulaire dans le cerveau.

<html> Comme le montre la figure 2, une souris équipée pour la stimulation optogenetic et le lactate / EEG / EMG collecte de données a subi spontanées transitions d&#39;état veille / sommeil tout en EEG, EMG et la concentration du lactate cérébral ont été surveillés en permanence. Actuelle au niveau du capteur de lactate augmenté pendant les périodes de faible amplitude EEG et a diminué au cours des périodes de forte amplitude EEG. Comme le montre la figure 3,</st...

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Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Une procédure est décrite pour la manipulation de l&#39;activité du cortex cérébral neurones pyramidaux optogenetically tandis que l&#39;électroencéphalogramme, électromyogramme, et la concentration de lactate cérébral sont surveillés. Enregistrements expérimentaux sont effectués sur les câbles attachés-souris tandis qu&#39;ils subissent spontanément veille / sommeil cycles. Optogenetic matériel est assemblé dans notre laboratoire, le matériel d&#39;enregistrement est disponible dans le commerce.

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

simultaneous-electroencephalography-real-time-measurement-lactate

Research

JoVE Journal

Neuroscience

20.1K vues.  Washington State University. Une procédure est décrite pour la manipulation de l'activité du cortex cérébral neurones pyramidaux optogenetically tandis que l'électroencéphalogramme, électromyogramme, et la concentration de lactate cérébral sont surveillés. Enregistrements expérimentaux sont effectués sur les câbles attachés-souris tandis qu'ils subissent spontanément veille / sommeil cycles. Optogenetic matériel est assemblé dans notre laboratoire, le matériel d'enr...

Vidéo: Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Simultaneous fMRI and Electrophysiology in the Rodent Brain

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in which functional MRI data and in vivo intracortical recording can be performed simultaneously. The combination of MRI and electrical recording is technically challenging because the electrodes used for recording distort the MRI images and the MRI acquisition induces noise in the electrical recording. To minimize the mutual interference of the two modalities, glass microelectrodes were used rather than metal and a noise removal algorithm was implemented for the electrophysiology data. In our studies, two microelectrodes were separately implanted in bilateral primary somatosensory cortices (SI) of the rat and fixed in place. One coronal slice covering the electrode tips was selected for functional MRI. Electrode shafts and fixation positions were not included in the image slice to avoid imaging artifacts. The removed scalp was replaced with toothpaste to reduce susceptibility mismatch and prevent Gibbs ringing artifacts in the images. The artifact structure induced in the electrical recordings by the rapidly-switching magnetic fields during image acquisition was characterized by averaging all cycles of scans for each run. The noise structure during imaging was then subtracted from original recordings. The denoised time courses were then used for further analysis in combination with the fMRI data. As an example, the simultaneous acquisition was used to determine the relationship between spontaneous fMRI BOLD signals and band-limited intracortical electrical activity. Simultaneous fMRI and electrophysiological recording in the rodent will provide a platform for many exciting applications in neuroscience in addition to elucidating the relationship between the fMRI BOLD signal and neuronal activity.

We have developed a method for simultaneous functional magnetic resonance imaging and electrophysiological recording in the rodent brain, providing a platform for the investigation of the relationship between neural activity and the blood oxygenation level dependent (BOLD) MRI signal.

IRMf simultanées et l&#39;électrophysiologie dans le cerveau de rongeurs

To examine the neural basis of the blood oxygenation level dependent (BOLD) magnetic resonance imaging (MRI) signal, we have developed a rodent model in ...

Recherche

Neurosciences

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

Méthodes pour l&#39;étude de la morphogenèse neuronale:<em&gt; Ex vivo</em&gt; Électroporation ARNi dans embryonnaire cortex cérébral murin

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date this tool has been widely used to study the regulation of cellular proliferation, differentiation and neuronal migration especially in the developing cerebral cortex 6-8. Here we detail our protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus and provide evidence that this approach can be used to study dendrites and spines in these two cerebral regions.
Visualization and manipulation of neurons in primary cultures have contributed to a better understanding of the processes involved in dendrite, spine and synapse development. However neurons growing in vitro are not exposed to all the physiological cues that can affect dendrite and/or spine formation and maintenance during normal development. Our knowledge of dendrite and spine structures in vivo in wild-type or mutant mice comes mostly from observations using the Golgi-Cox method 9. However, Golgi staining is considered to be unpredictable. Indeed, groups of nerve cells and fiber tracts are labeled randomly, with particular areas often appearing completely stained while adjacent areas are devoid of staining. Recent studies have shown that IUE of fluorescent constructs represents an attractive alternative method to study dendrites, spines as well as synapses in mutant / wild-type mice 10-11 (Figure 1A). Moreover in comparison to the generation of mouse knockouts, IUE represents a rapid approach to perform gain and loss of function studies in specific population of cells during a specific time window. In addition, IUE has been successfully used with inducible gene expression or inducible RNAi approaches to refine the temporal control over the expression of a gene or shRNA 12. These advantages of IUE have thus opened new dimensions to study the effect of gene expression/suppression on dendrites and spines not only in specific cerebral structures (Figure 1B) but also at a specific time point of development (Figure 1C).
Finally, IUE provides a useful tool to identify functional interactions between genes involved in dendrite, spine and/or synapse development. Indeed, in contrast to other gene transfer methods such as virus, it is straightforward to combine multiple RNAi or transgenes in the same population of cells. 
In summary, IUE is a powerful method that has already contributed to the characterization of molecular mechanisms underlying brain function and disease and it should also be useful in the study of dendrites and spines.

Visualization and Genetic Manipulation of Dendrites and Spines in the Mouse Cerebral Cortex and Hippocampus using In utero Electroporation

This article describes in detail a protocol to electroporate in utero the cerebral cortex and the hippocampus at E14.5 in mice. We also show that this is a valuable method to study dendrites and spines in these two cerebral regions.

Visualisation et la manipulation génétique des dendrites et des épines dans le cortex cérébral et l&#39;hippocampe de souris à l&#39;aide<em&gt; In utero</em&gt; Électroporation

In utero electroporation (IUE) has become a powerful technique to study the development of different regions of the embryonic nervous system 1-5. To date ...

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

Deux enregistrements électrophysiologiques des synapses-réponses évoquées astrogliales et neuronales aiguës dans des coupes d&#39;hippocampe

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution has been a long sought tool for neuroscientists in the systems-level search for the neural circuitry governing complex behavioral states. Optogenetics is a cutting-edge tool that is revolutionizing the field of neuroscience and represents one of the first systematic approaches to enable causal testing regarding the relation between neural signaling events and behavior. By combining optical and genetic approaches, neural signaling can be bi-directionally controlled through expression of light-sensitive ion channels (opsins) in mammalian cells. The current protocol describes delivery of specific wavelengths of light to opsin-expressing cells in deep brain structures of awake, freely-moving rodents for neural circuit modulation. Theoretical principles of light transmission as an experimental consideration are discussed in the context of performing in vivo optogenetic stimulation. The protocol details the design and construction of both simple and complex laser configurations and describes tethering strategies to permit simultaneous stimulation of multiple animals for high-throughput behavioral testing.

In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System

Optogenetics has become a powerful tool for use in behavioral neuroscience experiments. This protocol offers a step-by-step guide to the design and set-up of laser systems, and provides a full protocol for carrying out multiple and simultaneous in vivo optogenetic stimulations compatible with most rodent behavioral testing paradigms.

In vivo optogénétiques stimulation du système nerveux central pour rongeurs

The ability to probe defined neural circuits in awake, freely-moving animals with cell-type specificity, spatial precision, and high temporal resolution ...

Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools to selectively manipulate brain rhythms. Here we describe an approach combining projection-specific optogenetics with extracellular electrophysiology for high-fidelity control of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The specificity of the optogenetic entrainment is achieved by targeting channelrhodopsin-2 (ChR2) to the GABAergic population of medial septal cells, crucially involved in the generation of hippocampal theta oscillations, and a local synchronized activation of a subset of inhibitory septal afferents in the hippocampus. The efficacy of the optogenetic rhythm control is verified by a simultaneous monitoring of the local field potential (LFP) across lamina of the CA1 area and/or of neuronal discharge. Using this readily implementable preparation we show efficacy of various optogenetic stimulation protocols for induction of theta oscillations and for the manipulation of their frequency and regularity. Finally, a combination of the theta rhythm control with projection-specific inhibition addresses the readout of particular aspects of the hippocampal synchronization by efferent regions.

We describe the use of optogenetics and electrophysiological recordings for selective manipulations of hippocampal theta oscillations (5-10 Hz) in behaving mice. The efficacy of the rhythm entrainment is monitored using local field potential. A combination of opto- and pharmacogenetic inhibition addresses the efferent readout of hippocampal synchronization.

Optogenetic entraînement des Oscillations thêta hippocampique en comportement des souris

Extensive data on relationships of neural network oscillations to behavior and organization of neuronal discharge across brain regions call for new tools ...

Combined Transcranial Magnetic Stimulation and Electroencephalography of the Dorsolateral Prefrontal Cortex

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic field pulses. The initiation of cortical activation or its modulation depends on the background activation of the neurons of the cortical region activated, the characteristics of the coil, its position and its orientation with respect to the head. TMS combined with simultaneous electrocephalography (EEG) and neuronavigation (nTMS-EEG) allows for the assessment of cortico-cortical excitability and connectivity in almost all cortical areas in a reproducible manner. This advance makes nTMS-EEG a powerful tool that can accurately assess brain dynamics and neurophysiology in test-retest paradigms that are required for clinical trials. Limitations of this method include artifacts that cover the initial brain reactivity to stimulation. Thus, the process of removing artifacts may also extract valuable information. Moreover, the optimal parameters for dorsolateral prefrontal (DLPFC) stimulation are not fully known and current protocols utilize variations from the motor cortex (M1) stimulation paradigms. However, evolving nTMS-EEG designs hope to address these issues. The protocol presented here introduces some standard practices for assessing neurophysiological functioning from stimulation to the DLPFC that can be applied in patients with treatment resistant psychiatric disorders that receive treatment such as transcranial direct current stimulation (tDCS), repetitive transcranial magnetic stimulation (rTMS), magnetic seizure therapy (MST) or electroconvulsive therapy (ECT).

The protocol presented here is for TMS-EEG studies utilizing intracortical excitability test-retest design paradigms. The intent of the protocol is to produce reliable and reproducible cortical excitability measures for assessing neurophysiological functioning related to therapeutic interventions in the treatment of neuropsychiatric diseases such as major depression.

La Stimulation magnétique transcrânienne combinée et électroencéphalographie du Cortex préfrontal dorsolatéral

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive method that produces neural excitation in the cortex by means of brief, time-varying magnetic ...

Simultaneous Cryosectioning of Multiple Rodent Brains

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In neuroscience, as well as a plethora of other scientific fields, these techniques are used. Immunohistochemistry can be done on slide mounted tissue or free-floating sections. Preparing slide-mounted samples is a time intensive process. The following protocol for a technique, called the Megabrain, reduced the time taken to cryosection and mount brain tissue by up to 90% by combining multiple brains into a single frozen block. Furthermore, this technique reduced variability seen between staining rounds, in a large histochemical study. The current technique has been optimized for using rodent brain tissue in downstream immunohistochemical analyses; however, it can be applied to different scientific fields that use cryosectioning.

Here, we present a protocol to freeze and section brain tissue from multiple animals as a timesaving alternative to processing single brains. This reduces staining variability during immunohistochemistry and reduces time cryosectioning and imaging.

Cryosectioning simultanée de plusieurs cerveaux de rongeurs

Histology and immunohistochemistry are routine methods of analysis to visualize microscopic anatomy and localize proteins within biological tissue. In ...