Ce travail a été soutenu par le CNRS (PICS 2012-2014 à EG) et par une subvention de la Région Campanie (LR n ° 5, 28.03.2002 à Giovanna Mottola). Filippo Conti est un membre de la Fondation de Coopération Scientifique&#39;&#39; Infectiopole Sud.&#39;&#39; Nicola Boucherit est membre du Ministère français de la Recherche et de la Technologie. Les sources de financement n&#39;ont joué aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte de données, analyse de données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Déclaration d&#39;éthique Le protocole de manipulation des animaux a été approuvé par notre Comité institutionnel d&#39;éthique animale &quot;Conseil Scientifique du Centre de Formation et de Recherche Expérimentale Médico-Chirurgical» (CFREMC, permis de projet 10-300122013 Eric Ghigo) de l&#39;Université d&#39;Aix-Marseille en accord avec les règles de Décret N ° 87-848 du 19/10/1987. Les expériences ont été effectuées à la Faculté de Médecine de la Timone (numéro de permis d&#39;expérimentation 13,385 à Eric Ghigo). Une. Matériel et Culture Préparation médias <ol><li> Stériliser deux pinces, deux ciseaux, deux lames chirurgicales, un mortier et un pilon. </li><li> Obtenir du DMEM complet contenant 10% de sérum de veau foetal (FCS), 2 mM de glutamine, 100 U / ml de pénicilline et 100 pg / ml de streptomycine. </li><li> Diluer 10x PBS dans de l&#39;eau distillée stérile pour obtenir 1x PBS. </li><li> Obtenir glacée 1x PBS, DMEM complet glacée, wa DMEM completrmé à 37 ° C. </li></ol> 2. Préparation de L929 surnageants cellulaires <ol><li> Croître jusqu&#39;à confluence des cellules L929 (vingt 175 cm2 dans du DMEM complet) à 37 ° C, 5% CO 2. </li></ol> Remarque: les colonies de granulocytes-macrophages facteur de stimulation (GM-CSF) est nécessaire pour induire la différenciation des cellules hématopoïétiques dans les macrophages 12. L929 produisent GM-CSF. <ol start="2"><li> A confluence, remplacer le support de culture avec du DMEM complet frais. Transférer les flacons à 32 ° C, 5% CO 2 pendant 10 jours. </li><li> Recueillir, piscine et centrifuger les surnageants à 750 g pendant 10 min. Jeter culots cellulaires. </li><li> surnageants de magasins en tubes de 15 ml et conserver à -20 ° C. </li></ol> 3. Dérivées de moelle osseuse macrophages (BMDM) Préparation <ol><li> Sacrifier une souris par dislocation cervicale. <ol><li> Utiliser des lames chirurgicales stériles pendant toute l&#39;expérience. Désinfecter la peau avec 70% alcohol. Faire une incision au sommet de chaque patte arrière et tirez la peau vers le bas vers le pied pour exposer le muscle. </li><li> Coupez les pattes de derrière, enlever la peau avec des ciseaux stériles et des pinces stériles. Placer les jambes à l&#39;intérieur d&#39;une boîte de Pétri stérile (35/10 mm) contenant stérile, refroidi à la glace 1x PBS (5 ml). </li><li> Retirer la chair et les muscles qui sont adhère à l&#39;os avec des ciseaux et des pinces stériles. </li></ol></li><li> Transférer les os dans un nouveau plat, Petri stérile (35/10 mm) contenant de la glace-froid, stérile 1x PBS (5 ml). Laver les os deux fois avec 5 ml refroidi à la glace, 1x PBS stérile. </li><li> Transférer l&#39;os dans un mortier stérile contenant 5 ml refroidi à la glace, 1x PBS stérile. </li><li> Couper le tibia du fémur à l&#39;articulation avec des ciseaux stériles. Briser les os délicatement dans un mortier stérile contenant 5 ml de glace-froid, stérile 1x PBS aide d&#39;un pilon. </li><li> Recueillir le surnageant dans 15 ml tubes glacés. Répétez cette étape 3x. </li><li> Filtrer à travers une cellule de Nylon stra 70 umINER pour éliminer les fragments solides. Centrifuger le filtrat à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C. </li><li> Jeter doucement le surnageant. Dissocier le culot dans 10 ml de tampon de lyse des globules rouges pendant 30 s. Ajouter 20 ml refroidi à la glace, du DMEM complet. </li></ol> Remarque: Le but de cette étape est d&#39;éliminer les contaminer les globules rouges, ainsi, cette étape doit être effectuée en 2 min afin d&#39;éviter l&#39;altération des cellules hématopoïétiques par le tampon de lyse des globules rouges du sang. <ol start="8"><li> Centrifuger à 450 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter doucement le surnageant. Dissocier le culot dans 20 ml de DMEM complet qui a été chauffé à 37 ° C. </li><li> Transférer les cellules dissociées dans deux boîtes de Pétri (100/20 mm). Incuber pendant 4 heures à 37 ° C. </li><li> Collecter les surnageants dans des tubes de 50 ml à la température ambiante. Jeter les plats qui contiennent les macrophages résidents. </li></ol> Remarque: L&#39;objectif de cette étape est d&#39;éliminer la Marro osseuse résidentw macrophages par leur aptitude à adhérer à la culture traitée plastique. Ces macrophages résidents peuvent être utilisés dans d&#39;autres expériences. <ol start="11"><li> Centrifuger les surnageants recueillis à 450 xg pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. </li><li> Dissocier doucement le culot dans 10 ml de DMEM complet contenant 15% L929 surnageant cellulaire. Filtrer les cellules à travers un tamis cellulaire en nylon de 40 pm. </li><li> Récupérer le filtrat. Ajouter le filtrat recueilli (10 ml) à 140 ml de DMEM complet qui a été supplémenté avec 15% de cellules L929 médias. </li><li> Distribuer 10 ml de la suspension de cellules par boîte de Pétri (15 boîtes de Pétri, 100/20 mm). Incuber les cellules à 37 ° C, 5% CO 2. </li><li> Cultiver des cellules pendant 3 jours </li><li> Ajouter 10 ml de DMEM complet qui a été complété par 15% L929. Incuber les cellules pendant 4 jours supplémentaires. </li></ol> Remarque: Surveiller la croissance des cellules périodiquement avec un microscope inversé (étapes 3.14 à 3.16). Macrophages adhérents serontobservé après 3 jours de culture. 4. BMDMs de récolte <ol><li> Retirer le surnageant. Laver BMDMs 2 fois avec du DMEM complet </li><li> Ajouter 5 ml de DMEM complet qui a été chauffé à 37 ° C. Détachez BMDMs en grattant doucement avec une spatule en caoutchouc. </li><li> Recueillir BMDMs en tubes de 50 ml et centrifuger à 450 g pendant 10 min. Dissocier doucement culots de cellules dans 20 ml de DMEM complet. </li><li> Comptez BMDMs en présence de bleu trypan (pas de mortalité de plus de 10% doit être observé). </li></ol> Remarque: En règle générale, d&#39;environ 6 à 7,5 x 10 7 macrophages sont obtenus à partir de 15 boites de Pétri (100/20 mm) des macrophages. Il ya environ 4-5 x 10 6 macrophages / boîte de Pétri (100/20 mm). <ol start="5"><li> Préparer BMDMs comme requis pour l&#39;expérience. Après 16 heures dans un milieu complet à 37 ° C, 5% CO 2, les macrophages de nouveau adhérer au support. </li></ol> 5. Stockage BMDMs <ol><li> Recueillir BMDMs isolés (étape 4.3). Centrifuger à 450 g pendant 10 min. Remarque: BMDMs peuvent être congelées dans l&#39;azote liquide. </li><li> les culots de cellules de remettre en suspension dans des milieux de congélation consistant en 10% de DMSO et 90% de FCS à une concentration finale de 4 x 10 6 cellules / ml et pipette 1 ml dans chaque ampoule. </li><li> Geler les cellules à une vitesse de refroidissement de 1 ° C / min. Après 24 h, le transfert de l&#39;ampoule dans un récipient d&#39;azote liquide pour un stockage à long terme. </li></ol>

<ol>
	<li>Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+generating+functionally+heterogeneous+macrophages:+chaos+revisited.">Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited.</a> J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).</li><li>Van Furth, R., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).</li><li>Adams, D., Halmiton, T., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).</li><li>Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+in+haemopoietic+and+other+tissues+of+the+developing+mouse+detected+by+the+monoclonal+antibody+F4/80.">Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80.</a> Development. 112, 517-526 (1991).</li><li>Haas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagosome:+compartment+with+a+license+to+kill.">The phagosome: compartment with a license to kill.</a> Traffic. 8, 311-330 (2007).</li><li>Underhill, D. M., Ozinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis+of+microbes:+complexity+in+action.">Phagocytosis of microbes: complexity in action.</a> Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).</li><li>Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte/macrophage+proteomics:+recent+findings+and+biomedical+applications.">Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications.</a> Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).</li><li>Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+polarization+in+bacterial+infections.">Macrophage polarization in bacterial infections.</a> J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).</li><li>Barry, A. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+stimulation+of+p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS+by+LPS+from+pathogenic+Coxiella+burnetii+prevents+trafficking+to+microbicidal+phagolysosomes.">Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes.</a> Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).</li><li>Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uniformity+of+phagosome+maturation+in+macrophages.">The uniformity of phagosome maturation in macrophages.</a> J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).</li><li>Sundaramurthy, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+Chemical+and+RNAi+Multiparametric+Profiles+Identifies+Triggers+of+Intracellular+Mycobacterial+Killing.">Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing.</a> Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).</li><li>Boltz-Nitulescu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+of+rat+bone+marrow+cells+into+macrophages+under+the+influence+of+mouse+L929+cell+supernatant.">Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant.</a> J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).</li></ol>

Il n&#39;y a pas de conflit d&#39;intérêt déclaré.

Le protocole décrit ci-après en détail un procédé pour produire de grands nombres de BMDMs. BMDM sont des cellules primaires et ont la fonction biologique et les propriétés des macrophages différenciés à partir de monocytes, car il n&#39;y a mature, à la différence de lignées de cellules macrophages, qui sont immatures. BMDMs peut être utilisé pour le dépistage génétique (RNAi), le dépistage des drogues, des études fonctionnelles, les études d&#39;interaction hôte-pathogène et de nombreux autres d...

Un aspect important de la fonction des macrophages est leur rôle dans l&#39;immunité innée et adaptative. En raison de leur capacité à phagocyter les particules inertes, des bactéries ou des parasites, les macrophages sont une première ligne de défense contre les envahisseurs étrangers. Une fois intériorisée, les microbes sont dégradés dans phagolysosomes. Macrophages envoient aussi des signaux de recrutement et les antigènes présents à d&#39;autres cellules immunitaires comme les lymphocytes T. Les macrophages sont dérivées de monocytes. Les monocytes se posent dans la moelle osseuse à partir de cellules souches myéloïdes et migrent vers le sang périphérique et de divers tissus où ils se différencient en macrophages. On estime que d&#39;une souris adulte en bonne santé contient environ 10 8 macrophages qui sont distribuées dans tout le corps dans divers organes et tissus (tableau 1) 1,2. Macrophages présentent une grande diversité phénotypique et fonctionnelle en raison de leur capacité à s&#39;adapter à leur 3,4 microenvironnement. Le plus important macrophage propriété est leur activité microbicide, qui est défini par leur capacité de phagocyter des microbes et les détruire. La réponse phagocytaire est définie par l&#39;activation des réseaux de signalisation complexes qui sont stimulés par le contact microbienne, ainsi, les macrophages modulent l&#39;expression du gène de manière appropriée en réponse à divers stimuli. Après la phagocytose, les microbes sont éliminés dans une structure appelée la phagolysosome, mais de nombreux microbes pathogènes ont développé des stratégies pour renverser la fonction microbicide des macrophages 5. La diversité des mécanismes de subversion qui sont utilisés par les différentes espèces microbiennes est un témoignage de la complexité du processus phagocytaire 6 et phagolysosome biogenèse. Les maladies infectieuses sont les principaux problèmes de santé humaine, et de nombreux mécanismes et les molécules participent à des activités antimicrobiennes des macrophages. En outre, les objectifs des propriétés microbicides qui sont pris en otage par les microbes restent inconnus; ainsi, il est un explosion d&#39;intérêt dans les aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et des interactions hôte-pathogène qui a renouvelé l&#39;attention des scientifiques concernant les macrophages. Actuellement, la majorité des travaux de recherche dans le domaine est effectuée sur des lignées de cellules macrophages, qui diffèrent des macrophages primaires dans l&#39;activité phagocytaire, la production de cytokines et la régulation de la poussée oxydative. En outre, ils sont moins appropriés pour la microscopie. Pour étudier l&#39;interaction macrophages-pathogènes, il est recommandé d&#39;utiliser les macrophages primaires, telles que les macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMDMs), qui présentent des caractéristiques plus physiologiques. En outre, il est possible de travailler sur BMDMs génétiquement modifiés, parce que ces macrophages pourraient être isolés directement à partir des souris transgéniques, et de la disponibilité des technologies nouvelles telles que la transfection lentiviral, son profil d&#39;expression du gène peut être modifiée par surexpression du gène ou de l&#39;ARN interférence. Ici, nous décrivons une procédure de différencier osseuse murine mflèche en macrophages qui fourniront un grand nombre de macrophages dans les 7 jours pour diverses analyses fonctionnelles telles que la protéomique 7, 8 transcriptomique, le trafic intracellulaire étudie 9, 10 études dynamiques, les écrans génétiques (ARNi) et le dépistage de drogues 11.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>21969-035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Calf Serum</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>10270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>15070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Gibco Life Technologies</td>
			<td>25030-024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS (10x)</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BEM515F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Red Blood Cell Lysis buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R7757</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 70 &#956;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#956;m Nylon</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml tubes</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (100/20 mm)</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td>culture treated</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dishes (35/10 mm)</td>
			<td>any supplier</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

bone marrow-derived macrophage production

Les macrophages sont des éléments essentiels de la réponse immunitaire innée et adaptative, et ils sont la première ligne de défense contre les envahisseurs étrangers en raison de leurs activités microbicides puissants. Les macrophages sont largement distribués dans tout le corps et sont présentes dans les organes lymphoïdes, le foie, les poumons, le tractus gastro-intestinal, du système nerveux central, de l&#39;os et de la peau. En raison de leur répartition, ils participent à une large gamme de processus physiologiques et pathologiques. Les macrophages sont des cellules très polyvalents qui sont capables de reconnaître des modifications micro-environnementales et de maintenir l&#39;homéostasie tissulaire. De nombreux agents pathogènes ont développé des mécanismes pour utiliser les macrophages comme des chevaux de Troie pour survivre, se reproduire dans, et d&#39;infecter les humains et les animaux et de se propager dans tout le corps. La récente explosion de l&#39;intérêt pour les aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et des interactions hôte-pathogène a renouvelé l&#39;attention des scientifiques concernant les macrophages. Ici, nous décrivons unprocédé pour isoler et cultiver les macrophages de la moelle osseuse murine qui fournira un grand nombre de macrophages pour étudier les interactions hôte-pathogène, ainsi que d&#39;autres processus.

Le but de ce procédé est d&#39;obtenir facilement un grand nombre de macrophages dans quelques jours. La préparation de cellules de moelle osseuse est illustré sur la figure 1. Os de la patte arrière ont été recueillies et brisé dans un mortier. Une fois que les macrophages résidents ont été retirés de la préparation de cellules de moelle osseuse, des cellules de moelle osseuse ont été incubées avec du GM-CSF (jour 0). Après 3 jours, les cellules, qui étaient ronds et non adhérent ava...

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Bone Marrow-derived Macrophage Production

Les macrophages ont longtemps été reconnu comme un élément essentiel des réponses immunitaires innées et adaptatives. L&#39;explosion récente des connaissances relatives aux aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et de l&#39;interaction entre les macrophages et les microbes a renouvelé l&#39;attention des scientifiques à macrophages. Cet article décrit une méthode pour différencier les macrophages de moelle osseuse de souris.

Dérivées de moelle osseuse Macrophages production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

bone-marrow-derived-macrophage-production

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

72.8K vues.  Aix-Marseille Université.  Les macrophages ont longtemps été reconnu comme un élément essentiel des réponses immunitaires innées et adaptatives. L'explosion récente des connaissances relatives aux aspects évolutifs, génétiques, biochimiques et de l'interaction entre les macrophages et les microbes a renouvelé l'attention des scientifiques à macrophages. Cet article décrit une méthode pour différencier les macrophages de moelle osseuse de souris. 

Vidéo: Bone Marrow-derived Macrophage Production

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii disseminates as a fast replicating form called the tachyzoite. Tachyzoites convert into a slow-growing encysted form called the bradyzoite by a signaling process that is not well characterized. Within animals, bradyzoite cysts are found in the central nervous system and muscle tissue and represent the chronic stage of infection. Conversion to bradyzoites can be simulated in tissue culture by CO2 starvation, using medium with high a pH, or the addition of interferon gamma (IFN&gamma;). Bradyzoites are characterized by the presence of a cyst wall, to which the lectin Dolichos biflorus agglutinin (DBA) binds. Fluorescently labeled DBA is used to visualize the cyst wall in parasites grown in human foreskin fibroblasts (HFFs) that have been exposed to low CO2 and high pH medium. Similarly, parasites residing in murine bone marrow-derived macrophages (BMMs) display a cyst wall detectable by DBA after the BMMs are activated with IFN&gamma; and lipopolysaccharide (LPS). This protocol will demonstrate how to induce conversion of T. gondii to bradyzoites using a high pH growth medium with low CO2 and activation of BMMs. Host cells will be cultured on coverslips, infected with tachyzoites and either activated with addition of IFN&gamma; and LPS (BMMs) or exposed to a high pH growth medium (HFFs) for three days. Upon completion of infections, host cells will be fixed, permeabilized, and blocked. Cyst walls will be visualized using rhodamine DBA with fluorescence microscopy.

Toxoplasma gondii Cyst Wall Formation in Activated Bone Marrow-derived Macrophages and Bradyzoite Conditions

Toxoplasma gondii converts to a cyst form in response to environmental stresses, which can be mimicked in tissue culture models. This video demonstrates techniques to examine cyst wall formation by activating bone marrow-derived macrophages or changing growth medium pH in fibroblast cells.

Toxoplasma gondii Formation paroi du kyste dans la moelle osseuse Activé macrophages dérivés et Conditions Bradyzoite

Toxoplasma gondii is an obligate intracellular parasite that can invade any nucleated cell of warm-blooded animals. During infection, T. gondii ...

Recherche

Immunologie et infection

Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone marrow, spleen, lymph nodes and Peyer's patches 1-3. DCs present in peripheral tissues sample the organism for the presence of antigens, which they take up, process and present in their surface in the context of major histocompatibility molecules (MHC). Then, antigen-loaded DCs migrate to immunological organs where they present the processed antigen to T lymphocytes triggering specific immune responses. One way to evaluate the migratory capabilities of DCs is to label them with fluorescent dyes 4.
Herewith we demonstrate the use of Qdot fluorescent nanocrystals to label murine bone marrow-derived DC. The advantage of this labeling is that Qdot nanocrystals possess stable and long lasting fluorescence that make them ideal for detecting labeled cells in recovered tissues. To accomplish this, first cells will be recovered from murine bone marrows and cultured for 8 days in the presence of granulocyte macrophage-colony stimulating factor in order to induce DC differentiation. These cells will be then labeled with fluorescent Qdots by short in vitro incubation. Stained cells can be visualized with a fluorescent microscopy. Cells can be injected into experimental animals at this point or can be into mature cells upon in vitro incubation with inflammatory stimuli. In our hands, DC maturation did not determine loss of fluorescent signal nor does Qdot staining affect the biological properties of DCs. Upon injection, these cells can be identified in immune organs by fluorescent microscopy following typical dissection and fixation procedures.

Dendritic cells uptake antigens and migrate towards immune organs to present processed antigens to T cells. Qdot nanocrystal labeling provides a long-lasting and stable fluorescent signal. This allows tracking of dendritic cells to different organs by fluorescent microscopy.

Génération et d&#39;étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Enquête de la polarisation des macrophages aide de moelle osseuse macrophages dérivés

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Metabolic Characterization of Polarized M1 and M2 Bone Marrow-derived Macrophages Using Real-time Extracellular Flux Analysis

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or M(LPS) macrophages are pro-inflammatory, IL-4 induces alternative macrophage activation and these so-called M2 or M(IL-4) support resolution of inflammation and wound healing. Recent evidence shows the crucial role of metabolic reprogramming in the regulation of M1 and M2 macrophage polarization. 
In this manuscript, an extracellular flux analyzer is applied to assess the metabolic characteristics of naive, M1 and M2 polarized mouse bone marrow-derived macrophages. This instrument uses pH and oxygen sensors to measure the extracellular acidification rate (ECAR) and oxygen consumption rate (OCR), which can be related to glycolytic and mitochondrial oxidative metabolism. As such, both glycolysis and mitochondrial oxidative metabolism can be measured in real-time in one single assay.
Using this technique, we demonstrate here that inflammatory M1 macrophages display enhanced glycolytic metabolism and reduced mitochondrial activity. Conversely, anti-inflammatory M2 macrophages show high mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) and are characterized by an enhanced spare respiratory capacity (SRC). 
The presented functional assay serves as a framework to investigate how particular cytokines, pharmacological compounds, gene knock outs or other interventions affect the macrophage&#8217;s metabolic phenotype and inflammatory status.

Metabolic reprogramming is a characteristic and prerequisite for M1 and M2 macrophage polarization. This manuscript describes an assay for the measurement of fundamental parameters of glycolysis and mitochondrial function in mouse bone marrow-derived macrophages. This tool can be applied to investigate how particular factors affect the macrophage&#8217;s metabolism and phenotype.

Caractérisation métabolique des polarisée M1 et M2 macrophages dérivées de moelle osseuse Utilisation en temps réel Analyse extracellulaire Flux

Specific metabolic pathways are increasingly being recognized as critical hallmarks of macrophage subsets. While LPS-induced classically activated M1 or ...

Assessment of Antibody-based Drugs Effects on Murine Bone Marrow and Peritoneal Macrophage Activation

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages are equally important in turning off inflammatory responses. We have shown that macrophages stimulated with intravenous immunoglobulin (IVIg) can produce high amounts of the anti-inflammatory cytokine, interleukin 10 (IL-10), and low levels of pro-inflammatory cytokines in response to bacterial lipopolysaccharides (LPS). IVIg is a polyvalent antibody, primarily immunoglobulin Gs (IgGs), pooled from the plasma of more than 1,000 blood donors. It is used to supplement antibodies in patients with immune deficiencies or to suppress immune responses in patients with autoimmune or inflammatory conditions. Infliximab, a therapeutic anti-tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) antibody, has also been shown to activate macrophages to produce IL-10 in response to inflammatory stimuli. IVIg and other antibody-based biologics can be tested to determine their effects on macrophage activation. This paper describes methods for derivation, stimulation, and assessment of murine bone marrow macrophages activated by antibodies in vitro and murine peritoneal macrophages activated with antibodies in vivo. Finally, we demonstrate the use of western blotting to determine the contribution of specific cell signaling pathways to anti-inflammatory macrophage activity. These protocols can be used with genetically modified mice, to determine the effect of a specific protein(s) on anti-inflammatory macrophage activation. These techniques can also be used to assess whether specific biologics may act by changing macrophages to an IL-10-producing anti-inflammatory activation state that reduces inflammatory responses in vivo. This can provide information on the role of macrophage activation in the efficacy of biologics during disease models in mice, and provide insight into a potential new mechanism of action in people. Conversely, this may caution against the use of specific antibody-based biologics to treat infectious disease, particularly if macrophages play an important role in host defense against that infection.

Antibody-based drugs have revolutionized treatment for inflammatory diseases. In addition to having direct effects on specific targets, antibodies can activate macrophages to become anti-inflammatory. This protocol describes how anti-inflammatory macrophage activation can be assessed in vitro, using mouse bone marrow macrophages, and in vivo, using peritoneal macrophages.

Évaluation des effets de médicaments à base d’anticorps murins de la moelle osseuse et d’Activation des macrophages péritonéaux

Macrophages are phagocytic innate immune cells, which initiate immune responses to pathogens and contribute to healing and tissue restitution. Macrophages ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and adaptive immune responses. In vitro study of macrophages can be undertaken by ex vivo culture from the peritoneum or through differentiation of myeloid bone marrow progenitor cells to form bone marrow-derived macrophages (BMDMs). A common approach to macrophage differentiation from precursors involves the use of conditioned media from L929 cells (LCM). This media is easy to self-produce but suffers from batch variability, and its constituents are undefined. Similarly, Foetal Bovine Serum (FBS) is used to support growth but contains a vast mixture of undefined molecules that may vary between batches. These methods are not adequate for the study of nitric oxide biology and redox mechanisms as they both contain substantial amounts of small molecules that either interfere with redox mechanisms or supplement levels of cofactors, such as tetrahydrobiopterin (BH4), required for the production of NO from inducible nitric oxide synthase (iNOS). In this report, we present an optimized protocol allowing for control of the NO-redox environment by reducing the levels of exogenous biopterin while maintaining conditions suitable for cell growth and differentiation. Tight control of culture media composition helps ensure experimental reproducibility and facilitates accurate interpretation of results. In this protocol, BMDMs were obtained from a GTP cyclohydrolase (GCH)- deficient mouse model. Culture of BMDMs was performed with media containing either (i) conditioned LCM, or (ii) recombinant M-CSF and GM-CSF to produce minimal artifacts while obtaining BH4 and NO-deficient culture conditions - thus allowing for the reproducible study of NO-redox biology and immunometabolism in vitro.

Isolation and In vitro Culture of Bone Marrow-Derived Macrophages for the Study of NO-Redox Biology

This protocol has been established to culture tetrahydrobiopterin (BH4)- and inducible nitric oxide synthase (iNOS)-deficient primary murine macrophages to study NO-redox biology. The study focuses on reducing potential contamination of BH4 and other artifacts found in traditional isolation and culture methods which may confound experimental outcomes and interpretation of results.

Isolement et culture in vitro de macrophages dérivés de la moelle osseuse pour l’étude de la biologie du NO-Redox

Macrophages are derived from hematopoietic progenitor cells throughout the body, are central to inflammatory processes, and participate in innate and ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...