Nous remercions le Dr Christophe Masselon (IRTV, CEA, Grenoble) et les membres de l&#39;infection virale et cancer à l&#39;IBS, pour leur évaluation critique du manuscrit et pour des discussions utiles. Nous sommes reconnaissants à Cyril Dian pour le genre de cadeau de la protéine CRM1. Ce travail scientifique a eu lieu dans le centre de spectrométrie de masse de Grenoble Centre Instruire (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UJF-EMBL). Il a été soutenu financièrement par l&#39;infrastructure française Initiative de biologie structurale intégrée (FRISBI, ANR-10-INSB-05-02) pour, GRAL (ANR-10-labx-49-01) [au sein du Partenariat de Grenoble pour la Biologie Structurale] et par le Centre national français de la recherche scientifique (CNRS).

Une. Préparation de protéines de l&#39;échantillon: tampon Exchange (Facultatif) 5-25 ul de concentrations micromolaires de protéine (1 à 20 uM) sont nécessaires. échange de tampon peut être effectuée en utilisant des dispositifs d&#39;ultrafiltration centrifuge (par exemple Vivaspin, Sartorius) ou des colonnes de gel de filtration à centrifuger (par exemple, Micro Bio-Spin 6 colonnes de chromatographie, Bio-Rad) 29,30. échange de tampon étapes peuvent être répétées 2-3x. Description détaillée de l&#39;échange de tampon a déjà été présenté 29,30. Par exemple, nous utilisons 20 mM de tris (hydroxyméthyl) aminométhane (Tris ie) de pH 8 en tant que tampon final. Remarque: Cette étape peut être omise dans de nombreux cas. Il doit être effectué quand un échantillon de la protéine contient des molécules ou des tampons qui pourraient fortement interférer avec la détection MS [par exemple, le glycerol, le 4 - (2-hydroxyéthyl)-1-piperazineethanesulfonic acide, HEPES]. Il est également utile pour améliorer la qulité des spectres. 2. Recristallisation de matrices afin d&#39;améliorer leur pureté (Facultatif) <ol><li> Verser 10 ml d&#39;éthanol à 40% (EtOH) dans un ballon en Pyrex. </li><li> Ajouter 600 mg d&#39;une matrice. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un bain d&#39;eau et un élément chauffant à résistance, réchauffer la solution de matrice et agiter jusqu&#39;à ce que la matrice soit complètement dissous à l&#39;aide d&#39;une tige de verre ou d&#39;un agitateur magnétique. </li><li> Répétez l&#39;étape 2 jusqu&#39;à ce que vous avez une solution saturée. </li></ol> Remarque: L&#39;utilisation d&#39;un trop grand volume de solvant ou de dissoudre la matrice de loin inférieure au point de la solution en ébullition provoque un mauvais rendement en cristaux ou pas de cristaux du tout. <ol start="5"><li> Laisser la solution refroidir lentement. Vous pouvez le laisser à température ambiante pendant plusieurs heures, puis à 4 ° C pendant la nuit. Remarque: si des cristaux ne se forment pas, la cristallisation peut être induite par grattage de l&#39;intérieur du gobelet (juste en dessous de la surface de la solution) à l&#39;aide d&#39;un agitateur de verre. </li><li> Recueillir les cristaux de la matrice par filtration. </li><li> Rincer les cristaux avec une quantité minimale de solvant par de la glace et filtrer eux. </li><li> Laissez les cristaux sécher. Vous pouvez utiliser le vide pour cette étape. </li></ol> 3. Nettoyage de MALDI acier inoxydable cible <ol><li> Rincer la plaque MALDI avec du méthanol (MeOH) et essuyez délicatement avec un chiffon de nettoyage spécialement conçu pour les applications de laboratoire (par exemple Kimwipe). </li><li> Rincer la cible avec H 2 O et l&#39;essuyer avec un tissu de nettoyage. </li><li> Insérez la plaque MALDI dans un bécher de 600 ml et couvrir avec 50% EtOH. </li><li> Soniquer la cible dans la solution EtOH pendant 10 min dans un bain à ultrasons. </li><li> Si il ya des résidus restant sur la plaque, répétez les étapes 1-4 encore une fois. </li><li> Enfin, rincez la cible avec MeOH (ou avec de l&#39;eau, voir la note ci-dessous), l&#39;incliner de manière que tout le liquide est recueilli sur un tissu de nettoyage. Laissez la cible sec à température ambiante ou en utilisant un azotedébit de gaz. </li></ol> Remarque: Une procédure similaire a déjà été décrite 15. Remarque: le solvant (MeOH ou de l&#39;eau) utilisé pour le dernier rinçage de la cible détermine des caractéristiques de cibles. Si la cible est rincée avec du MeOH, l&#39;échantillon se propage sur la cible beaucoup plus que l&#39;utilisation de l&#39;eau. 4. Solution de couche α-CHCA mince: Préparation et dépôt sur la cible MALDI <ol><li> Dissoudre α-CHCA dans de l&#39;acétone pour obtenir une solution saturée. </li><li> À la main (sans pipette) tremper un pourboire de 10 pi (par exemple GELoader Conseil, Eppendorf) dans une solution saturée α-CHCA: une petite quantité de la solution s&#39;écoule dans la pointe (par capillarité). </li><li> Touchez très rapidement (soit 1 sec) la cible MALDI avec la pointe de la pipette et déposer la solution d&#39;acétone α-CHCA sur la cible MALDI. Cela constituera la couche mince formant matrice, où la protéineéchantillon sera déposé. Tenter de générer un spot de couche mince le plus petit possible. </li></ol> Remarque: Lors de l&#39;utilisation SA matrice, nous préparons une couche mince en utilisant une solution saturée de SA dans de l&#39;acétone. 5. Préparation de Natrix Solutions: SA, α-CHCA, DHB et CHCA_DHB Mélange 25 <ol><li> Préparer une solution à 20 mg / ml dans de l&#39;ACN SA, TFA à 0,1% (70:30, v / v). </li><li> Préparer une solution à 20 mg / ml α-CHCA dans l&#39;ACN et de 5% d&#39;acide formique (70:30, v / v) [appelé aussi &quot;solution α-CHCA&quot;]. </li><li> Préparer une / solution de DHB ml à 20 mg dans l&#39;ACN et 0,1% d&#39;acide trifluoroacétique (TFA) (70:30, v / v) [désigné comme «solution de DHB»]. </li><li> Mélanger &quot;solution α-CHCA&quot; et &quot;solution de DHB» dans un rapport de 1:1 (vol / vol), pour obtenir la &quot;solution de CHCA_DHB&quot;. </li></ol> Remarque: On peut mélanger &quot;solution α-CHCA» et «solution de DHB&quot; dans différents rapports, l&#39;analyse de protéines avec une masse inférieure à 100 kDa. Pour EXAmple un ratio de 40:60 entre les α-CHCA et DHB (vol / vol), on obtient une meilleure résolution, mais moins de sensibilité (voir la discussion). 6. Le dépôt de l&#39;échantillon sur la cible MALDI <ol><li> Dépôt de 0,5 ul de l&#39;échantillon de protéine sur la couche mince de α-CHCA précédemment préparé. Immédiatement après, ajouter 0,5 pi de la solution de matrice (c&#39;est à dire la solution SA ou la solution α-CHCA ou le &quot;mix CHCA_DHB&quot;). Cela implique le mélange de l&#39;échantillon et de la matrice sur la cible. </li></ol> Remarque: Généralement on mélange l&#39;échantillon de protéines avec la matrice dans un rapport de 1:1. Ce rapport est essentiel pour la bonne qualité des spectres MALDI. Si vous souhaitez tester concentrations des échantillons différents, vous pouvez utiliser la solution d&#39;acide ACN_formic (décrit ci-dessus) pour diluer l&#39;échantillon. Remarque: Si vous préférez, vous pouvez mélanger l&#39;échantillon et la matrice dans un tube, puis déposer le mélange &quot;sample_matrix solutiontion &quot;sur la couche mince. Note: Nous vous suggérons de tester différentes concentrations de l&#39;échantillon parce dilution de l&#39;échantillon permet de réduire l&#39;interférence des contaminants. Pour diluer l&#39;échantillon, vous pouvez utiliser la solution d&#39;acide ACN_formic (décrit ci-dessus) pour diluer l&#39;échantillon. 7. Calibrant dépôt <ol><li> Caution 0,5 pi de la norme d&#39;étalonnage (par exemple &quot;standard de protéine II&quot;, Bruker, Brême), puis ajouter 0,5 pi de la solution de matrice. </li></ol> Remarque: Chargez le calibrant sur ​​la plaque MALDI à côté des points d&#39;échantillons de protéines (voir la discussion). 8. MALDI Spectra Acquisition de Calibrant et échantillons de protéines Une fois les échantillons et l&#39;étalon sont séchées, vous pouvez observer les &quot;spots&quot; sous un microscope. Cette observation est facultative et peut être intéressant principalement aux novices. Pour acquérir l&#39;échantillon spectres, insérez ee cible dans l&#39;instrument MALDI-TOF et choisissez les paramètres appropriés instrumentales qui sont différentes pour chaque type d&#39;équipement. Pour obtenir la mise en place la plus appropriée il faut suivre les recommandations du fabricant. Comme considérations générales lors de l&#39;analyse des protéines intactes, on devrait utiliser l&#39;appareil en mode linéaire (pas en mode de réflexion, ce qui est approprié pour des peptides analyses). Normalement, nous utilisons notre instrument en mode ions positifs. En outre, un paramètre clé est la &quot;extraction d&#39;ions pulsé&quot; qui améliore la résolution instrumentale 31. En termes simples, la &quot;extraction d&#39;ions pulsé&quot; peut être définie comme une pause entre la génération des ions de l&#39;échantillon et le moment où les ions sont accélérés vers le détecteur. Lors de l&#39;analyse des protéines intactes, il faut utilisé une &quot;extraction d&#39;ions pulsé&quot; (par exemple 500 ns) de plus que lors de l&#39;observation des peptides (par exemple 80 ns). Choisissez la gamme appropriée m / z, d&#39;acquérir les spectres of l&#39;étalonnage, et calibrer l&#39;instrument. Lorsque vous achetez les spectres de vos échantillons, utiliser l&#39;intensité du laser approprié (voir la discussion).

<ol>
	<li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Biomolecular Crystallography : Principles, Practice, and Application to Structural Biology. , (2010).</li><li>Cohen, S. L., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+as+a+tool+for+protein+crystallography.">Mass spectrometry as a tool for protein crystallography.</a> Annual review of biophysics and biomolecular structure. 30, 67-85 (2001).</li><li>Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry--a+useful+tool+for+the+protein+X-ray+crystallographer+and+NMR+spectroscopist.">Mass spectrometry--a useful tool for the protein X-ray crystallographer and NMR spectroscopist.</a> Structure. 2, 465-467 (1994).</li><li>Gans, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stereospecific+isotopic+labeling+of+methyl+groups+for+NMR+spectroscopic+studies+of+high-molecular-weight+proteins.">Stereospecific isotopic labeling of methyl groups for NMR spectroscopic studies of high-molecular-weight proteins.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 49, 1958-1962 (2010).</li><li>Wilm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+electrospray+ionization.">Principles of electrospray ionization.</a> Molecular &amp; cellular proteomics : MCP. 10, M111 009407 (2011).</li><li>Urban, P. L., Amantonico, A., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lab-on-a-plate:+extending+the+functionality+of+MALDI-MS+and+LDI-MS+targets.">Lab-on-a-plate: extending the functionality of MALDI-MS and LDI-MS targets.</a> Mass spectrometry reviews. 30, 435-478 (2011).</li><li>De Hoffmann, E., Stroobant, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry: Principles and Applications. , (2007).</li><li>Karas, M., Hillenkamp, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+desorption+ionization+of+proteins+with+molecular+masses+exceeding+10,000+daltons.">Laser desorption ionization of proteins with molecular masses exceeding 10,000 daltons.</a> Analytical chemistry. 60, 2299-2301 (1988).</li><li>Spengler, B., Cotter, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultraviolet+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+proteins+above+100,000+daltons+by+pulsed+ion+extraction+time-of-flight+analysis.">Ultraviolet laser desorption/ionization mass spectrometry of proteins above 100,000 daltons by pulsed ion extraction time-of-flight analysis.</a> Analytical chemistry. 62, 793-796 (1990).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+molecular+mass+determination+of+proteins+using+matrix-assisted+laser+desorption+mass+spectrometry.">High-accuracy molecular mass determination of proteins using matrix-assisted laser desorption mass spectrometry.</a> Analytical chemistry. 62, 1836-1840 (1990).</li><li>Hillenkamp, F., Karas, M., Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+of+biopolymers.">Matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry of biopolymers.</a> Analytical chemistry. 63, 1193A-1203A (1991).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Matrix-assisted+laser+desorption+ionization+mass-spectrometry+of+proteins.">Matrix-assisted laser desorption ionization mass-spectrometry of proteins.</a> Methods in enzymology. 270, 519-551 (1996).</li><li>Xiang, F., Beavis, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+increase+contaminant+tolerance+in+protein+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+by+the+fabrication+of+thin+protein-doped+polycrystalline+films.">A method to increase contaminant tolerance in protein matrix-assisted laser desorption/ionization by the fabrication of thin protein-doped polycrystalline films.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 8, 199-204 (1994).</li><li>Cadene, M., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+robust,+detergent-friendly+method+for+mass+spectrometric+analysis+of+integral+membrane+proteins.">A robust, detergent-friendly method for mass spectrometric analysis of integral membrane proteins.</a> Analytical chemistry. 72, 5655-5658 (2000).</li><li>Fenyo, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI+sample+preparation:+the+ultra+thin+layer+method.">MALDI sample preparation: the ultra thin layer method.</a> J. Vis. Exp.. (3), e192 (2007).</li><li>Gabant, G., Cadene, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mass+spectrometry+of+full-length+integral+membrane+proteins+to+define+functionally+relevant+structural+features.">Mass spectrometry of full-length integral membrane proteins to define functionally relevant structural features.</a> Methods. 46, 54-61 (2008).</li><li>Hook, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+range+allosteric+control+of+cytoplasmic+dynein+ATPase+activity+by+the+stalk+and+C-terminal+domains.">Long range allosteric control of cytoplasmic dynein ATPase activity by the stalk and C-terminal domains.</a> The Journal of biological chemistry. 280, 33045-33054 (2005).</li><li>Vorm, O., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+sequence+information+derived+by+partial+acid+hydrolysis+and+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry.">Peptide sequence information derived by partial acid hydrolysis and matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry.</a> Biological mass spectrometry. 23, 734-740 (1994).</li><li>Beavis, R. C., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cinnamic+acid+derivatives+as+matrices+for+ultraviolet+laser+desorption+mass+spectrometry+of+proteins.">Cinnamic acid derivatives as matrices for ultraviolet laser desorption mass spectrometry of proteins.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 3, 432-435 (1989).</li><li>Madler, S., Boeri Erba, ., E, R., Zenobi, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MALDI-ToF+Mass+Spectrometry+for+Studying+Noncovalent+Complexes+of+Biomolecules.">MALDI-ToF Mass Spectrometry for Studying Noncovalent Complexes of Biomolecules.</a> Topics in current chemistry. , (2012).</li><li>Wortmann, A., Pimenova, T., Alves, S., Zenobi, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigation+of+the+first+shot+phenomenon+in+MALDI+mass+spectrometry+of+protein+complexes.">Investigation of the first shot phenomenon in MALDI mass spectrometry of protein complexes.</a> The Analyst. 132, 199-207 (2007).</li><li>Beavis, R. C., Chaudhary, T., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic+Acid+as+a+Matrix+for+Matrix-assisted+Laser+Desorption+Mass+Spectrometry.">Alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry.</a> Organic Mass Spectrometry. 27, 156-158 (1992).</li><li>Liu, Z., Schey, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+a+MALDI+TOF-TOF+mass+spectrometer+for+intact+protein+analysis.">Optimization of a MALDI TOF-TOF mass spectrometer for intact protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16, 482-490 (2005).</li><li>Gorka, J., Bahr, U., Karas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Graphite+supported+preparation+(GSP)+of+alpha-cyano-4-hydroxycinnamic+acid+(CHCA)+for+matrix-assisted+laser+desorption/ionization+mass+spectrometry+(MALDI-MS)+for+peptides+and+proteins.">Graphite supported preparation (GSP) of alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA) for matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS) for peptides and proteins.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 23, 1949-1954 (2012).</li><li>Laugesen, S., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combination+of+two+matrices+results+in+improved+performance+of+MALDI+MS+for+peptide+mass+mapping+and+protein+analysis.">Combination of two matrices results in improved performance of MALDI MS for peptide mass mapping and protein analysis.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 14, 992-1002 (2003).</li><li>Sparkman, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mass Spectrometry Desk Reference. , (2000).</li><li>Kussmann, M., Roepstorff, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sample+preparation+techniques+for+peptides+and+proteins+analyzed+by+MALDI-MS.">Sample preparation techniques for peptides and proteins analyzed by MALDI-MS.</a> Methods Mol Biol. 146, 405-424 (2000).</li><li>Wang, R., Chait, B. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-accuracy+mass+measurement+as+a+tool+for+studying+proteins.">High-accuracy mass measurement as a tool for studying proteins.</a> Current opinion in biotechnology. 5, 77-84 (1994).</li><li>Kirshenbaum, N., Michaelevski, I., Sharon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+large+protein+complexes+by+structural+mass+spectrometry.">Analyzing large protein complexes by structural mass spectrometry.</a> J. Vis. Exp. (40), e1954 (2010).</li><li>Hernandez, H., Robinson, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+stoichiometry+and+interactions+of+macromolecular+assemblies+from+mass+spectrometry.">Determining the stoichiometry and interactions of macromolecular assemblies from mass spectrometry.</a> Nature protocols. 2, 715-726 (2007).</li><li>Vestal, M. L., Juhasz, P., Martin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delayed+extraction+matrix-assisted+laser+desorption+time-of-flight+massspectrometry.">Delayed extraction matrix-assisted laser desorption time-of-flight massspectrometry.</a> Rapid Communications in Mass Spectrometry. 9, 1044-1050 (1995).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Nous avons présenté un protocole de détail d&#39;acquérir spectres de masse de haute qualité de grandes protéines intactes avec des poids moléculaires de plus de 100 kDa, en utilisant un instrument MALDI-TOF. Un certain nombre d&#39;aspects critiques concernant la préparation de l&#39;échantillon doit être considéré avec soin dans le but d&#39;améliorer la qualité des spectres de masse. Les matrices et des solvants de haute pureté sont d&#39;une importance critique parce que tous les contaminants présents dans les matrices et les solvants sont concentrés sur la cible MALDI après évaporation du solvant. Afin d&#39;améliorer la pureté des matrices MALDI, il est possible de les purifier en utilisant des procédés classiques de recristallisation (voir ci-dessus). Nous vous recommandons également de préparer les solutions fraîchement matrices (au moins une fois par semaine) pour améliorer la cristallisation de la matrice et pour éviter la dégradation de la matrice. L&#39;approche de dépôt de la matrice est très critique pour la qualité finale des spectres. Comme décrit ci-dessus, le procédé en couche mince est notre méthode of choix 12. De plus, nous avons optimisé l&#39;approche pour le dépôt de la première couche. Lorsque la matrice est dissoute dans de l&#39;acétone pour obtenir une solution saturée, le propanone permet l&#39;évaporation rapide du solvant, mais rend également la taille de la première couche est très difficile à contrôler. Nous vous suggérons d&#39;utiliser une pointe de GELoader comme petite brosse que vous trempez dans la solution de matrix_acetone pour obtenir un volume minimal qui vous déposez rapidement sur la cible. La taille de la première couche contrôle en quelque sorte la taille finale de la tache MALDI: une petite tache (à savoir 0,5-0,75 mm de diamètre) est préférable, car dans ce cas, la concentration de l&#39;échantillon est plus élevé que dans le cas d&#39;une grande tache. Obtention d&#39;un petit point diffère de l&#39;approche de la couche ultra-mince précédemment proposé dans une vidéo JOVE 15. En Fenyo et al. La solution de couche mince est répandu dans la cible MALDI utilisant le côté de la pointe de la pipette. Cette approche nécessite de tester la couche mince qui doit répondre à des critères spécifiques(Par exemple la vitesse de l&#39;évaporation du solvant). Si le critère n&#39;est pas respecté, la cible MALDI doit être lavé et une nouvelle couche mince doit être préparé. Cela rend la préparation assez laborieuse pour un novice. En outre, le dépôt de mélange échantillon / matrice sur la plaque nécessite l&#39;aspiration de l&#39;excès de solvant en utilisant une ligne de vide et une étape de lavage à l&#39;aide de TFA 15 est nécessaire, ce qui rend la Fenyo et al. Préparation un peu plus difficile que notre approche. Le rapport volumique entre la matrice et l&#39;échantillon est très important pour la réussite d&#39;une analyse de protéines intactes par MALDI-TOF. Après avoir testé différents rapports, nous vous conseillons d&#39;utiliser un rapport de 1:1. Une matrice différente: proportion de l&#39;échantillon pourrait compromettre la qualité des spectres, probablement due à la cristallisation homogène. L&#39;ordre dans lequel la matrice et l&#39;échantillon sont déposés est également critique. Après dépôt de la couche mince formant matrice, l&#39;échantillon est déposé et immédiatement après (avant la sample lieu devient sec), le mélange CHCA_DHB est ajouté. Cette procédure a été définie comme «méthode sandwich&quot; 27, où l&#39;échantillon seul est déposé entre deux couches de matrice. En variante, la solution de CHCA_DHB et l&#39;échantillon peuvent être mélangés dans 0,5 ml tube et ensuite déposés sur la couche mince 12 CHCA. Cela donne une place avec une couche homogène de cristaux obtenus dans les spectres de haute qualité. Lors de l&#39;analyse des protéines avec une masse inférieure à 100 kDa, la concentration de DHB peut être augmenté (par exemple 60:40 DHB: ACSSD), ce qui peut produire pic nette, mais pourrait compromettre la sensibilité de la mesure (c.-à-pics moins intenses). Pour un étalonnage correct, il est indispensable de déposer les normes calibrant très proches des points échantillons, permettant l&#39;obtention d&#39;une meilleure précision de la masse. Une «procédure d&#39;étalonnage pseudo-interne&quot; a déjà été suggéré 15: après l&#39;acquisition d&#39;un spectre de l&#39;échantillon, l&#39;étalon place is tir laser et le signal de l&#39;étalon sont ajoutés au spectre de l&#39;échantillon. Cela vous permet de calibrer l&#39;intérieur du spectre de l&#39;échantillon en utilisant les pics calibrant. L&#39;énergie du laser doit être aussi soigneusement contrôlée au cours de l&#39;acquisition de spectres. Dans la plupart des cas, l&#39;énergie est élevée, plus la sensibilité mais diminue la résolution. Nous vous suggérons d&#39;utiliser l&#39;énergie laser minimum possible sans compromettre la sensibilité de l&#39;acquisition. En outre, pour améliorer la qualité spectrale, on peut acquérir plus de coups sur chaque point échantillon. Normalement, les coups de feu plus vous acquérez (1000-2000 plans), plus l&#39;intensité du signal. Lorsque vous frappez la tache avec le laser, il faut trouver la bonne position (c&#39;est à dire &quot;sweet spot&quot;), puisque l&#39;échantillon n&#39;est pas distribuée de façon homogène. Vous pouvez tirer sur la même zone que le signal est en augmentation, et puis essayer de trouver une autre zone contenant l&#39;échantillon. En conclusion, une grande pureté de matrices et solvparents, les méthodes utilisées pour l&#39;échantillon et matrices dépôt sur la cible, la position des normes utilisées pour l&#39;étalonnage, l&#39;intensité de l&#39;énergie laser, le moment de l&#39;acquisition (nombre de coups / place) sont des facteurs critiques qu&#39;il faut prendre en compte lors de l&#39;analyse de protéines intactes par MALDI-TOF MS. Contributions des auteurs LS et EBE conçu les expériences, effectuées les expériences de spectrométrie de masse, ont analysé les données, et a écrit le manuscrit.

La biologie structurale repose sur la production de protéines de haute qualité 1 et a donc besoin d&#39;être couplée à des techniques efficaces et fiables pour l&#39;analyse des protéines 2,3. Dans notre spectrométrie de masse (MS) de laboratoire dans un institut de biologie structurale, nous devons vérifier la séquence primaire des protéines, d&#39;évaluer la présence de mutations et de modifications post-traductionnelles, la dégradation des protéines, l&#39;homogénéité de l&#39;échantillon, et la qualité de marquage isotopique (par exemple deutéré protéines pour des études de résonance magnétique nucléaire 4). Depuis biologie structurale utilisent protéolyse limitée de distinguer les domaines structurellement rigides de parties flexibles, nous avons besoin de caractériser de façon fiable ces protéines tronquées en utilisant MS. Lorsque biomolécules sont analysés par MS, deux approches possibles sont utilisés pour ioniser doucement ces molécules lourdes et labiles. Ionisation électrospray (ESI) ionise les molécules directement à partir de laphase liquide 5; désorption ionisation laser assistée par matrice (MALDI) exige que les biomolécules sont co-cristallisées avec des molécules organiques absorbant les ultraviolets (c.-à matrice molécules) 6. ESI à temps de vol (TOF) MS couplée à la Chromatographie liquide est devenue une technique de routine pour l&#39;analyse de protéines intactes, car elle permet de déterminer la masse avec une précision élevée (≤ 50 ppm). Cependant, il est tout à fait sensible à la composition du tampon d&#39;échantillon (en particulier pour les détergents et les sels) et de contaminants (par exemple des polymères), qui sont parfois difficiles à éliminer, ce qui provoque la suppression du signal de l&#39;analyte. MALDI-TOF MS représente une alternative efficace au ESI-MS, car son rendement est moins affectée par des composants tampons, des détergents et des contaminants, et permet à la protéine intacte détermination de la masse avec une précision suffisante (≤ 500 ppm) pour la validation de la séquence. Après protein digestion, MALDI-TOF MS peut également être utilisé pour analyser les peptides obtenus pour une confirmation supplémentaire de la séquence primaire de la soi-disant «peptide de masse des empreintes digitales&quot;. En nos mains, la détermination de la masse de protéines intactes qui sont plus grandes que 100 kDa et hétérogène (due à des modifications ou des troncatures), est plus facile par MALDI-MS que par ESI-MS. Cela est dû à l&#39;absence de distributions d&#39;état de charge qui se chevauchent présentes dans les spectres ESI. De plus, puisque le procédé MALDI ne dépend pas de la taille de l&#39;analyte 7, de tels rendements de procédé haute sensibilité lorsqu&#39;une masse biomolécule est supérieur à 100 kDa. Analyses remarquables de protéines intactes ont été effectuées en utilisant des instruments faits maison entre la fin des années 1980 et le début des années 1990 de 8-11. MALDI-TOF peut également être utilisé comme outil de criblage pour évaluer la qualité des échantillons de protéines, car il nécessite moins de temps pour la préparation de l&#39;échantillon et est moins sensible à INTERFERENCES dues à des impuretés courantes (par exemple sels). Après une première évaluation rapide par MALDI-MS, un échantillon peut être analysé en outre par ESI-TOF pour déterminer sa masse avec une précision plus élevée. En outre, MALDI génère des ions contenant moins de charges que ESI et donc l&#39;acquisition et l&#39;interprétation des données MALDI est plus simple. Cela permet aux étudiants travaillant dans la biologie structurale à analyser leurs protéines recombinantes juste après une brève formation. Deux facteurs principaux influent sur ​​la qualité des spectres MALDI: de la matrice et de la technique utilisée pour le dépôt de la matrice (par exemple des gouttelettes séchées 8 et la couche mince 12-16,17,18). Une matrice organique unique [par exemple l&#39;acide sinapinique (SA) 19-21 ou-4-hydroxycinnamique α-cyano acide (α-ACSSD) 14,22,23] est souvent utilisé pour l&#39;examen des protéines intactes et des complexes de protéines réticulées MS . Utilisation α-CHCA, groupe Chait déjà présenté un protocole détaillé pour preparing une couche ultra-mince avant l&#39;analyse MALDI de protéines solubles et membranaires 14,15. Récemment, Gorka et al. Illustré la couche de cible à base de graphite pour améliorer l&#39;analyse MALDI de peptides et de protéines en utilisant des α-CHCA comme matrice 24. Ici, nous présentons un protocole simple pour l&#39;analyse de protéines intactes par MALDI-TOF MS, en utilisant un mélange de deux matrices: l&#39;acide 2,5-dihydroxybenzoïque (DHB) et l&#39;α-CHCA 25. Nous avons systématiquement évalué les performances du mélange DHB-CHCA rapport aux matrices SA et α-CHCA, pour le contrôle des protéines intactes. Le mélange de la matrice permet une meilleure résolution (c&#39;est à dire les pics de protéines sont beaucoup plus nettes). En outre, la présence d&#39;intenses charges multiples ions (c. M +2 H 2 +, M +3 H 3 +, etc) permet une détermination de la masse plus précis parce que la résolution des instruments MALDI-TOF axiales est supérieure à la masse inférieure sur charge (m / z) 26. Ceci est particulièrement utile pour la détermination du poids moléculaire des protéines de plus de 100 kDa. Sensibilité plus élevée est également accessible avec le mélange DHB-CHCA (0,5 pmoles de protéines repéré sur la cible MALDI). Comme nous l&#39;avons mentionné ci-dessus, un facteur important qui doit être considéré lors de l&#39;utilisation instrument MALDI est le dépôt de matrice. Laugesen et al. Ont proposé l&#39;utilisation de mélange DHB-CHCA pour la première fois 25, en utilisant le dépôt de gouttelettes séchées. Cependant, nous avons observé de meilleurs résultats (par exemple de sensibilité beaucoup plus élevée) lorsque nous avons utilisé le procédé en couche mince où la première couche est formée par la α-CHCA dissous dans de l&#39;acétone. La couche mince Procédé 12,27 implique la formation d&#39;un substrat homogène des cristaux de la matrice sur la cible MALDI, qui a été décrit dans une vidéo Jupiter 15 précédemment. Ensuite, l&#39;échantillon est déposé sur ce substrat, et enfinmatrice supplémentaire est déposé (voir ci-dessous). Dans cet article, nous illustrons également comment déposer l&#39;échantillon sur la cible MALDI, mais aussi la façon de nettoyer l&#39;objectif de 15, la recristallisation, et préparons les matrices. Pour conclure, nous visons à fournir toutes les informations nécessaires à l&#39;analyse des protéines intactes pour les scientifiques (en particulier, les biologistes structurels) qui ont besoin d&#39;évaluer la qualité des protéines produites de manière rapide et simple et qui ne sont pas si familier avec MALDI-TOF MS. Comme prévu à la mi-1990 28, MS a eu un impact accru sur la recherche biologique, que la possibilité de biologistes a augmenté. Nous espérons que les informations que nous avons fourni sera utile pour faire MALDI-TOF accessible aux biologistes et scientifiques qui souhaitent commencer à utiliser la spectrométrie de masse.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizma hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T3253</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trizima</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T6066</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Bio-Spin 6 chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>732-6221</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vivaspin 500</td>
			<td>Sartorius</td>
			<td>VS0122</td>
			<td>various molecular weight cut off</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>14262</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>02860</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KIMTECH SCIENCE Precision Wipes Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly Clark</td>
			<td>05511</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&alpha;-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C8982</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>650501</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,5-dihydroxybenzoic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>39319</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GELoader Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030 001.222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34998</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic acid</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>09676</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trifluoroacetic acid</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>302031</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein Standard II</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>207234</td>
			<td>It contains Trypsinogen, Protein A, Serum Albumin-Bovine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immunoglobulin G</td>
			<td>ABSciex</td>
			<td>GEN602151</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>[header]</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water purifier PURELAB Ultra Analytic</td>
			<td>ELGA LabWater</td>
			<td>89204-052</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoflex MALDI-TOF instrument</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MALDI-TOF target</td>
			<td>Bruker Daltonics</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight (maldi-tof) mass spectrometric analysis of intact proteins larger than 100 kda

Déterminer efficacement des masses de protéines est essentielle pour de nombreuses études biologiques (par exemple pour les enquêtes de biologie structurale). Détermination de la masse exacte permet d&#39;évaluer l&#39;exactitude de séquences primaires de protéines, la présence de mutations et / ou des modifications post-traductionnelles, la dégradation possible de la protéine, l&#39;homogénéité de l&#39;échantillon, et la mesure de l&#39;incorporation d&#39;isotopes dans les cas d&#39;un marquage (par exemple, 13 d&#39;étiquetage de C ). Ionisation par électrospray (ESI), la spectrométrie de masse (MS) est largement utilisée pour la détermination de la masse de protéines dénaturées, mais son efficacité dépend de la composition du tampon d&#39;échantillon. En particulier, la présence de sels, de détergents, et les contaminants compromet sérieusement l&#39;efficacité de l&#39;analyse des protéines par ESI-MS. Désorption laser assistée par matrice / ionisation (MALDI) MS est une alternative intéressante, en raison de sa tolérance à la salinité et à la simplicité de l&#39;acquisition des données et l&#39;interprétationtion. En outre, la détermination de la masse des grosses protéines hétérogènes (plus grande que 100 kDa) est facilitée par MALDI-MS en raison de l&#39;absence de chevauchement des distributions de l&#39;état de charge élevées qui sont présentes dans les spectres ESI. Nous présentons ici une approche accessible pour l&#39;analyse des protéines de plus de 100 kDa par MALDI-temps de vol (TOF). Nous illustrons les avantages de l&#39;utilisation d&#39;un mélange de deux matrices (c&#39;est à dire de l&#39;acide 2,5-dihydroxybenzoïque et l&#39;acide α-cyano-4-hydroxycinnamique) et l&#39;utilité de la méthode de la couche mince en tant que méthode pour le dépôt de l&#39;échantillon. Nous discutons également le rôle essentiel de la matrice et de la pureté de solvant, des normes utilisées pour l&#39;étalonnage, de l&#39;énergie du laser, et du temps d&#39;acquisition. Dans l&#39;ensemble, nous fournissons de l&#39;information nécessaire à un novice pour l&#39;analyse des protéines intactes de plus de 100 kDa par MALDI-MS.

Nous avons analysé une protéine intacte (région chromosomique entretien une protéine, CRM1, poids moléculaire: 123 386 Da) en utilisant deux matrices différentes, deux procédés de dépôt, et de la même intensité laser (figure 1). SA et d&#39;un mélange de CHCA_DHB ont été utilisés comme matrices. Le mélange a donné le spectre de masse de qualité supérieure en termes de rapport signal à bruit et de la sensibilité (figures 1A et B). En particulier, nous avons pu détecter 0,5 pmoles de protéine déposées sur la cible MALDI (Figure 1C). La même quantité de protéine était à peine détectable à l&#39;aide SA (Figure 1D). En outre, en utilisant le mélange de matrices, la méthode de choix pour le dépôt de la matrice est l&#39;approche &quot;en couche mince&quot; (figure 1A). En utilisant la méthode &quot;gouttelettes séchées&quot;, nous n&#39;avons détecté aucune protéine ayant une masse supérieure à 100 kDa (données non présentées). Utilisant le mélange CHCA_DHB (Figures 1A et 1C), plusieurs charges ion de la protein ont été observées, ce qui permet la détermination de la masse avec une précision plus élevée parce que la résolution des pics dans les instruments MALDI-TOF axial est inversement proportionnel à m / z 26. Nous avons également analysé monomère de bêta-galactosidase (116 300 Da) (Figure 2). Les spectres CHCA_DHB étaient mieux que les spectres SA en termes de sensibilité et de résolution. En outre, la présence d&#39;ions à charge multiple (M + 2, M 3 + et M + 4) nous a permis de confirmer la masse de la protéine avec une précision plus élevée (Figures 2A et 2C). En utilisant l&#39;approche de la couche mince, nous avons comparé les performances du mélange CHCA_DHB, SA et α-CHCA seule pour l&#39;analyse d&#39;une immunoglobuline, IgG (148 500 Da) (Figure 3). Quand on corréler les différentes données, signaux des protéines étaient plus élevées et avec une meilleure résolution dans les spectres de CHCA_DHB. En conclusion, l&#39;utilisation du mélange de CHCA_DHB et le procédé de dépôt en couche mince<html> démontré des améliorations significatives de la qualité de la grande spectres de masse de la protéine intacte acquis en utilisant un instrument MALDI TOF. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig1.jpg" /> Figure 1. Analyse MALDI-TOF de la région chromosomique intact entretien 1 protéine, (CRM1), poids moléculaire: 123 386 Da. A) 1 pmol de CRM1 a été analysée en utilisant la combinaison de DHB_CHCA comme matrice B) montant: 1. Pmol; matrice:. SA C) montant: 0,5 pmol; matrice:. DHB_CHCA D) montant: 0,5 pmol; matrice: SA. Le signal des pics, exprimée dans une échelle d&#39;unité d&#39;intensité arbitraire, est normalisé à la valeur maximale présente dans chaque spectre. pg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50635/50635fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Analyse MALDI-TOF de intact bêta-galactosidase (116 300 Da). A) montant: 20 pmol; matrice DHB_CHCA B) montant:. 20 pmol; matrice:. SA C) montant: 5 pmoles; matrice:. DHB_CHCA D) montant: 5 pmoles; matrice: SA. <img alt="Figure 3" fo:content-width="3.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50635/50635fig3.jpg" /> Figure 3. Analyse MALDI-TOF d&#39;une immunoglobuline intacte, IgG (148 500 Da); montant:. 1,7 pmoles Les spectres obtenus en utilisant le mélange de CHCA_DHB étaient beaucoup plus intense (maximum: 8200 unité arbitraire, au) que les spectres SA (maximum: 1200 au) et les spectres α-CHCA (maximum: 4500 au)

Watch this Scientific Journal Video about Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa at JoVE.com

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Mesure précise de la masse représente une étape importante lors de l&#39;enquête de protéines. Laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI) la spectrométrie de masse (MS) peut être utilisée pour cette détermination et son principal avantage est la tolérance aux sels, des détergents et des contaminants. Ici, nous illustrons une approche accessible pour l&#39;analyse des protéines de plus de 100 kDa par MALDI-MS.

Soutenue par une matrice désorption / ionisation laser temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse Analyse des protéines intactes de plus de 100 kDa

Effectively determining masses of proteins is critical to many biological studies (e.g. for structural biology investigations). Accurate mass ...

matrix-assisted-laser-desorptionionization-time-flight-maldi-tof-mass

Research

JoVE Journal

Chemistry

Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

80.3K vues.  Université J. Fourier.  Mesure précise de la masse représente une étape importante lors de l'enquête de protéines. Laser assistée par matrice de désorption / ionisation (MALDI) la spectrométrie de masse (MS) peut être utilisée pour cette détermination et son principal avantage est la tolérance aux sels, des détergents et des contaminants. Ici, nous illustrons une approche accessible pour l'analyse des protéines de plus de 100 kDa par MALDI-MS. 

Vidéo: Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometric Analysis of Intact Proteins Larger than 100 kDa

Profiling the Triacylglyceride Contents in Bat Integumentary Lipids by Preparative Thin Layer Chromatography and MALDI-TOF Mass Spectrometry

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune system that is protective against pathogenic microbes. Abnormal sebum production and chemical composition are also a clinical symptom of specific skin diseases. Sebum contains a complex mixture of lipids, including triacylglycerides, which is species-specific. The broad chemical properties exhibited by diverse lipid classes hinder the specific determination of sebum composition. Analytical techniques for lipids typically require chemical derivatizations that are labor-intensive and increase sample preparation costs. This paper describes how to extract lipids from mammalian integument, separate broad lipid classes by thin-layer chromatography, and profile the triacylglyceride contents using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry. This robust method enables a direct determination of the triacylglyceride profiles among species and individuals, and it can be readily applied to any taxonomic group of mammals.

Mammalian integument contains solvent-extractable lipids that can provide chemical compositions characteristic of individual species. This paper presents a routine method for separating broad lipid classes isolated from integumentary tissues using thin layer chromatography and determining the triacylglyceride profile by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.

Profilage des matières triacylglycéride à Bat tégumentaire lipides par chromatographie sur couche mince préparative et MALDI-TOF spectrométrie de masse

The mammalian integument includes sebaceous glands that secrete an oily material onto the skin surface. Sebum production is part of the innate immune ...

Recherche

Chimie

Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Spectrométrie de masse approches pour étudier la structure des protéines et interactions dans lyophilisées Poudres

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

Rapid High-throughput Species Identification of Botanical Material Using Direct Analysis in Real Time High Resolution Mass Spectrometry

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, and that these chemical fingerprints can be used for plant species identification. The mass spectral data can be acquired rapidly and in a high throughput manner without the need for sample extraction, derivatization or pH adjustment steps. The use of this technique bypasses challenges presented by more conventional techniques including lengthy chromatography analysis times and resource intensive methods. The high throughput capabilities of the direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry protocol, coupled with multivariate statistical analysis processing of the data, provide not only class characterization of plants, but also yield species and varietal information. Here, the technique is demonstrated with two psychoactive plant products, Mitragyna speciosa (Kratom) and Datura (Jimsonweed), which were subjected to direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry followed by statistical analysis processing of the mass spectral data. The application of these tools in tandem enabled the plant materials to be rapidly identified at the level of variety and species.

A method for species identification of botanical material by direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry and multivariate statistical analysis is presented.

Rapid à haut débit Identification des espèces de matériel botanique Utilisation de l&#39;analyse directe en temps réel Résolution Spectrométrie de Masse Haute

We demonstrate that direct analysis in real time-high resolution mass spectrometry can be used to produce mass spectral profiles of botanical material, ...

Real-time Breath Analysis by Using Secondary Nanoelectrospray Ionization Coupled to High Resolution Mass Spectrometry

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental exposure in a non-invasive manner. In this work, we present a protocol to characterize the exhaled VOCs in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry (Sec-nanoESI-HRMS). The homemade Sec-nanoESI source was readily set up based on a commercial nanoESI source. Hundreds of peaks were observed in the background-subtracted mass spectra of exhaled breath, and the mass accuracy values are -4.0-13.5 ppm and -20.3-1.3 ppm in the positive and negative ion detection modes, respectively. The peaks were assigned with accurate elemental composition according to the accurate mass and isotopic pattern. Less than 30 s is used for one exhalation measurement, and it takes approximately 7 min for six replicated measurements.

A protocol for characterizing chemical composition of exhaled breath in real time by using secondary nanoelectrospray ionization coupled to high resolution mass spectrometry is demonstrated.

Analyse de l’haleine en temps réel en utilisant l’ionisation secondaire SPECTROMETRIE couplée à la spectrométrie de masse haute résolution

Exhaled volatile organic compounds (VOCs) have aroused considerable interest, since they can serve as biomarkers for disease diagnosis and environmental ...

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight (MALDI-TOF) Mass Spectrometry

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group analysis as matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS). This tutorial demonstrates methods for optimization of the sample preparation, spectral acquisition, and data analysis of synthetic polymers using MALDI-TOF MS. Critical parameters during sample preparation include the selection of the matrix, identification of an appropriate cationization salt, and tuning the relative proportions of the matrix, cation, and analyte. The acquisition parameters, such as mode (linear or reflector), polarization (positive or negative), acceleration voltage, and delay time, are also important. Given some knowledge of the chemistry involved to synthesize the polymer and optimizing both the data acquisition parameters and the sample preparation conditions, spectra should be obtained with sufficient resolution and mass accuracy to enable the unambiguous determination of the end groups of most homopolymers (masses below 10,000) in addition to the repeat unit mass and the overall molecular weight distribution. Though demonstrated on a limited set of polymers, these general techniques are applicable to a much wider range of synthetic polymers for determining mass distributions, though end group determination is only possible for homopolymers with narrow dispersity.

Characterization of Synthetic Polymers via Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight MALDI-TOF Mass Spectrometry

A protocol for the matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) characterization of synthetic polymers is described including the optimization of sample preparation, spectral acquisition, and data analysis.

Caractérisation des polymères synthétiques via Matrix Assisted Laser Desorption ionisation temps de spectrométrie de masse (MALDI-TOF) de vol

There are many techniques that can be employed in the characterization of synthetic homopolymers, but few provide as useful of information for end group ...

An Efficient Sample Preparation Method to Enhance Carbohydrate Ion Signals in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) MS is the method of choice in carbohydrate analysis, poor ion signal and data reproducibility of carbohydrate samples continue to be severe problems. For quantitative analysis of carbohydrates, an effective analytical protocol providing superior data quality is necessary. This video demonstrates sample preparation protocols to improve signal intensity and minimize data variation of carbohydrates in MALDI-MS. After drying and crystallization of sample droplets, the crystal morphology is reformed by methanol before mass spectrometric analysis. The enhancement in carbohydrate signal is examined with MALDI imaging mass spectrometry (IMS). Experimental results show that crystal reformation adjusts crystalline structures and redistributes carbohydrate analytes. In comparison with the dried droplet preparation method in conventional MALDI-MS, reforming carbohydrate crystal morphologies with methanol shows significantly better signal intensity, ion image distribution, and data stability. Since the protocols demonstrated herein do not involve changes in sample composition, they are generally applicable to various carbohydrates and matrixes.

A protocol for enhancing carbohydrate ion signals in MALDI mass spectrometry by reforming crystalline structures during sample preparation processes is demonstrated.

Un procédé de préparation d’échantillon efficace pour améliorer les signaux de Ion de glucides en spectrométrie de masse de désorption-ionisation Laser assistée par matrice

Sample preparation is a critical process in mass spectrometry (MS) analysis of carbohydrates. Although matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI) ...

Imaging Corrosion at the Metal-Paint Interface Using Time-of-Flight Secondary Ion Mass Spectrometry

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass spectrometry (ToF-SIMS), illustrating that SIMS is a suitable technique to study the chemical distribution at a metal-paint interface. The painted Al alloy coupons are immersed in a salt solution or exposed to air only. SIMS provides chemical mapping and 2D molecular imaging of the interface, allowing direct visualization of the morphology of the corrosion products formed at the metal-paint interface and mapping of the chemical after corrosion occurs. The experimental procedure of this method is presented to provide technical details to facilitate similar research and highlight pitfalls that may be encountered during such experiments.

Time-of-flight secondary ion mass spectrometry is applied to demonstrate the chemical mapping and corrosion morphology at the metal-paint interface of an aluminum alloy after being exposed to a salt solution compared with a specimen exposed to air.

Corrosion par imagerie à l’interface métal-peinture utilisant la spectrométrie de masse ionique secondaire à temps de vol

Corrosion developed at the paint and aluminum (Al) metal-paint interface of an aluminum alloy is analyzed using time-of-flight secondary ion mass ...

Analysis of Complex Molecules and Their Reactions on Surfaces by Means of Cluster-Induced Desorption/Ionization Mass Spectrometry

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass spectrometry (MS) of complex molecules and their reactions on surfaces. DINeC is based on a beam of SO2 clusters impacting on the sample surface at low cluster energy. During cluster-surface impact, some of the surface molecules are desorbed and ionized via dissolvation in the impacting cluster; as a result of this dissolvation-mediated desorption mechanism, low cluster energy is sufficient and the desorption process is extremely soft. Both surface adsorbates and molecules of which the surface is composed of can be analyzed. Clear and fragmentation-free spectra from complex molecules such as peptides and proteins are obtained. DINeC does not require any special sample preparation, in particular no matrix has to be applied. The method yields quantitative information on the composition of the samples; molecules at a surface coverage as low as 0.1 % of a monolayer can be detected. Surface reactions such as H/D exchange or thermal decomposition can be observed in real-time and the kinetics of the reactions can be deduced. Using a pulsed nozzle for cluster beam generation, DINeC can be efficiently combined with ion trap mass spectrometry. The matrix-free and soft nature of the DINeC process in combination with the MSn capabilities of the ion trap allows for very detailed and unambiguous analysis of the chemical composition of complex organic samples and organic adsorbates on surfaces.

Neutral SO2 clusters of low kinetic energy (&#60; 0.8 eV/constituent) are used to desorb complex surface molecules such as peptides or lipids for further analysis by means of mass spectrometry using an ion trap mass spectrometer. No special sample preparation is required, and real-time observation of reactions is possible.

Analyse des molécules complexes et de leurs réactions sur les surfaces au moyen de la desorption induite par les grappes/spectrométrie de masse d’ionisation

Desorption/Ionization Induced by Neutral SO2 Clusters (DINeC) is employed as a very soft and efficient desorption/ionization technique for mass ...

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain using antibiotic induction, and identified by MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. The immunity protein of colicin E3 (Im3) and the immunity protein of bacteriocin (Im-Bac) were identified from prominent b- and/or y-type fragment ions generated by the polypeptide backbone cleavage (PBC) on the C-terminal side of aspartic acid, glutamic acid, and asparagine residues by the aspartic acid effect fragmentation mechanism. The software rapidly scans in silico protein sequences derived from the whole genome sequencing of the bacterial strain. The software also iteratively removes amino acid residues of a protein sequence in the event that the mature protein sequence is truncated. A single protein sequence possessed mass and fragment ions consistent with those detected for each immunity protein. The candidate sequence was then manually inspected to confirm that all detected fragment ions could be assigned. The N-terminal methionine of Im3 was post-translationally removed, whereas Im-Bac had the complete sequence. In addition, we found that only two or three non-complementary fragment ions formed by PBC are necessary to identify the correct protein sequence. Finally, a promoter (SOS box) was identified upstream of the antibacterial and immunity genes in a plasmid genome of the bacterial strain.

Identification of Antibacterial Immunity Proteins in Escherichia coli using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and Top-Down Proteomic Analysis

Here we present a protocol for the rapid identification of proteins produced by genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF tandem mass spectrometry and top-down proteomic analysis with software developed in-house. Metastable protein ions fragment because of the aspartic acid effect and this specificity is exploited for protein identification.

Identification des protéines d’immunité antibactérienne chez Escherichia coli à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS et d’une analyse protéomique descendante

This protocol identifies the immunity proteins of the bactericidal enzymes: colicin E3 and bacteriocin, produced by a pathogenic Escherichia coli strain ...

Capillary Electrophoresis-based Hydrogen/Deuterium Exchange for Conformational Characterization of Proteins with Top-down Mass Spectrometry

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of protein therapeutics and the determination of the conformational transition pathways critical for biological functions, ranging from molecular recognition to enzymatic catalysis. Hydrogen/deuterium exchange (HDX) reaction coupled with top-down mass spectrometric (MS) analysis provides a means to characterize protein higher-order structures and dynamics in a conformer-specific manner. The conformational resolving power of this technique is highly dependent on the efficiencies of separating protein states at the intact protein level and minimizing the residual non-deuterated protic content during the HDX reactions. 
Here we describe a capillary electrophoresis (CE)-based variant of the HDX MS approach that aims to improve the conformational resolution. In this approach, proteins undergo HDX reactions while migrating through a deuterated background electrolyte solution (BGE) during the capillary electrophoretic separation. Different protein states or proteoforms that coexist in solution can be efficiently separated based on their differing charge-to-size ratios. The difference in electrophoretic mobility between proteins and protic solvent molecules minimizes the residual non-deuterated solvent, resulting in a nearly complete deuterating environment during the HDX process. The flow-through microvial CE-MS interface allows efficient electrospray ionization of the eluted protein species following a rapid mixing with the quenching and denaturing modifier solution at the outlet of the sprayer. The online top-down MS analysis measures the global deuteration level of the eluted intact protein species, and subsequently, the deuteration of their gas-phase fragments. This paper demonstrates this approach in differential HDX for systems, including the natural protein variants coexisting in milk.

Presented here is a protocol for a capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange (HDX) approach coupled with top-down mass spectrometry. This approach characterizes the difference in higher-order structures between different protein species, including proteins in different states and different proteoforms, by conducting concurrent differential HDX and electrophoretic separation.

Échange hydrogène/deutérium basé sur l’électrophorèse capillaire pour la caractérisation conformationnelle des protéines avec spectrométrie de masse descendante

Resolving conformational heterogeneity of multiple protein states that coexist in solution remains one of the main obstacles in the characterization of ...

Soutenue par une matrice désorption / ionisation laser temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse Analyse des protéines intactes de plus de 100 kDa

PLAYLIST