Ce travail a été financé par l&#39;Université de Calgary, en vertu d&#39;une nouvelle subvention de chercheur au démarrage pour le Dr Ungrin.

REMARQUE: plaques de microtitration sont disponibles dans différents formats, selon les résultats souhaités. Spécifications ainsi que des directives approximatives pour les nombres minimum et maximum de cellules qui doivent être utilisés avec chaque format sont présentés dans le tableau 1. Les petites cupules s&#39;effilent en pointe, et donc il n&#39;y a pas de limite de taille inférieure, bien que la variabilité entre les sphéroïdes devient plus important dans les petites tailles. Production de routine de sphéroïdes d&#39;une moyenne d&#39;aussi peu que 20 cellules chacune est simple 8. La plus grande taille de micropuits n&#39;est pas entièrement conique, tente donc de former des sphéroïdes de petits nombres de cellules peut se traduire par de multiples petits sphéroïdes dans chaque micropuits. En raison de légères différences dans les propriétés de surface, la préparation de la solution de tensioactif (étape 1.2) n&#39;est pas une option en utilisant les plateaux AggreWell 400EX. Ce protocole est basé sur l&#39;utilisation de plaques AggreWell 400 - pour les autres formats inconvénientsult Tableau 1. Le nombre de cellules devant être chargés dans chaque puits est déterminée en multipliant le nombre de micropuits qu&#39;il contient par le nombre de cellules à cluster pour chaque sphéroïde. Par exemple, pour produire des sphéroïdes à partir de 1 000 cellules chacun, chaque puits doit être chargé avec des sphéroïdes (1200 fois 1000 cellules chacune) = 1,2 x 10 6 cellules. La densité cellulaire doit être calculée, étant donné que les cellules sont chargées dans un volume de 0,4 ml. Ainsi, pour l&#39;exemple de sphéroïdes formés à partir de 1.000 cellules chacun, 1,2 x 10 6 cellules dans 0,4 ml se traduit par une densité de 3 x 10 6 cellules par ml. Une. Micropuits se préparent à recevoir des cellules <ol><li> microplaques sont stériles comme prévu, et ne doivent être retirés de leur emballage dans un environnement stérile, comme une enceinte de biosécurité laminaire d&#39;écoulement. La stérilité doit être maintenue tout au long du protocole. La stérilité doit être compromise, les puits sont restérilisés en utilisant 70% d&#39;éthanol dans de l&#39;eau en utilisant l&#39;étapes facultatives suivantes. <ol><li> Ajouter 0,5 ml d&#39;éthanol à 70% à chaque puits utilisé. Certains micropuits volonté des bulles d&#39;air de piégeage, bien que cela puisse être réduite en ajoutant un liquide d&#39;un côté, et en lui permettant de se répandre à travers la surface, plutôt que de la laisser tomber verticalement sur la surface. Replacer le couvercle. </li><li> Bien que la vapeur d&#39;éthanol devrait rapidement imprégner les bulles, si il ya un grand nombre, il peut être souhaitable de les supprimer. Centrifuger 2 min à 2000 x g. On notera qu&#39;il est important de s&#39;assurer que le rotor est correctement équilibré à cette vitesse. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un faible grossissement au microscope inversé, vérifier bulles ont été retirés de la cupule. </li><li> Incuber pendant 5 min avec le couvercle à la température ambiante. </li><li> Aspirer l&#39;éthanol. Plaque peut maintenant être lavé avec de l&#39;eau stérile ou PBS pour une utilisation immédiate, ou séché à l&#39;air pour le stockage. </li></ol></li><li> Afin d&#39;assurer que les cellules n&#39;interagissent pas avec la surface de micropuits, il peut être préparé en utilisant un agent tensio-actif. En général, il estconseillé d&#39;effectuer cette étape un premier temps, et ensuite comparer sphéroïdes générés avec et sans tensioactifs micropuits revêtus. <ol><li> Ajouter 0,5 ml de solution de rinçage à chaque puits. Certains micropuits volonté des bulles d&#39;air de piégeage, bien que cela puisse être réduite en ajoutant un liquide d&#39;un côté, et en lui permettant de se répandre à travers la surface, plutôt que de la laisser tomber verticalement sur la surface. Replacer le couvercle. </li><li> Centrifuger pendant 2 min à 2000 xg pour éliminer les bulles. On notera qu&#39;il est important de s&#39;assurer que le rotor est correctement équilibré à cette vitesse. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un faible grossissement au microscope inversé, vérifier bulles ont été retirés de la cupule. </li><li> Incuber pendant au moins 30 minutes avec le couvercle à la température ambiante, ou pendant une nuit à 4 ° C. Les plaques peuvent être conservées à quatre degrés avec la solution de tensioactif dans le puits jusqu&#39;à ce que nécessaire si elle est correctement fermé pour éviter le dessèchement. </li><li> Laver les plaques avec du PBS ou de l&#39;eau stérile immédiatement avant utilisation. Ne pas laisser les plaquesà sécher après le revêtement. </li></ol></li></ol> 2. Préparation de cellules NOTE: Les détails de la préparation de cellules peuvent varier quelque peu avec le type de cellule spécifique à l&#39;étude. Cependant, nous avons observé ces conditions pour être efficace avec une large gamme de cellules, y compris les lignes discutées ici, ainsi que des cellules souches embryonnaires humaines et murines (ESC), les cellules souches pluripotentes humaines induites (iPSC), des fibroblastes, endoderme primitif putatif, et les cellules stromales. D&#39;autres groupes ont utilisé ce système avec succès pour une large gamme d&#39;applications, y compris la chondrogenèse de cellules souches mésenchymateuses 9, la production standardisée des précurseurs neuraux à partir de cellules souches pluripotentes 10, analyses toxicologiques dans les hépatocytes 11 et l&#39;évaluation de régénération de la moelle épinière à la salamandre 12. Le protocole spécifique pour travailler avec les cellules HT29 est montré ici. <ol><li> Commencer avec un flacon T75 de cellules HT29, cultivées dans du DMEM+ 10% de FBS </li><li> milieu de croissance de Aspirer à partir de flacon, et ajouter 3 ml de trypsine. </li><li> Incuber les cellules pendant 5 min à 37 ° C. </li><li> Arrêter la digestion de la trypsine en ajoutant 3 ml de milieu de croissance. Prélever une partie aliquote pour le comptage des cellules et transférer le reste dans un tube de centrifugeuse de 15 ml. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 200 x g. </li><li> Alors que la centrifugation est en cours, compter les cellules. </li><li> Aspirer la trypsine / mélange de milieu et de le remplacer par du milieu de croissance frais, du volume déterminé par la densité de cellules telle que calculée ci-dessus. </li><li> (OPTION) Passez la suspension de cellules à travers une passoire pour éliminer toutes les grumeaux. NOTE: Les conditions de récolte cellulaire varient quelque peu entre les lignes. Si un protocole de dissociation, par exemple pour repiquer les cellules d&#39;intérêt sont disponibles, qui doit être utilisé en tant que point de départ. Avec les lignées cellulaires sensibles à l&#39;utilisation de la trypsine peut entraîner une mort cellulaire excessive. Dans ces cas, nous avons observé de bons résultats en utilisant TrypLE comme une solution de rechange dissociatile réactif 8. Si les cellules deviennent agglomérée au cours de la dissociation et perdent leur viabilité, l&#39;addition de DNase à la solution d&#39;enzyme peut résoudre ce problème. La réduction des temps de dissociation et utilisant une étape de trituration de briser les mottes de cellules peut également accroître la viabilité. </li></ol> 3. Formation sphéroïde REMARQUE: Les sphéroïdes peuvent être produits dans une variété de formulations de milieu, les essais cependant initiales doivent être effectuées en utilisant le milieu dans lequel les cellules sont mises en culture, de distinguer les conséquences de la transition vers un système de culture en 3 dimensions à partir des conséquences de l&#39;évolution composition de milieu. <ol><li> Ajouter 0,4 ml de milieu de culture dans chaque puits. </li><li> Centrifuger pendant 2 min à 2000 xg pour éliminer les bulles. On notera qu&#39;il est important de s&#39;assurer que le rotor est correctement équilibré à cette vitesse avant la centrifugation. </li><li> L&#39;utilisation d&#39;un faible grossissement au microscope inversé, vérifier bulles ont été retirés de la cupule. </li><li> Ajouter 0,4 mlsuspension de cellules à la densité requise (calculée ci-dessus). Mélanger doucement par pipetage de haut en bas, sans introduire de bulles d&#39;air dans les puits. Il est important de veiller à ce que les cellules sont réparties uniformément dans le puits, afin d&#39;obtenir des sphéroïdes conformes. </li><li> Centrifuger pendant 5 minutes à 200 x g. Si la plaque n&#39;est pas auto-niveau pendant la centrifugation, les courants de convection qui peuvent survenir suite à la distribution inégale des cellules dans les puits. Par conséquent, la plaque doit être équilibrée en interne, ainsi que contre l&#39;autre plaque, de sorte que le poids est réparti uniformément sur les deux faces du support de plaque. </li></ol> NOTE: Si la preuve de la distribution inégale des cellules est vu, il peut être nécessaire d&#39;appliquer une petite quantité de lubrifiant pour les points de pivot sur le support de plaque - consulter le fabricant de centrifugeuse pour obtenir des instructions. NOTE: Une fois que les cellules ont été centrifugés dans les puits, ils sont raisonnablement résistanceTant de lavage de mouvements mineurs de la plaque. Mouvements brusques qui se traduisent par le ballottement du milieu doivent être évités, mais le transfert de la plaque de la centrifugeuse de microscope ou incubateur ne devraient pas entraîner le déplacement cellulaire significative. <ol start="6"><li> En utilisant un microscope inversé, de vérifier que les cellules sont groupées dans les micropuits, et qu&#39;elles sont réparties de façon uniforme à travers le puits. </li><li> Incuber pendant une nuit à 37 ° C. </li><li> En utilisant un microscope inversé, d&#39;observer le processus de formation sphéroïde. Certaines lignées de cellules formeront sphéroïdes compacts dans les 24 heures, d&#39;autres peuvent prendre plus de temps. La progression de la grappe à s&#39;agréger dans des cellules HT29 est représenté sur la figure 2. </li><li> Récupérer à partir de sphéroïdes les micropuits et les transférer à une culture en suspension en les projeter doucement avec une pipette. Sinon, maintenir sphéroïdes in situ avec remplacement du milieu 8 - la durée dépend de leur taille initiale et le taux de croissance, qui define le temps jusqu&#39;à ce qu&#39;ils grandissent les puits dans lesquels ils ont été formés. <ol><li> Pour remplacer le milieu sans perdre sphéroïdes, moyen d&#39;aspiration au niveau du bord du puits à l&#39;aide d&#39;une pipette de Pasteur. Ramenez lentement la pointe vers le bas jusqu&#39;à ce qu&#39;il commence à aspirer le liquide du ménisque, et suivre le ménisque glisser vers le bas. Puis ajouter du milieu frais contre la paroi du puits à la même place. Quelques sphéroïdes peuvent être perdus, mais si le milieu est toujours aspiré et remplacé dans la même position, ce nombre restera faible en comparaison avec les grands nombres dans le puits. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+An+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> Journal of Biotechnology. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Sherar, M. D., Noss, M. B., Foster, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound+backscatter+microscopy+images+the+internal+structure+of+living+tumour+spheroids.">Ultrasound backscatter microscopy images the internal structure of living tumour spheroids.</a> Nature. 330 (6147), 493-495 (1987).</li><li>Foty, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Simple+Hanging+Drop+Cell+Culture+Protocol+for+Generation+of+3D+Spheroids.">A Simple Hanging Drop Cell Culture Protocol for Generation of 3D Spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), 2720 (2011).</li><li>Naber, H. P. H., Wiercinska, E., Ten Dijke, P., Van Laar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spheroid+Assay+to+Measure+TGF-&#946;-induced+Invasion.">Spheroid Assay to Measure TGF-&#946;-induced Invasion.</a> J. Vis. Exp. (57), e3337 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Reproducible Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ultra+high-throughput+formation+of+multicellular+organization+from+single+cell+suspension-derived+human+embryonic+stem+cell+aggregates.">ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates.</a> PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).</li><li>Bauwens, C. L., Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Geometric+control+of+cardiomyogenic+induction+in+human+pluripotent+stem+cells.">Geometric control of cardiomyogenic induction in human pluripotent stem cells.</a> Tissue Engineering. Part A. 17 (15-16), 1901-1909 (2011).</li><li>Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., Ungrin, M. D., Zandstra, P. W., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incorporation+of+biomaterials+in+multicellular+aggregates+modulates+pluripotent+stem+cell+differentiation.">Incorporation of biomaterials in multicellular aggregates modulates pluripotent stem cell differentiation.</a> Biomaterials. 32 (1), 48-56 (2011).</li><li>Ungrin, M. D., Clarke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+bioprocess+design+for+human+pluripotent+stem+cell+expansion+and+endoderm+differentiation+based+on+cellular+dynamics.">Rational bioprocess design for human pluripotent stem cell expansion and endoderm differentiation based on cellular dynamics.</a> Biotechnology and Bioengineering. 109 (4), 853-866 (2012).</li><li>Markway, B. D., Tan, G. K., Brooke, G., Hudson, J. E., Cooper-White, J. J., Doran, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+in+low+oxygen+environment+micropellet+cultures.">Enhanced chondrogenic differentiation of human bone marrow-derived mesenchymal stem cells in low oxygen environment micropellet cultures.</a> Cell Transplantation. 19 (1), 29-42 (2010).</li><li>Kozhich, O., Hamilton, R., Mallon, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardized+Generation+and+Differentiation+of+Neural+Precursor+Cells+from+Human+Pluripotent+Stem+Cells.">Standardized Generation and Differentiation of Neural Precursor Cells from Human Pluripotent Stem Cells.</a> Stem Cell Reviews and Reports. , 1-6 (2012).</li><li>Fey, S. J., Wrzesinski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+Drug+Toxicity+Using+3D+Spheroids+Constructed+from+an+Immortal+Human+Hepatocyte+Cell+Line.">Determination of Drug Toxicity Using 3D Spheroids Constructed from an Immortal Human Hepatocyte Cell Line.</a> Toxicological Sciences. , (2012).</li><li>Mchedlishvili, L., Mazurov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+the+central+and+peripheral+nervous+system+during+salamander+tail+regeneration.">Reconstitution of the central and peripheral nervous system during salamander tail regeneration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. , (2012).</li><li>Butler, C. M., Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+Aggregate+Cohesion+by+Tissue+Surface+Tensiometry.">Measurement of Aggregate Cohesion by Tissue Surface Tensiometry.</a> J. Vis. Exp. (50), e2739 (2011).</li><li>Xu, K., Buchsbaum, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Mammary+Epithelial+Cells+from+Three-dimensional+Mixed-cell+Spheroid+Co-culture.">Isolation of Mammary Epithelial Cells from Three-dimensional Mixed-cell Spheroid Co-culture.</a> J. Vis. Exp. (62), e3760 (2012).</li><li>Baraniak, P. R., Cooke, M. T., Saeed, R., Kinney, M. A., Fridley, K. M., McDevitt, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stiffening+of+human+mesenchymal+stem+cell+spheroid+microenvironments+induced+by+incorporation+of+gelatin+microparticles.">Stiffening of human mesenchymal stem cell spheroid microenvironments induced by incorporation of gelatin microparticles.</a> Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 11, 63-71 (2012).</li><li>Purpura, K. A., Bratt-Leal, A. M., Hammersmith, K. A., McDevitt, T. C., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+engineering+of+3D+pluripotent+stem+cell+niches+to+guide+blood+development.">Systematic engineering of 3D pluripotent stem cell niches to guide blood development.</a> Biomaterials. , (2012).</li></ol>

Dr Ungrin a un intérêt financier dans la technologie AggreWell comme un inventeur.

Nous avons mis en place un système dans lequel un grand nombre de sphéroïdes uniformes peuvent être générés à partir de plusieurs lignées cellulaires provenant de sources différentes. Nous n&#39;avons pas encore de rencontrer une ligne de cellules adhérentes qui ne fait pas sphéroïdes dans ces conditions. Nous avons déjà observé une perte de cellules dans des populations exposées à anoïkis 5,8, mais à ce jour cette question ne s&#39;est pas posée de lignées tumorales. Le système est évolutif arbitrairement avec la surface, avec un comportement cohérent entre micropuits dans 24 puits et le format de 6 puits, ainsi que des bioréacteurs prototypes contenant 50.000 micropuits chaque actuellement en cours de développement. Si sphéroïde asymétrie être une préoccupation, le temps d&#39;incubation dans l&#39;étape 4.8 peut être augmentée à deux ou trois jours. Sphéroïdes peuvent également être mises en incubation pendant une période après l&#39;extraction à partir des micropuits pour augmenter la symétrie, mais dans ce cas il faut veiller à maintenir la densité de culture suffisamment basse, comme des sphéroïdes en contact avec une autre will fusionner souvent dans des structures plus grandes. Pour cette raison, nous avons déjà entretenu cultures dans les puits dans lequel les agrégats ont été formés, avec la limitation principale étant la taille de l&#39;ellipsoïde. Cela est une fonction à la fois le taux de croissance et la taille initiale 8, et si la culture étendue dans le microplaque est prévu, cela devrait être considéré à l&#39;avance. Options pour prévenir la prolifération, il devrait se produire, notamment, soit à partir de petits sphéroïdes, ou en employant les grands micropuits de la plaque AggreWell 800. Si sphéroïdes ne pas augmenter en cohérence au fil du temps, une cause possible peut être la mort de la cellule. Notamment dans les grandes agrégats de cellules métaboliquement très actives, les limitations de transport de masse sur l&#39;apport d&#39;oxygène et de nutriments essentiels peut entraîner un noyau nécrotique 2 - ainsi un sphéroïde non cohésif peut être simplement une conséquence de la mort cellulaire excessive. Sinon, les mesures de la cohésion mécaniquesion de sphéroïdes ont été utilisés pour évaluer les forces de liaison intercellulaires, en relation avec le potentiel métastatique d&#39;une lignée cellulaire donnée 13. Il serait intéressant d&#39;étudier la relation entre la forme sphéroïde et le potentiel métastatique, peut-être en utilisant des paramètres morphométriques comme la rondeur et le périmètre de rapport de surface. En plus d&#39;enquêter sur les propriétés mécaniques et morphométriques de sphéroïdes, montage dans le système de micro-puits permet la production à grande échelle de sphéroïdes mixtes composition, consistant en des combinaisons de types et / ou de biomatériaux 6,7 cellulaires multiples. Les interactions des cellules tumorales avec d&#39;autres types de cellules sont importantes pour modéliser plus étroitement le comportement des tumeurs in vivo 14, donc il peut être intéressant de générer des sphéroïdes à partir de cellules tumorales en combinaison avec des fibroblastes et des cellules endotheliales, par exemple. Microparticules de divers biomatériaux peuvent également être incorporés, et peuvent affecter SPHeroid propriétés à la fois directement par le biais de leurs interactions avec les cellules, 7,15 et également en tant que réservoirs pour la libération contrôlée de facteurs de croissance et des cytokines dans l&#39;intérieur de l&#39;ellipsoïde 16. Si il n&#39;y a aucun souci sur la stérilité, par exemple lorsque vous travaillez avec une microplaque dans laquelle certains puits ont déjà été utilisés, qui peuvent avoir passé un certain temps dans un incubateur dans le cadre d&#39;une expérience précédente, les puits peuvent être restérilisés avec 70% d&#39;éthanol dans de l&#39;eau. Une fois que les sphéroïdes ont été formées, elles peuvent aussi être séparées des cellules non constituées résiduelles en faisant passer la suspension sur un tamis cellulaire. Les cellules individuelles vont passer à travers, tandis que les sphéroïdes seront conservés. Si le sphéroïde est soupçonné d&#39;excrétion des cellules potentiellement métastatiques au cours de la culture, il peut être souhaitable d&#39;effectuer cette procédure plusieurs fois - d&#39;abord pour éliminer les cellules individuelles, puis à isoler purified populations de cellules dégagés par les sphéroïdes.

Il ya un nombre croissant de preuves que les cellules tumorales se comportent différemment dans trois cultures dimensions que ce qu&#39;ils font lorsqu&#39;ils sont cultivés sur plastique, et que les agents thérapeutiques identifiés sur les plates-formes de culture de tissus classiques peuvent perdre l&#39;efficacité quand la transition vers un système plus physiologiquement pertinents 1. Il est donc souhaitable d&#39;étudier le comportement des cellules cancéreuses dans ces conditions, à la fois pour mieux comprendre leur biologie sous-jacente, et aussi d&#39;augmenter le taux de transition de nouveaux agents thérapeutiques dans le centre de dépistage à la clinique de succès. Un système de modèle utile avec une longue histoire emploie amas tridimensionnels de cellules de cancer connus comme des sphéroïdes de tumeur 1,2. Idéalement, les techniques de formation sphéroïde ne permettre la production d&#39;un grand nombre de sphéroïdes uniformes dont la taille et la composition sont contrôlés par l&#39;expérimentateur. Bien goutte suspendue et le bien-plaque approches 3,4 sont en mesure de répondre à certaines de ces reexigences, le débit est généralement limitée, et la génération d&#39;un grand nombre de sphéroïdes devient une tâche de main-d&#39;œuvre. Nous avons récemment mis au point un système pour résoudre des défis similaires dans le domaine de la médecine régénérative 5. Employant agrégation forcée à l&#39;intérieur d&#39;une série de denses puits échelle du micron (voir la figure 1), cette approche permet la génération de sphéroïdes de nombres arbitraires de cellules, y compris des mélanges de plusieurs types de cellules 6, ainsi que l&#39;incorporation de divers biomatériaux 7. Sphéroïdes sont formés en grand nombre - des milliers à des centaines de milliers ou plus - et peuvent être extraites immédiatement ou maintenues dans les puits dans lesquels ils ont été formés avec échange de milieu pendant au moins un 8 à deux (observation non publiée) semaines. Ce système est donc bien adapté à la génération d&#39;un grand nombre de sphéroïdes et uniforme tumorales reproductibles pour l&#39;évaluation de l&#39;effectiveness de nouveaux agents anti-tumoraux ou des enquêtes biologiques de base.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AggreWell 400 plate</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27845/27945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rinsing Solution</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>07010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (37 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa3d-bddd-2a36-2ae1901f1604" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">&#181;m)</td>
			<td>StemCell Technologies Inc.</td>
			<td>27215</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-Versene (EDTA)</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12001-660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA12002-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>VWR / LONZA</td>
			<td>CA-95042-112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Invitrogen / Life Technologies</td>
			<td>12605010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted microscope</td>
			<td>VWR / Motic</td>
			<td>CA19000-610</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Allegra X15R centrifuge with carriers for standard well plates</td>
			<td>VWR / Beckman</td>
			<td>CABKA99465, CABK369704, CABK392806</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar flow biosafety cabinet</td>
			<td>ESBE / Baker</td>
			<td>BKR-SG603AHEUVSP</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

production of large numbers of size-controlled tumor spheroids using microwell plates

sphéroïdes de tumeur sont de plus en plus reconnu comme un important modèle in vitro du comportement des cellules tumorales dans les trois dimensions. Plus physiologiquement pertinente de cultures adhérentes feuilles classiques, ils récapitulent plus précisément la complexité et les interactions présentes dans les tumeurs réels. Afin de tirer parti de ce modèle pour mieux évaluer la biologie des tumeurs, ou de l&#39;efficacité de nouveaux agents thérapeutiques, il est nécessaire d&#39;être capable de générer de manière reproductible des sphéroïdes, d&#39;une manière contrôlée et en grand nombre. Le système se compose d&#39;un AggreWell matrice à haute densité de micro-puits en forme de pyramide, dans laquelle une suspension de cellules uniques est centrifugée. Les nombres de cellules regrouper au fond de chaque puits, et le nombre et la proportion des types cellulaires distincts impliqués dépend seulement des propriétés de la suspension introduite par l&#39;expérimentateur. Ainsi, nous sommes capables de générer des sphéroïdes de tumeur de taille arbitraire et la composition avecà avoir à modifier la technologie de plate-forme sous-jacente. Les centaines de micropuits par centimètre carré de surface de culture à son tour veiller à ce que les niveaux de production très élevés peuvent être atteints via un processus simple, nonlabor-intensive. Nous attendons donc que ce protocole sera largement utile pour les chercheurs dans le domaine de sphéroïde tumeur.

Sphéroïdes à partir de lignées de tumeurs d&#39;origines différentes anatomiques peuvent facilement être générés et extraits dans une culture en suspension. Figure 3 illustre le contrôle de la taille uniforme pouvant être obtenu par ce procédé, avec des populations de sphéroïdes très uniformes dans chaque condition. Des différences claires entre les lignes de comportement sont également visibles, avec des cellules du côlon cancer du HT29 et les cellules de cancer de l&#39;œsophage TE6 formant sphéroïdes denses avec des frontières bien définies, tandis que les cellules cancéreuses LNCaP de la prostate ont donné lieu à des sphéroïdes moins cohérentes avec des limites irrégulières (voir discussion pour des raisons possibles ). Les forces internes fortes dans les agrégats plus cohérentes ont également entraîné l&#39;effondrement d&#39;une forme plus symétrique même tout en restant dans les puits dans lesquels ils ont été formés, alors que les agrégats de LNCaP, en particulier à la plus grande taille, conservent visiblement la géométrie carrée pyramidale de l&#39; micropuits. La relation entre le nombre de cellules d&#39;entrée et les phys<html> taille ical du sphéroïde résultant dépendra d&#39;un certain nombre de variables. Volumes théoriques basés sur le produit du volume par cellule et le nombre de cellules employées peuvent être réduits par la perte de cellules, ce qui à son tour peut comprendre une perte de cellules pendant l&#39;étape de suspension d&#39;une seule cellule, ainsi que la perte de trop petits agrégats du fait de nombre insuffisant de voisins, et de trop grands agrégats dues au transport limitations et nécrose dans le noyau. Taille sera également influencée par toute prolifération qui peuvent se produire pendant le processus d&#39;agrégation. Etant donné que ces paramètres peuvent varier d&#39;une lignée cellulaire de la lignée cellulaire, si sphéroïdes de dimensions physiques spécifiques sont souhaitées le nombre correct de cellules à introduire doit être déterminée expérimentalement. En première approximation, on s&#39;attend diamètre sphéroïde à augmenter avec la racine cubique du nombre de cellules intégrées - par exemple une augmentation de 8 fois du nombre de cellules devrait aboutir à un doublement de diamètre sphéroïde. <html> _content &quot;fo: keep-together.within page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma de production sphéroïde. Système de micropuits se compose d&#39;un réseau de micropuits serrées de carré pyramidal (625 par cm 2 pour les 400 <span id="docs-internal-guid-263ae0a0-aa35-f9c7-69a1-8c5aa197db53" style="font-size:15px;font-family:Arial;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;">μ m taille), dans laquelle les cellules peuvent être centrifugées. Les cellules sont réunis par des parois latérales en pente, et la taille de la sphéroïde résultant est contrôlée en faisant varier la densité de la suspension cellulaire utilisée. 50665fig2highres.jpg &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/50665/50665fig2.jpg &quot;/&gt; Figure 2. Ensemble de cellules regroupées en sphéroïdes. Sphéroïdes ont été formés à partir de sept cents HT29 cellules chacune. Immédiatement après centrifugation (A), les cellules sont regroupées de façon lâche dans le fond de chaque puits. Notez que les grappes sont uniformément décalés vers le bas à droite dans ce cas. Ceci est acceptable à condition tailles de cluster restent cohérents à travers le réseau. Si les différences de taille de cluster significatif sont vus d&#39;un côté du tableau à l&#39;autre, voir la note à l&#39;étape 3.5. Après une incubation de 24 heures (B), les forces d&#39;adhésion intercellulaires ont causé les grappes de regrouper et former des sphéroïdes cohérentes, qui peuvent ensuite être extraites (C). <img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50665/50665fig3.jpg" /><b<html> r /&gt; Figure 3. Sphéroïdes générés dans des plaques de microtitration. Sphéroïdes ont été formés à partir de sept cents (A, C, E) ou un mille cinq cent (B, D, F) des cellules du côlon d&#39;un cancer du HT29 (A, B), des cellules de cancer de la prostate LNCaP (C, D) ou des cellules de cancer de l&#39;œsophage TE6 (E, F). Notez la cohérence des sphéroïdes à l&#39;intérieur d&#39;une préparation, ainsi que la variation entre les lignées cellulaires - en particulier les granulats LNCaP lâches par rapport à la HT29 plus dense et TE6 cellules. La barre d&#39;échelle représente 200 um. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="3"> Le format micropuits </td></tr><tr><td></td><td> AggreWell 400 </td><td> AggreWell 40EX </td><td> AggreWell 800 </td></tr><tr><td> largeur de Microwell (al;color:#000000;background-color:#ffffff;font-weight:normal;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;&quot;&gt;µm ) </td><td> 400 </td><td> 400 </td><td> 800 </td></tr><tr><td> Micropuits par cm 2 </td><td> 625 </td><td> 625 </td><td> 156.25 </td></tr><tr><td> Micropuits par puits </td><td> 1200 </td><td> 4700 </td><td> 300 </td></tr><tr><td> Cellules minimum par micropuits * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 2000 </td></tr><tr><td> Cellules maximum par micropuits * </td><td> 2000 </td><td> 2000 </td><td> 10000 </td></tr><tr><td> Cellules minimum par puits * </td><td> N / A </td><td> N / A </td><td> 6 x 10 5 </td></tr><tr><td> Cellules maximum par puits * </td><td> 2.4 x 10 6 </td><td> 9,4 x 10 6 </td><td> 3 x 10 6 </td></tr><tr><td> 1.1.1 - le volume d&#39;éthanol à 70% (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> 1.2.1 - Rinçage volume de solution (ml) </td><td> 0,5 </td><td> 2.0 </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> 3.2 - volume de précharge moyen (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> 3.5 - le volume cellulaire de chargement (ml) </td><td> 0,4 </td><td> 1.6 </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td colspan="4"> * Le nombre de cellules par micropuits ne sont qu&#39;une approximation que cette valeur varie en fonction de la taille des cellules spécifiques employées, et doit être déterminée empiriquement </td></tr></tbody></table> Tableau 1. AggreWell options et modifications de protocole.

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Production of Large Numbers of Size-controlled Tumor Spheroids Using Microwell Plates

Nous introduisons un protocole pour la génération d&#39;un grand nombre (des milliers à des centaines de milliers) de taille et d&#39;sphéroïdes uniformes de composition contrôlée tumorales, en utilisant commerce microplaques.

La production de grands nombres de tumeurs Sphéroïdes Taille contrôlée à l&#39;aide de micro puits Plaques

Tumor spheroids are increasingly recognized as an important in vitro model for the behavior of tumor cells in three dimensions. More physiologically ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

17.3K vues.  University of Calgary.  Nous introduisons un protocole pour la génération d'un grand nombre (des milliers à des centaines de milliers) de taille et d'sphéroïdes uniformes de composition contrôlée tumorales, en utilisant commerce microplaques. 

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Nonhuman Primate Lung Decellularization and Recellularization Using a Specialized Large-organ Bioreactor

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an attractive alternative to classic organ transplantation. This technology utilizes an organ&#39;s natural biological extracellular matrix (ECM) as a scaffold onto which autologous or stem/progenitor cells may be seeded and cultured in such a way that facilitates regeneration of the original tissue. The natural ECM is isolated by a process called decellularization. Decellularization is accomplished by treating tissues with a series of detergents, salts, and enzymes to achieve effective removal of cellular material while leaving the ECM intact. Studies conducted utilizing decellularization and subsequent recellularization of rodent lungs demonstrated marginal success in generating pulmonary-like tissue which is capable of gas exchange in vivo. While offering essential proof-of-concept, rodent models are not directly translatable to human use. Nonhuman primates (NHP) offer a more suitable model in which to investigate the use of bioartificial organ production for eventual clinical use.
The protocols for achieving complete decellularization of lungs acquired from the NHP rhesus macaque are presented. The resulting acellular lungs can be seeded with a variety of cells including mesenchymal stem cells and endothelial cells. The manuscript also describes the development of a bioreactor system in which cell-seeded macaque lungs can be cultured under conditions of mechanical stretch and strain provided by negative pressure ventilation as well as pulsatile perfusion through the vasculature; these forces are known to direct differentiation along pulmonary and endothelial lineages, respectively. Representative results of decellularization and cell seeding are provided.

Whole-organ decellularization produces natural biological scaffolds that may be used for regenerative medicine. The description of a nonhuman primate model of lung regeneration in which whole lungs are decellularized and then seeded with adult stem cells and endothelial cells in a bioreactor that facilitates vascular circulation and liquid media ventilation is presented.

There are an insufficient number of lungs available to meet current and future organ transplantation needs. Bioartificial tissue regeneration is an ...

Recherche

Bio-ingénierie

Nutrient Regulation by Continuous Feeding for Large-scale Expansion of Mammalian Cells in Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.

Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.

Règlement des éléments nutritifs par l&#39;alimentation continue pour l&#39;expansion à grande échelle de cellules de mammifères en Spheroids

In this demonstration, spheroids formed from the &#946;-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product ...

Robotic Production of Cancer Cell Spheroids with an Aqueous Two-phase System for Drug Testing

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing both mono-culture and co-culture spheroids in a high throughput 96-well plate format is described in this work. This approach utilizes an aqueous two-phase system to confine cells into a drop of the denser aqueous phase immersed within the second aqueous phase. The drop rests on the well surface and keeps cells in close proximity to form a single spheroid. This technology has been adapted to a robotic liquid handler to produce size-controlled spheroids and expedite the process of spheroid production for compound screening applications. Spheroids treated with a clinically-used drug show reduced cell viability with increase in the drug dose. The use of a standard micro-well plate for spheroid generation makes it straightforward to analyze viability of cancer cells of drug-treated spheroids with a micro-plate reader. This technology is straightforward to implement both robotically and with other liquid handling tools such as manual pipettes.

A protocol for robotic printing of cancer cell spheroids in a high throughput 96-well plate format using an aqueous two-phase system is presented.

Production robotique de Cancer Cell Sphéroïdes avec un système aqueux à deux phases pour le dépistage des drogues

Cancer cell spheroids present a relevant in vitro model of avascular tumors for anti-cancer drug testing applications. A detailed protocol for producing ...

Cloning and Large-Scale Production of High-Capacity Adenoviral Vectors Based on the Human Adenovirus Type 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high packaging capacity (up to 35 kb), low immunogenicity, and low toxicity. However, for many laboratories the use of HCAdV is hampered by the complicated procedure for vector genome construction and virus production. Here, a detailed protocol for efficient cloning and production of HCAdV based on the plasmid pAdFTC containing the HCAdV genome is described. The construction of HCAdV genomes is based on a cloning vector system utilizing homing endonucleases (I-CeuI and PI-SceI). Any gene of interest of up to 14 kb can be subcloned into the shuttle vector pHM5, which contains a multiple cloning site flanked by I-CeuI and PI-SceI. After I-CeuI and PI-SceI-mediated release of the transgene from the shuttle vector the transgene can be inserted into the HCAdV cloning vector pAdFTC. Because of the large size of the pAdFTC plasmid and the long recognition sites of the used enzymes associated with strong DNA binding, careful handling of the cloning fragments is needed. For virus production, the HCAdV genome is released by NotI digest and transfected into a HEK293 based producer cell line stably expressing Cre recombinase. To provide all adenoviral genes for adenovirus amplification, co-infection with a helper virus containing a packing signal flanked by loxP sites is required. Pre-amplification of the vector is performed in producer cells grown on surfaces and large-scale amplification of the vector is conducted in spinner flasks with producer cells grown in suspension. For virus purification, two ultracentrifugation steps based on cesium chloride gradients are performed followed by dialysis. Here tips, tricks, and shortcuts developed over the past years working with this HCAdV vector system are presented.

A protocol for generation of high-capacity adenoviral vectors lacking all viral coding sequences is presented. Cloning of transgenes contained in the vector genome is based on homing endonucleases. Virus amplification in producer cells grown as adherent cells and in suspension relies on a helper virus providing viral genes in trans.

Clonage et Production à grande échelle de haute capacité vecteurs adénoviraux Basé sur le type adénovirus humain 5

High-capacity adenoviral vectors (HCAdV) devoid of all viral coding sequences represent one of the most advanced gene delivery vectors due to their high ...

Creation of Cardiac Tissue Exhibiting Mechanical Integration of Spheroids Using 3D Bioprinting

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and fibroblasts are first isolated, counted and mixed at desired cell ratios. They are co-cultured in individual wells in ultra-low attachment 96-well plates. Within 3 days, beating spheroids form. These spheroids are then picked up by a nozzle using vacuum suction and assembled on a needle array using a 3D bioprinter. The spheroids are then allowed to fuse on the needle array. Three days after 3D bioprinting, the spheroids are removed as an intact patch, which is already spontaneously beating. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials. 3D bioprinted cardiac patches exhibit mechanical integration of component spheroids and are highly promising in cardiac tissue regeneration and as 3D models of heart disease.

Création d&#39;un tissu cardiaque exposant l&#39;intégration mécanique des sphéroïdes à l&#39;aide de la bioprinterie 3D

This protocol describes 3D bioprinting of cardiac tissue without the use of biomaterials, using only cells. Cardiomyocytes, endothelial cells and ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

Montage et suivi du développement de la communauté microbienne dans une plateforme de microwell Array

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was pretreated with NaOH and washed to a neutral pH. Cellulase was added to the pretreated bamboo powder to generate the hydrolysate, which contained 30 g/L glucose and 15 g/L xylose and was used as the carbon source to prepare a medium for chemical production. When cultured in microaerobic conditions, 12.7 g/L 2,3-butanediol was produced by wildtype K. pneumoniae. In aerobic conditions, 13.0 g/L R-acetoin was produced by the budC mutant of K. pneumoniae. A mixture of 25.5 g/L 2-ketogluconic acid and 13.6 g/L xylonic acid was produced by the budA mutant of K. pneumoniae in a two-stage, pH-controlled fermentation with high air supplementation. In the first stage of fermentation, the culture was maintained at a neutral pH; after cell growth, the fermentation proceeded to the second stage, during which the culture was allowed to become acidic.

Production of Chemicals by Klebsiella pneumoniae Using Bamboo Hydrolysate as Feedstock

Bamboo powder was pretreated with NaOH and enzymatically hydrolyzed. The hydrolysate of bamboo was used as the feedstock for 2,3-butanediol, R-acetoin, 2-ketogluconic acid, and xylonic acid production by Klebsiella pneumoniae.

Production de produits chimiques par<em&gt; Klebsiella pneumoniae</em&gt; Utilisation de l&#39;hydrolysat de bambou comme matière première

Bamboo is an important biomass, and bamboo hydrolysate is used by Klebsiella pneumoniae as a feedstock for chemical production. Here, bamboo powder was ...

Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of bioprocess conditions. One important aspect is the improvement of cultivation medium to provide an optimal environment for microbial formation of the product of interest. It is well accepted that the media composition can dramatically influence overall bioprocess performance. Nutrition medium optimization is known to improve recombinant protein production with microbial systems and thus, this is a rewarding step in bioprocess development. However, very often standard media recipes are taken from literature, since tailor-made design of the cultivation medium is a tedious task that demands microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, fast product analytics, as well as support by lab robotics to enable reliability in liquid handling steps. Furthermore, advanced mathematical methods are required for rationally analyzing measurement data and efficiently designing parallel experiments such as to achieve optimal information content.
The generic nature of the presented protocol allows for easy adaption to different lab equipment, other expression hosts, and target proteins of interest, as well as further bioprocess parameters. Moreover, other optimization objectives like protein production rate, specific yield, or product quality can be chosen to fit the scope of other optimization studies. The applied Kriging Toolbox (KriKit) is a general tool for Design of Experiments (DOE) that contributes to improved holistic bioprocess optimization. It also supports multi-objective optimization which can be important in optimizing both upstream and downstream processes.

This manuscript describes a generic approach for tailor-made design of microbial cultivation media. This is enabled by an iterative workflow combining Kriging-based experimental design and microbioreactor technology for sufficient cultivation throughput, which is supported by lab robotics to increase reliability and speed in liquid handling media preparation.

Protocole générique pour l’optimisation de la Production de protéines hétérologues à l’aide de la technologie automatisée de MICROBIOREACTEUR

A core business in industrial biotechnology using microbial production cell factories is the iterative process of strain engineering and optimization of ...

Large-Scale, Automated Production of Adipose-Derived Stem Cell Spheroids for 3D Bioprinting

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue recognized as a classical source of mesenchymal stromal/stem cells. Many studies have been published with ASCs for scaffold-based tissue engineering approaches, which mainly explored the behavior of these cells after their seeding on bioactive scaffolds. However, scaffold-free approaches are emerging to engineer tissues in vitro and in vivo, mainly by using spheroids, to overcome the limitations of scaffold-based approaches.
Spheroids are 3D microtissues formed by the self-assembly process. They can better mimic the architecture and microenvironment of native tissues, mainly due to the magnification of cell-to-cell and cell-to-extracellular matrix interactions. Recently, spheroids are mainly being explored as disease models, drug screening studies, and building blocks for 3D bioprinting. However, for 3D bioprinting approaches, numerous spheroids, homogeneous in size and shape, are necessary to biofabricate complex tissue and organ models. In addition, when spheroids are produced automatically, there is little chance for microbiological contamination, increasing the reproducibility of the method.
The large-scale production of spheroids is considered the first mandatory step for developing a biofabrication line, which continues in the 3D bioprinting process and finishes in the full maturation of the tissue construct in bioreactors. However, the number of studies that explored the large-scale ASC spheroid production are still scarce, together with the number of studies that used ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting. Therefore, this article aims to show the large-scale production of ASC spheroids using a non-adhesive micromolded hydrogel technique spreading ASC spheroids as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Here, we describe the large-scale production of adipose-derived stromal/stem cell (ASC) spheroids using an automated pipetting system to seed the cell suspension, thus ensuring homogeneity of spheroid size and shape. These ASC spheroids can be used as building blocks for 3D bioprinting approaches.

Production automatisée à grande échelle de sphéroïdes de cellules souches dérivées de cellules adipeuses pour la bioimpression 3D

Adipose-derived stromal/stem cells (ASCs) are a subpopulation of cells found in the stromal vascular fraction of human subcutaneous adipose tissue ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

Fabrication de microgels de chitosane-genipine à taille contrôlée et sans émulsion pour des applications d’ingénierie tissulaire

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...