Nous remercions C. Montojo, J. Reyes, et M. Armour pour obtenir des conseils et une assistance technique. Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health subvention F31 NS063550 (DAL), à un prix Basil O&#39;Connor Starter Scholar et des subventions du Fonds Klingenstein et NARSAD (à SB). SB est un WM Keck Distinguished Scholar jeune en recherche médicale.

utilisation des animaux Obtenir l&#39;approbation du Comité de protection et d&#39;utilisation des animaux institutionnel pour les protocoles de soins standard et l&#39;utilisation. Le protocole actuel est développé pour des études d&#39;irradiation de 5,5 à 10 semaines d&#39;intervention sur des souris adultes âgés C57BL6 / J, comme décrit précédemment (figure 2) 2. Cependant, d&#39;autres âges et petites espèces animales (rats, hamsters, écureuils terrestres, etc) peuvent également être utilisés, à condition que les protocoles d&#39;anesthésie efficace et radiographiques atlas de référence permettant l&#39;identification de la région d&#39;intérêt (ROI) sont disponibles. Une. Calibration de la plate-forme radiologique CT-guidée Effectuer des étalonnages à base de film pour la dose de rayonnement sur la plate-forme radiologique à l&#39;avance pour chaque taille de collimateur et le type de filtre de tube à rayons X utilisés. Afin de cibler un faisceau d&#39;arc de l&#39;irradiation sur le site cible souhaitée, utilisez le logiciel de planification de dose rayonnement 49 en stocke sur la plupart des plates-formes de rayonnement commerciales pour calculer le délai de livraison souhaitée en fonction de la dose de rayonnement, la profondeur de la région d&#39;intérêt (ROI) sur la base de tomodensitométrie de la souris, et la vitesse de rotation de la plate-forme robotique; détails sur cette sont laissés de côté de ce protocole car ils diffèrent entre les plates-formes de rayonnement. Aux fins de la visualisation de l&#39;hypothalamus ventrobasal 2 (figure 3) avec l&#39;imagerie CT, utiliser le tube à rayons X avec une tache focale de 0,4 mm et l&#39;énergie du faisceau de 100 kV avec 1 mm Al filtration. Pour irradiation focale de la HPZ, utiliser le tube à rayons X à 225 kV, 13 mA, et une tache focale de 1 mm avec système de filtration de 0,15 mm Cu, de livrer 10 Gy de rayonnement à une profondeur de tissu de 0,6 cm sur un traitement temps de 4,6 min. Ciblage entre les différentes régions d&#39;intérêt, il faudra calculer des paramètres différents. <ol><li> Si l&#39;étude des effets de l&#39;alimentation riche en graisses sur la neurogenèse dans l&#39;éminence médiane comme décrit précédemment 2, obtenir quatre semaines-vieux C57B fémininL6 / J souris de laboratoires Jackson souris, et de la maison quatre souris par cage. Mettez la nourriture de bouffe normale à une alimentation riche en gras à l&#39;âge de cinq semaines. Permettre souris s&#39;acclimater à un nouveau logement et de la nourriture. Effectuer le traitement CFIR à l&#39;âge de 5,5 semaines. Transport soumet à la salle d&#39;opération qui contient la plate-forme radiologique. Réduire le niveau de stress pendant le transfert. Préparer la chambre de l&#39;anesthésie au gaz isoflurane. Ensuite, ajoutez un simple clic dans la chambre. En parallèle, préparer coussin chauffant (bas de réglage) pour le post-traitement. </li><li> Une fois la souris est sous et ne répond plus à la compression coussinet plantaire, amener le sujet à la plate-forme radiologique et placer sur le lit de l&#39;immobilisation de la scène robotique. Placez la bouche dans le nez cône anesthésie tasse, et les dents de l&#39;objet dans la gouttière occlusale (figure 1D). Lay à plat de la souris sur le lit d&#39;immobilisation et de vérifier pour voir si elle continue à maintenir l&#39;absence de réponse. Si c&#39;est le cas, la bande adhésive souris sur le lit avec du ruban de gaze. Bien coller la souris pour le lit, Assurez-vous que la tête est nivelé à un plan horizontal. Ceci peut être déterminé en le tirant vers le haut des oreilles et de voir si elles sont nivelées. Une fois que la souris est dans la position correcte, fermer le bouclier protecteur de plomb. </li><li> Acquérir de l&#39;analyse par ordinateur tomographie utilisant le logiciel de bord de la plate-forme radiologique de l&#39;expérimentateur (ce sera différent entre les plates-formes), qui fournira une analyse structurelle anatomique tridimensionnelle de l&#39;objet de la souris. Vérifiez si la tête de la souris est nivelé au plan horizontal. Si pas, répétez les étapes 1.2 à 1.3 jusqu&#39;à ce que la tête du sujet est nivelé. </li><li> Identifier le ROI par l&#39;image CT. Calculer la distance de ROI de la surface du crâne à l&#39;aide d&#39;un angle de 45 ° par rapport au plan horizontal comme le montre la figure 3E. </li><li> En utilisant le logiciel de bord, prendre une radiographie de l&#39;objet de la souris au-dessus comme le montre la figure 4A. Ensuite, retirez la souris à partir de la plate-forme radiologique, mettre sur le tapis de chauffage, et de surveiller jusqu&#39;à active. </li><li> A partir des images TDM coronale, calculer la profondeur ROI anatomique moyenne d&#39;au moins trois souris afin de déterminer livraison dosage. A titre d&#39;exemple d&#39;une étude précédente 2 où 10 Gy d&#39;irradiation a été administré à l&#39;hypothalamus ventro-basal, la profondeur de la ROI du crâne (à partir d&#39;un angle de 45 °) est de 0,66 cm (voir la figure 3E). Sachant cela, les chercheurs ont utilisé le logiciel de planification de la dose (DPS) installé sur leur plate-forme radiologique pour calculer la vitesse de rotation appropriée et la durée du traitement pour obtenir la dose souhaitée de la ROI. </li><li> Après la détermination de la durée du traitement et de la vitesse de rotation de l&#39;étage de robot avec le logiciel de planification de la dose, de mesurer les distributions de dose des paramètres calculés avec GAFchromic films sensibles au rayonnement incorporés dans un modèle souris maquette plastique équivalent dans l&#39;eau. Pour ce faire, intégrer trois films sensibles aux rayonnements GAFchromic entre quatre blocs de plastique empilées verticalement équivalent-eau 29 quereprésenté sur la figure 4B. </li><li> Placez modèle de souris maquette contenant des films GAFchromic sur scène robotique, et exécuter le faisceau d&#39;irradiation focale avec les nouveaux paramètres calculés. Par exemple, pour cibler le ventrobasal hypothalamus, l&#39;entrée des paramètres de 0,15 mm filtre de Cu, 225 kVp, 13 mA, 1 mm de réglage de rayonnement de diamètre de faisceau, à 45 ° d&#39;angle de portique, 1,3 rotation ° / sec, et de 4,6 min pour atteindre une ROI dose de rayonnement de 10 Gy. </li><li> Après l&#39;irradiation, consultez films pour modèle et l&#39;intensité de la dose de rayonnement. Pour un angle de rotation de 360 ​​° avec les paramètres indiqués à une cible, l&#39;hypothalamus ventro-basal, un anneau foncé dans le film au-dessus de l&#39;isocentre, une petite tache croustillant à la pellicule de l&#39;isocentre, et un anneau plus léger dans le film au-dessous de l&#39;isocentre correspondant au cône administration de faisceau de l&#39;irradiation sera observé (figure 4B). </li><li> Superposer isocentre films GAFchromic sur les rayons X de sujets de souris à partir de laquelle les paramètres sont calcalculée. Le point focal irradié à isocentre doit chevaucher avec la région de ROI désirée comme montré dans la figure 4C. </li></ol> Autre méthode: Si la difficulté à cibler cerveau ROI persiste, utilisez contraste iodé injecté par voie intrathécale à améliorer la visualisation des ventricules dans les images CT. Par souci de concision, cette procédure est laissée hors de ce protocole, mais est décrit précédemment 35, 50. contraste de l&#39;iode fournira sites ventriculaires supplémentaires (figure 5A). 2. Précision de l&#39;irradiation de faisceau déterminer Confirmer davantage la précision du faisceau CFIR par visualisation directe du faisceau de rayonnement dans le tissu 2, 35, 51. Pour ce faire, effectuez l&#39;immunohistochimie pour détecter γH2AX 51, une protéine histone et un marqueur précoce de cassures double brin. Sujets de souris doivent être perfusés transcardiaque et fixés dans l&#39;heure de l&#39;irradiation. Après l&#39;irradianceation, réparation de l&#39;ADN rapidement s&#39;ensuit, et les niveaux de ΥH2Ax diminuent de façon significative 35. <ol><li> Répétez les étapes 1.1 à 1.3. </li><li> Après la cible est identifiée sur CT, l&#39;objet de la souris est déplacé sous le contrôle robotisé d&#39;aligner cette cible avec le faisceau d&#39;émission de rayonnement. Les paramètres d&#39;entrée calculés (vitesse de rotation et la durée du traitement pour obtenir la dose désirée) à partir de l&#39;étape 1.6 dans un logiciel de planification de la dose et de commencer le traitement. Le traitement est administré avec le portique pointé 45 ° de la verticale alors que la souris tourne autour d&#39;un axe orienté verticalement. </li><li> Après l&#39;irradiation, effectuer perfusion transcardial sur des sujets de souris. Effectuer perfusion en une heure 52. Après cerveaux perfusion, immersion fixes dans 4% PFA / PBS et balancer doucement pendant une nuit à 4 ° C. </li><li> Le lendemain matin, lavez 5 min dans du PBS 3x pour enlever paraformaldéhyde fixateur. Ensuite, immerger dans 30% de saccharose dans du PBS 1x sur une bascule à 4 ° C. </li><li> Secouez doucement à 4 ° C (noussivement 12-16 h), jusqu&#39;à ce que le cerveau tombe au fond du tube. Cela sert comme une étape de cryoprotection. Une fois le cerveau évier, enlever cerveau avec une cuillère perforée pour éviter un excès de 30% sucrose/1x transfert PBS. Intégrer rapidement dans un milieu de congélation sur glace sèche. Agiter milieu de congélation avec la pointe de la pipette et aligner cerveau dans le moule en plastique. </li><li> Une fois complètement congelée, transférer des blocs de cerveau de congélateur à -20 ° C pour le stockage. </li><li> Le jour où l&#39;immunohistochimie sera effectuée, section coronaire à 40 um d&#39;épaisseur, et flottent dans une plaque de 24 puits contenant du PBS avec un pinceau fin. Les articles doivent être conservés afin de série correct pour immunomarquage pour déterminer la couverture d&#39;irradiation de la région cible. </li><li> Préchauffer la solution 0,01 M de citrate de sodium à 80 ° C dans un bain d&#39;eau en vue de l&#39;étape d&#39;extraction de l&#39;antigène. Simultanément, alors que le citrate de sodium est en train de chauffer, effectuer lavages de 5 minutes 3x dans du PBS 0,01 M. </li><li> Une fois que la solution de citrate de sodium est à 80 ° C, immerger coupes de cerveau in de la solution de tampon de citrate de sodium. Laisser au bain-marie à 80 ° C pendant 1 heure. </li><li> Déposer la partie et laisser la solution de citrate de sodium à atteindre la température ambiante, puis effectuez trois lavages de 5 minutes dans du PBS 0,01 M. </li><li> Bloquer des coupes de cerveau pendant 1 h dans du PBS-Triton contenant 5% de sérum de chèvre normal. </li><li> Incuber les coupes d&#39;une nuit dans du PBS-Triton cerveau contenant 5% de sérum de chèvre normal à 1:700 concentration de l&#39;anticorps primaire de souris anti-phospho-H2AX à 4 ° C. </li><li> Le lendemain, effectuer 15 lavages min 3x à 0,01 M PBS-Triton. </li><li> Incuber les coupes de cerveau de PBS-Triton contenant 5% de sérum de chèvre normal avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris conjugué à 488 nm à une concentration de fluorophore 1:500 pendant 2 h. </li><li> Accomplir 15 lavages min 3x dans du PBS 0,01 M-Triton. </li><li> Effectuer 4 &#39;,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) tache (1:5000 dans du PBS) pendant 10 min pour visualiser noyau. Ensuite, lavez les coupes de cerveau pendant 5 min avec du PBS. </li><li> Montez sur électrostatique chmicroscope arged glisse par l&#39;article flottant dans du PBS. Essuyez l&#39;excès de PBS et permettent lames sécher. Lamelle les diapositives à l&#39;aide milieu de montage et laisser les lames sécher à l&#39;obscurité à température ambiante jusqu&#39;au lendemain. </li><li> Prenez des photos de coupes coronales série avec microscope à fluorescence. ΥH2Ax immunologique (vert) indique le site de l&#39;irradiation. DAPI (bleu) est un colorant nucléaire (figure 5B). </li></ol> 3. Préparation de souris Sujets pour l&#39;irradiation focale Examiner les résultats d&#39;immunomarquage ΥH2Ax. Une fois satisfait de l&#39;étalonnage et le ciblage du faisceau d&#39;irradiation, procéder à l&#39;expérience. À ce stade, le temps total nécessaire pour traiter une souris (de configuration de l&#39;animal à l&#39;achèvement de la prestation de faisceau) est d&#39;environ 10-15 minutes pour un traitement de 10 Gy avec un faisceau de 1 mm. <ol><li> Commandez-quatre semaines, âgé de souris femelles C57BL6 / J de laboratoires Jackson souris. Maison quatre souris par cage, et passer la nourriture de bouffe normaleà un régime alimentaire riche en matières grasses à l&#39;âge de cinq semaines. Souris oreille de punch pour leur donner des marques d&#39;identification uniques. Surveiller la santé de souris tous les jours. Remarque: marqueurs métalliques ne peuvent pas être utilisés tels qu&#39;ils résulteront en stries artefacts sur le CT. </li><li> Peser souris le jour avant la radiothérapie ou fictive. souris divisé en deux cohortes de radiothérapie ou de simulacre et de s&#39;assurer qu&#39;il n&#39;y a pas de différence significative de poids entre les cohortes. Le jour du traitement, lorsque les souris sont de six semaines, la réévaluer toutes les souris et enregistrer leur masse. Transporter doucement les deux cohortes de la plate-forme radiologique. Prendre soin de minimiser le niveau de stress. </li><li> Préparer la chambre de l&#39;anesthésie au gaz isoflurane. Anesthésier deux souris, l&#39;une dans le groupe d&#39;irradiation prédéterminée, et une autre dans le groupe témoin factice. Préparer coussin chauffant réglé dans la bas pour le traitement post-opératoire. </li><li> Suivez les étapes 1.2 à 1.4 pour la souris à une irradiation. Pour la souris imposture, garder la souris dans la chambre anesthésie tandis que le traitement est en cours. Faire sure que la chambre de l&#39;anesthésie est proche de la plate-forme de CFIR si les effets sur le rayonnement ambiant sont pris po Après la cible est identifiée sur CT, déplacer l&#39;objet de la souris sous le contrôle robotisé d&#39;aligner cette cible avec le faisceau d&#39;émission de rayonnement. Entrée calculé paramètres (vitesse de rotation et la durée du traitement) dans le logiciel dose de planification. </li><li> Une fois le traitement d&#39;irradiation est terminée, retournez imposture et souris irradiées à coussin chauffant, et suivre jusqu&#39;à ce qu&#39;ils se réveillent. </li><li> Retour à la fois factice et souris irradiées à l&#39;animalerie. Surveillance de tous les jours. Peser la souris toutes les demi semaines. Pour confirmer l&#39;irradiation de la zone proliférative hypothalamique ciblée, administrer des injections intra-péritonéales de BrdU (50 mg / kg), trois jours après le traitement et examiner la neurogenèse entre les groupes par co-marquage de l&#39;immunohistochimie pour BrdU et un marqueur neuronal un mois après l&#39;exposition au BrdU initiale (Figure 6) 2. </li></ol>

JW a une entente de financement et de consultation avec la recherche Xstrahl, Inc.

Irradiation focale tomodensitométrique (CFIR) est une approche nouvelle et complète du système capable de fournir des champs de rayonnement à des cibles dans les petits animaux sous contrôle robotique utilisant CT-guidage 32. La capacité de CFIR à fournir des faisceaux très ciblés à de petits modèles animaux offre de nouvelles possibilités de recherche pour combler la recherche en laboratoire et la traduction clinique. Ce document décrit l&#39;approche de CFIR pour la livraison de rayonnement pr?...

Des découvertes récentes ont démontré que le cerveau des mammifères adultes peuvent subir un degré remarquable de plasticité. neurones adultes nés sont générés à l&#39;âge adulte dans des niches spécialisées du cerveau des mammifères 1. Quelle est la fonction de ces neurones adultes-né? Et d&#39;autant plus, ils jouent un rôle dans ne physiologie et le comportement? Les études sur ce sujet sont traditionnellement concentrées sur la zone sous-ventriculaire des ventricules latéraux et la zone sous-granulaire de l&#39;hippocampe, mais des études récentes ont caractérisé la neurogenèse dans d&#39;autres régions du cerveau comme l&#39;hypothalamus chez les mammifères 2. Neurogenèse a été rapporté dans le post-natale et l&#39;hypothalamus adulte 2-10, et la fonction de ces neurones hypothalamiques nouveau-nés demeure une zone active de l&#39;enquête. La caractérisation fonctionnelle des neurones adultes-né reste un défi important pour le domaine des neurosciences en général. L&#39;inhibition sélective de specIFIC populations de cellules progénitrices neurales reste limitée par le manque de marqueurs moléculaires disponibles qui sont uniques aux populations progénitrices neurales simples 11. Ainsi, la suppression sélective des neurones adultes nés de ces progéniteurs neuronaux via le ciblage génétique reste difficile. De même, la livraison virale de cibler les neurones adultes-né souffre de variables confondantes potentielles telles que l&#39;introduction des blessures et de l&#39;inflammation dans l&#39;environnement 12. De nouveaux outils radiologiques apparaissent, cependant, qui permettent de contourner ces facteurs de confusion et d&#39;enquêter à ces questions grâce à un ciblage anatomique exact et précis dans les petits animaux. Rayonnements ionisants inhibe la naissance et la différenciation de nouveaux neurones, et une méthode non invasive permet de cibler les populations progénitrices neurales 13-15. Récemment, nous avons décrit une région germinale de l&#39;éminence médiane de l&#39;hypothalamus chez les mammifères (ME) que nous avons appelé la zone proliférative hypothalamique (HPZ) 2 </sup&gt;. Nous avons constaté que lorsque les jeunes souris femelles adultes ont été soumis à un régime riche en graisses (HFD), les niveaux de la neurogenèse chez les souris HFD nourris étaient sensiblement plus élevés que leur bouffe normale (NC) contrôles nourris dans cette région ME 2. Pour tester si la neurogenèse adulte dans le ME hypothalamique régule le métabolisme et le poids, nous avons cherché à perturber ce processus. L&#39;éminence médiane est une petite structure unilatérale à la base du troisième ventricule à partir de laquelle hormones de régulation sont libérés. Afin d&#39;inhiber la prolifération et la neurogenèse ultérieure sans altérer les autres fonctions physiologiques de cette région du cerveau, nous avons développé une technique d&#39;irradiation focale non invasive pour inhiber sélectivement la naissance de neurones adultes nouvellement nés dans l&#39;éminence médiane de l&#39;hypothalamus 2. Un certain nombre de groupes ont utilisé le rayonnement de supprimer la neurogenèse dans les régions canoniques 14-28. Cependant, les approches radiologiques précédentes ont généralement ciblé les grandes surfaces, ou Often involontairement également ciblé plusieurs zones du cerveau où la neurogenèse a été signalée, ce qui rend difficile d&#39;associer sans ambiguïté les défauts comportementaux observés avec des défauts dans des populations particulières progénitrices neurales. La capacité de l&#39;irradiation plus ciblée est assurée par des plateformes radiologiques qui combinent c omputer imagerie de tomographie guidée avec f ocal ir faisceau rayonnement (CFIR) livraison pour permettre un ciblage précis anatomique 29-36. Faisceaux de rayonnement aussi faibles que 0,5 mm de diamètre sont disponibles pour cibler des populations de cellules progénitrices neurales spécifiques 35. Cette méthode nous permet de cibler le ME hypothalamique et arrêtons prolifération et bloquons la neurogenèse chez les petits animaux. Après le traitement radiologique sur ces populations de cellules progénitrices, des tests physiologiques et comportementales peuvent être effectuées pour éclairer la fonction potentiel des cellules adultes-né. Ciblage focale est particulièrement important pour notre application depuis lehypophyse est situé à proximité de l&#39;éminence médiane de l&#39;hypothalamus, de l&#39;hypophyse irradiation peut affecter la fonction hormonale et ensuite brouiller les résultats. La base biologique pour la répression de la neurogenèse après irradiation ne sait toujours pas. Études sur les radiations précédents se sont appuyés sur de grosses poutres de la région, et ont conclu que la suppression de la neurogenèse est médiée par une réponse inflammatoire 14, 37. Comme tel, il est difficile de savoir si l&#39;irradiation très focal pourrait supprimer la neurogenèse, car il n&#39;évoque pas une réaction inflammatoire importante. Cependant, des études récentes par notre groupe de la région neurogène classique dans l&#39;hippocampe ont démontré que l&#39;irradiation très focal avec une dose de 10 Gy peut supprimer la neurogenèse pendant au moins 4 semaines après l&#39;irradiation 35. Pour interroger la fonction des neurones hypothalamiques adultes nés dans l&#39;éminence médiane, nous utilisons un rayonnement de précision dériphérique capable de fournir l&#39;imagerie CT en combinaison avec des faisceaux de rayonnement de faible diamètre ME inhiber la neurogenèse. L&#39;utilisation d&#39;un tube à rayons X fixé à un support mobile qui tourne sur une plage de 360 °, nous fournissons arc-faisceau faisceau de micro-irradiation à l&#39;aide d&#39;une platine porte-objet commandé par robot qui permet la rotation d&#39;un sujet animal au cours du traitement de rayonnement (Figure 1) . Un détecteur de rayons X à haute résolution est utilisé pour acquérir des images lorsque le support mobile est dans la position horizontale 33. Pour cette étude, les images TDM ont été reconstituées avec une taille de voxel isotrope de 0,20 mm. Imagerie de bord CT a permis l&#39;identification d&#39;une cible alors que l&#39;animal se trouve dans la position de traitement. La cible a été localisé à l&#39;aide du logiciel de planification de la navigation dose-CT, qui a été inclus dans notre plate-forme radiologique disponible dans le commerce. Après localisation de notre ROI par imagerie CT, l&#39;animal a été déplacé vers la position de traitement approprié par l&#39;étage robotique de spécimen qui a quatre degrees de liberté (X, Y, Z, θ). Grâce à une combinaison de portiques et la scène de robot angles, poutres peuvent être livrés à partir de presque n&#39;importe quelle direction par rapport à l&#39;animal, et les traitements en forme d&#39;arc stéréotaxiques sont possibles 29. Pour ces tous et d&#39;autres études d&#39;imagerie, les souris ont été placées dans un dispositif d&#39;immobilisation qui permet la livraison de gaz isoflurane anesthésie tout en limitant le mouvement. Le lit d&#39;immobilisation est compatible CT, et se connecte à l&#39;étage de spécimen robotisé 34. Nous nous attendons à ce que CFIR fournira avancées conceptuelles dans un certain nombre de domaines de recherche. Bien que nous utilisions le ciblage radiologique de l&#39;éminence médiane de l&#39;hypothalamus comme preuve de principe de cette technique, CFIR peut être utilisé pour cibler n&#39;importe quelle région du corps d&#39;un petit organisme modèle en principe. Dans le domaine des neurosciences, par exemple, nous envisageons cette technique pourrait être utilisée pour évaluer la fonction de populations de cellules progénitrices activement prolifératifs qui ont été proposés à exist dans d&#39;autres organes, tels que circumventriculaires la région postrema 38, 39, subfornical organe 40, et 41 l&#39;hypophyse. Controverses de longue date concernant le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte et identifiant un rôle causal dans le comportement peuvent désormais être mieux pris en compte. Dans chanteur, cette technique pourrait aborder le rôle de la neurogenèse adulte dans le maintien du comportement robuste et saisonnière de chants d&#39;oiseaux 42, qui a été entravée par la capacité d&#39;inhiber sélectivement la neurogenèse dans des régions spécifiques du cerveau. La compréhension de ce modèle de comportement robuste pourrait jeter un nouvel éclairage sur le rôle de la neurogenèse adulte dans la régulation d&#39;autres comportements dimorphisme sexuel. En variante, dans le domaine du métabolisme, CFIR pourrait être utilisé pour explorer les aspects du rôle de la prolifération des hépatocytes et son rôle dans le métabolisme et la balance énergétique. La possibilité pour l&#39;avance conceptuelle dans plusieurs disciplines de recherche est renforcée par l&#39;introduction de cette technique. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Dans cet article, nous démontrons les capacités de CFIR de précision anatomique ciblage d&#39;un faisceau d&#39;irradiation focale. Bien que nous avons d&#39;abord développé cette plate-forme de recherche sur les petits rayonnement animale (SARRP) pour nos études, d&#39;autres dispositifs similaires sont maintenant disponibles dans le commerce qui peut accomplir tomodensitométrique similaire irradiation focale 43, 44. Par conséquent, nous généralisons ce protocole de CFIR avec des étapes nécessaires pour toutes les plateformes de recherche plutôt que celles qui sont spécifiques pour SARRP. Les avantages de CFIR par rapport aux approches radiologiques précédentes pour inhiber la neurogenèse sont que cette technique permet tridimensionnel orientation d&#39;image volumétrique pour la localisation et le ciblage de la dose, la dose conforme minimise l&#39;exposition de régions du cerveau non ciblés, et de la géométrie du faisceau de haute précision permet une distribution de dose conforme à tranchants limites de faisceau. Nous décrivons comment utiliser l&#39;imagerie CT-guidée de cibler la dose à une région anatomique spécifique, et en faisant ainsi, comment visualiser le rayonnementRépartition de la dose directement dans le tissu en utilisant une coloration immunohistochimique pour γ-H2AX, un marqueur de cassures double brin 35, 45-48. L&#39;utilisation de cette approche pour l&#39;irradiation sélective des niches neurogène peut avoir des conséquences importantes en révélant le rôle fonctionnel de nouveaux neurones adultes-né sur la physiologie et la maladie.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP research platform</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td>RS225A</td>
			<td><a href="http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm" target="_blank">http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SARRP irradiation bunker</td>
			<td>Xstrahl</td>
			<td></td>
			<td>Optional, but radiation exposure should be contained with alternative lead shielding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GAF chromic film</td>
			<td>IPS</td>
			<td>GAFchromic ETB2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse phantom</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>457</td>
			<td>Purchase 0.5 cm x 30 cm x 30 cm solid water slabs from Gammex and cut to desired size.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti-phospho-histone H2AX Ser139 antibody</td>
			<td>Millipore, Inc.</td>
			<td>05-636</td>
			<td>clone JBW301</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High-fat rodent diet</td>
			<td>Research Diets</td>
			<td>D12492i</td>
			<td>60% of the calories as fat, food should be irradiated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane</td>
			<td>Baxter Healthcare Corporation</td>
			<td>10019-360-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.01 M Sodium citrate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>1.471 g of sodium citrate dissolved in 500 ml deionized water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superfrost Plus slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>nuclear counterstain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mounting medium</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Vectashield or Gelvatol is preferred</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional interrogation of adult hypothalamic neurogenesis with focal radiological inhibition

La caractérisation fonctionnelle des neurones adultes-né demeure un défi important. Approches pour inhiber la neurogenèse adulte via livraison virale invasive ou des animaux transgéniques ont confond potentiels qui rendent l&#39;interprétation des résultats de ces études difficile. De nouveaux outils radiologiques apparaissent, cependant, qui permettent d&#39;enquêter de manière non invasive une fonction de certains groupes de neurones adultes-né grâce à un ciblage anatomique exact et précis dans les petits animaux. Rayonnements ionisants focale inhibe la naissance et la différenciation de nouveaux neurones, et permet le ciblage des régions spécifiques progénitrices neurales. Afin d&#39;éclairer le rôle fonctionnel potentiel que la neurogenèse adulte hypothalamique joue dans la régulation des processus physiologiques, nous avons développé une technique d&#39;irradiation focale non invasive pour inhiber sélectivement la naissance de neurones adultes nés dans l&#39;éminence médiane de l&#39;hypothalamus. Nous décrivons une méthode pour C omputer tomographie guidéef ocal IR (CFIR) pour permettre la livraison anatomique précise et exacte ciblant les petits animaux. CFIR utilise tridimensionnel orientation d&#39;image volumétrique pour la localisation et le ciblage de la dose de rayonnement, réduit au minimum l&#39;exposition au rayonnement de régions du cerveau non ciblés, et permet une distribution de dose conforme aux limites de faisceaux tranchants. Ce protocole permet de poser des questions concernant la fonction des neurones adultes-né, mais ouvre aussi des zones à des questions dans les domaines de la radiobiologie, la biologie de la tumeur, et de l&#39;immunologie. Ces outils radiologiques faciliteront la traduction des découvertes sur le banc au chevet.

Évaluation de ciblage tomodensitométrique et précision L&#39;étalonnage du système mécanique est essentielle pour assurer que les faisceaux de différents angles tous se coupent en un seul point. L&#39;étalonnage a été réalisé avec un procédé à base de formation d&#39;image à semi-automatique, où la précision de l&#39;alignement bout-à-bout a été mesuré à 0,2 mm 29. Cette précision est très critique à mesure que le volume de la structure de l&#39;éminence m?...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition at JoVE.com

Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

La fonction des neurones de mammifères adultes-né reste une zone active de l&#39;enquête. Rayonnements ionisants inhibe la naissance de nouveaux neurones. Utilisation de la tomographie par ordinateur guidée irradiation focale (CFIR), le ciblage anatomique tridimensionnelle des populations spécifiques progénitrices neurales peut maintenant être utilisée pour évaluer le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte.

Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

The functional characterization of adult-born neurons remains a significant challenge. Approaches to inhibit adult neurogenesis via invasive viral ...

functional-interrogation-adult-hypothalamic-neurogenesis-with-focal

Research

JoVE Journal

Neuroscience

12.1K vues.  California Institute of Technology.  La fonction des neurones de mammifères adultes-né reste une zone active de l'enquête. Rayonnements ionisants inhibe la naissance de nouveaux neurones. Utilisation de la tomographie par ordinateur guidée irradiation focale (CFIR), le ciblage anatomique tridimensionnelle des populations spécifiques progénitrices neurales peut maintenant être utilisée pour évaluer le rôle fonctionnel de la neurogenèse adulte. 

Vidéo: Functional Interrogation of Adult Hypothalamic Neurogenesis with Focal Radiological Inhibition

Functional Mapping with Simultaneous MEG and EEG

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the processing of simple sensory stimuli. We will use somatosensory stimuli to locate the hand somatosensory areas, auditory stimuli to locate the auditory cortices, visual stimuli in four quadrants of the visual field to locate the early visual areas. These type of experiments are used for functional mapping in epileptic and brain tumor patients to locate eloquent cortices. In basic neuroscience similar experimental protocols are used to study the orchestration of cortical activity. The acquisition protocol includes quality assurance procedures, subject preparation for the combined MEG/EEG study, and acquisition of evoked-response data with somatosensory, auditory, and visual stimuli. We also demonstrate analysis of the data using the equivalent current dipole model and cortically-constrained minimum-norm estimates. Anatomical MRI data are employed in the analysis for visualization and for deriving boundaries of tissue boundaries for forward modeling and cortical location and orientation constraints for the minimum-norm estimates.

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to map brain areas involved in the processing of simple sensory stimuli.

Cartographie fonctionnelle avec MEG et EEG simultanée

We use magnetoencephalography (MEG) and electroencephalography (EEG) to locate and determine the temporal evolution in brain areas involved in the ...

Recherche

Neurosciences

Heat-Induced Antigen Retrieval: An Effective Method to Detect and Identify Progenitor Cell Types during Adult Hippocampal Neurogenesis

Traditional methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization of various cell types. These typically proceed with the application of antibodies to bind antigens and identify cells with characteristics that are a function of the inherent biology and development. Adult hippocampal neurogenesis is a sequential process wherein a quiescent neural stem cell can become activated and proceed through stages of proliferation, differentiation, maturation and functional integration. Each phase is distinct with a characteristic morphology and upregulation of genes. Identification of these phases is important to understand the regulatory mechanisms at play and any alterations in this process that underlie the pathophysiology of debilitating disorders. Our heat-induced antigen retrieval approach improves the intensity of the signal that is detected and allows correct identification of the progenitor cell type. As discussed in this paper, it especially allows us to circumvent current problems in detection of certain progenitor cell types.

During adult hippocampal neurogenesis, a distinct set of genetic markers are expressed when a quiescent neural stem cell sequentially progresses and develops into a functionally integrated neuron in the circuit. Using heat-induced antigen retrieval, progenitor cell types that are otherwise difficult to detect are identified with improved effectiveness.

La chaleur induite par un antigène de récupération: une méthode efficace pour détecter et identifier les types de cellules progénitrices adultes au cours de l&#39;hippocampe neurogenèse

Traditional  methods of immunohistochemistry (IHC) following tissue fixation allow visualization  of various cell types. These typically proceed with the ...

Methods for the Modulation and Analysis of NF-&#954;B-dependent Adult Neurogenesis

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult hippocampus has been viewed as a very static anatomical region of the mammalian brain. However, recent findings have demonstrated that the dentate gyrus of the hippocampus is an area of tremendous plasticity in adults, involving not only modifications of existing neuronal circuits, but also adult neurogenesis. This plasticity is regulated by complex transcriptional networks, in which the transcription factor NF-&#954;B plays a prominent role. To study and manipulate adult neurogenesis, a transgenic mouse model for forebrain-specific neuronal inhibition of NF-&#954;B activity can be used.
In this study, methods are described for the analysis of NF-&#954;B-dependent neurogenesis, including its structural aspects, neuronal apoptosis and progenitor proliferation, and cognitive significance, which was specifically assessed via a dentate gyrus (DG)-dependent behavioral test, the spatial pattern separation-Barnes maze (SPS-BM). The SPS-BM protocol could be simply adapted for use with other transgenic animal models designed to assess the influence of particular genes on adult hippocampal neurogenesis. Furthermore, SPS-BM could be used in other experimental settings aimed at investigating and manipulating DG-dependent learning, for example, using pharmacological agents.

Methods for the manipulation and analysis of NF-&#954;B-dependent adult hippocampal neurogenesis are described. A detailed protocol is presented for a dentate gyrus-dependent behavioral test (termed the spatial pattern separation-Barnes maze) for the investigation of cognitive outcome in mice. This technique should also help enable investigations in other experimental settings.

Des procédés pour la modulation et de l&#39;analyse de NF-kB-dépendante neurogenèse adulte

The hippocampus plays a pivotal role in the formation and consolidation of episodic memories, and in spatial orientation. Historically, the adult ...

Functional Imaging of Auditory Cortex in Adult Cats using High-field fMRI

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal models, including monkeys, ferrets, bats, rodents, and cats. In order to draw suitable parallels between human and animal models of auditory function, it is important to establish a bridge between human functional imaging studies and animal electrophysiological studies. Functional magnetic resonance imaging (fMRI) is an established, minimally invasive method of measuring broad patterns of hemodynamic activity across different regions of the cerebral cortex. This technique is widely used to probe sensory function in the human brain, is a useful tool in linking studies of auditory processing in both humans and animals and has been successfully used to investigate auditory function in monkeys and rodents. The following protocol describes an experimental procedure for investigating auditory function in anesthetized adult cats by measuring stimulus-evoked hemodynamic changes in auditory cortex using fMRI. This method facilitates comparison of the hemodynamic responses across different models of auditory function thus leading to a better understanding of species-independent features of the mammalian auditory cortex.

Functional studies of the auditory system in mammals have traditionally been conducted using spatially-focused techniques such as electrophysiological recordings. The following protocol describes a method of visualizing large-scale patterns of evoked hemodynamic activity in the cat auditory cortex using functional magnetic resonance imaging.

Imagerie fonctionnelle du cortex auditif chez chats adultes à l&#39;aide de haut-champ IRMf

Current knowledge of sensory processing in the mammalian auditory system is mainly derived from electrophysiological studies in a variety of animal ...

Stab Wound Injury of the Zebrafish Adult Telencephalon: A Method to Investigate Vertebrate Brain Neurogenesis and Regeneration

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular mechanisms involved in zebrafish adult central nervous system (CNS) regeneration and repair, we developed a zebrafish model of adult telencephalic injury.
In this approach, we manually generate an injury by pushing an insulin syringe needle into the zebrafish adult telencephalon. At different post injury days, fish are sacrificed, their brains are dissected out and stained by immunohistochemistry and/or in situ hybridization (ISH) with appropriate markers to observe cell proliferation, gliogenesis, and neurogenesis. The contralateral unlesioned hemisphere serves as an internal control. This method combined for example with RNA deep sequencing can help to screen for new genes with a role in zebrafish adult telencephalon neurogenesis, regeneration, and repair.

To shed light on the cellular and molecular mechanisms of zebrafish adult neurogenesis and regeneration, we developed a protocol for invasive surgery causing mechanical injuries in the zebrafish adult telencephalon and subsequent monitoring of changes in the stabbed hemisphere by immunohistochemistry or in situ hybridization.

Stab blessures plaies du poisson zèbre adulte Télencéphale: Une méthode pour étudier le cerveau des vertébrés neurogenèse et régénération

Adult zebrafish have an amazing capacity to regenerate their central nervous system after injury. To investigate the cellular response and the molecular ...

Multi-photon Intracellular Sodium Imaging Combined with UV-mediated Focal Uncaging of Glutamate in CA1 Pyramidal Neurons

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high spatial and temporal resolution. Combined with electrophysiology, it is widely used to study activity-related calcium signals in small subcellular compartments such as dendrites and dendritic spines. In addition to calcium transients, synaptic activity also induces postsynaptic sodium signals, the properties of which are only marginally understood. Here, we describe a method for combined whole-cell patch-clamp and multi-photon sodium imaging in cellular micro domains of central neurons. Furthermore, we introduce a modified procedure for ultra-violet (UV)-light-induced uncaging of glutamate, which allows reliable and focal activation of glutamate receptors in the tissue. To this end, whole-cell recordings were performed on Cornu Ammonis subdivision 1 (CA1) pyramidal neurons in acute tissue slices of the mouse hippocampus. Neurons were filled with the sodium-sensitive fluorescent dye SBFI through the patch-pipette, and multi-photon excitation of SBFI enabled the visualization of dendrites and adjacent spines. To establish UV-induced focal uncaging, several parameters including light intensity, volume affected by the UV uncaging beam, positioning of the beam as well as concentration of the caged compound were tested and optimized. Our results show that local perfusion with caged glutamate (MNI-Glutamate) and its focal UV-uncaging result in inward currents and sodium transients in dendrites and spines. Time course and amplitude of both inward currents and sodium signals correlate with the duration of the uncaging pulse. Furthermore, our results show that intracellular sodium signals are blocked in the presence of blockers for ionotropic glutamate receptors, demonstrating that they are mediated by sodium influx though this pathway. In summary, our method provides a reliable tool for the investigation of intracellular sodium signals induced by focal receptor activation in intact brain tissue.

We describe the combination of focal UV-induced photo-activation of neuro-active compounds with whole-cell patch-clamp and multi-photon imaging of intracellular sodium transients in dendrites and spines of hippocampal neurons in acute tissue slices of the mouse brain.

Multi-photon intracellulaire Imaging sodium Combiné avec uncaging focale médiation-UV de glutamate dans CA1 pyramidale neurones

Multi-photon fluorescence microscopy has enabled the analysis of morphological and physiological parameters of brain cells in the intact tissue with high ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

This article presents a convenient and rapid method for visualizing different neuronal cell populations in the central nervous system of Xenopus embryos using immunofluorescent staining on sections.

Évaluation de la neurogenèse primaire en<em&gt; Xenopus</em&gt; Embryons Utilisation de immunocoloration

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

Online Transcranial Magnetic Stimulation Protocol for Measuring Cortical Physiology Associated with Response Inhibition

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) characterization of primary motor cortex (M1) excitability and inhibition. Motor response inhibition prevents unwanted actions and is abnormal in several neuropsychiatric conditions. TMS is a non-invasive technology that can quantify M1 excitability and inhibition using single- and paired-pulse protocols and can be precisely timed to study cortical physiology with high temporal resolution. We modified the original Slater-Hammel (S-H) stop signal task to create a &#34;racecar&#34; version with TMS pulses time-locked to intra-trial events. This task is self-paced, with each trial initiating after a button push to move the racecar towards the 800 ms target. GO trials require a finger-lift to stop the racecar just before this target. Interspersed randomly are STOP trials (25%) during which the dynamically adjusted stop signal prompts subjects to prevent finger-lift. For GO trials, TMS pulses were delivered at 650 ms after trial onset; whereas, for STOP trials, the TMS pulses occurred 150 ms after the stop signal. The timings of the TMS pulses were decided based on electroencephalography (EEG) studies showing event-related changes in these time ranges during stop signal tasks. This task was studied in 3 blocks at two study sites (n=38) and we recorded behavioral performance and event-related motor-evoked potentials (MEP). Regression modelling was used to analyze MEP amplitudes using age as a covariate with multiple independent variables (sex, study site, block, TMS pulse condition [single- vs. paired-pulse], trial condition [GO, successful STOP, failed STOP]). The analysis showed that TMS pulse condition (p&#60;0.0001) and its interaction with trial condition (p=0.009) were significant. Future applications for this online S-H/TMS paradigm include the addition of simultaneous EEG acquisition to measure TMS-evoked EEG potentials. A potential limitation is that in children, the TMS pulse sound could&#160;affect behavioral task performance.

We describe an experimental procedure to quantify excitability and inhibition of primary motor cortex during a motor response inhibition task by using Transcranial Magnetic Stimulation throughout the course of a Stop Signal Task.

Protocole de Stimulation magnétique transcrânienne en ligne pour mesurer la physiologie corticale associée à l’Inhibition de la réponse

We describe the development of a reproducible, child-friendly motor response inhibition task suitable for online Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) ...

Conducting Hyperscanning Experiments with Functional Near-Infrared Spectroscopy

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding of the neurobiological underpinnings of social interactions, and possibly interpersonal relationships. Functional near-infrared spectroscopy (fNIRS) is well suited for conducting hyperscanning experiments because it measures local hemodynamic effects with a high sampling rate and, importantly, it can be applied in natural settings, not requiring strict motion restrictions. In this article, we present a protocol for conducting fNIRS hyperscanning experiments with parent-child dyads and for analyzing brain-to-brain synchrony. Furthermore, we discuss critical issues and future directions, regarding the experimental design, spatial registration of the fNIRS channels, physiological influences and data analysis methods. The described protocol is not specific to parent-child dyads, but can be applied to a variety of different dyadic constellations, such as adult strangers, romantic partners or siblings. To conclude, fNIRS hyperscanning has the potential to yield new insights into the dynamics of the ongoing social interaction, which possibly go beyond what can be studied by examining the activities of individual brains.

The present protocol describes how to conduct fNIRS hyperscanning experiments and analyze brain-to-brain synchrony. Further, we discuss challenges and possible solutions.

Des expériences de Hyperscanning avec la spectroscopie proche infrarouge fonctionnelle

Concurrent brain recordings of two or more interacting persons, an approach termed hyperscanning, are gaining increasing importance for our understanding ...

Interrogation fonctionnelle des adultes hypothalamique neurogenèse avec Focal radiologique inhibition

PLAYLIST