Ce travail soutenu en partie par le NIH sous Grant R15 CA137499-01 (FB) et un fonds de démarrage de l&#39;Ohio University (FB).

1. Dissection de fémurs et tibias de la souris et la culture de cellules de moelle osseuse <ol><li> Sacrifice 2 souris par le CO 2 asphyxie et soigneusement décortiquer les tibias et les fémurs sans couper les extrémités des os. </li><li> Nettoyez les os de tous les tissus attachés en utilisant du papier de soie. Attention à ne pas briser les os. </li><li> Stériliser les os par immersion dans de l&#39;éthanol à 70% pendant 10 min dans un plat de Pétri de 35 mm. A partir de ce moment, le travail intérieur d&#39;une hotte de biosécurité pour éviter la contamination des cultures cellulaires. </li><li> Récupérer les os de l&#39;éthanol et les laisser sécher à l&#39;air pendant 5 min dans une boîte de Pétri dans l&#39;armoire de biosécurité. </li><li> Couper les fémurs de moitié, et le tibia par sa pointe plus fine. Faire infuser l&#39;intérieur de l&#39;os avec 1 ml de milieu RPMI (sans sérum mais avec des antibiotiques) à l&#39;aide d&#39;une seringue stérile sur une boîte de Pétri stérile. </li><li> La suspension cellulaire est recueilli et lavé 2X dans le milieu RPMI par 10 centrifugation min dans un tube de 15 ml de centrifugeuses à 1100 RPM dans une centrifugeuse réfrigérée (4 ° C) avec un rotor swing. </li><li> Après le dernier lavage, remettre en suspension les cellules dans 2 ml de tampon de lyse ACK et incuber pendant 5 min à température ambiante afin d&#39;éliminer les globules rouges. </li><li> Ajouter 13 ml de RPMI avec 10% de FBS, resuspendre et laver 2X dans ce milieu avec les mêmes paramètres que décrite au point 1.6. </li><li> Compter les cellules, ajuster à 2 x 10 5 cellules / ml avec du RPMI 10% SVF, et ajoutez rm-GM-CSF (20 ng / ml final) 5. </li><li> Ajouter 10 ml de cette suspension à une stérile, la qualité microbiologique, 10 cm boîte de Petri, et la culture dans un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Trois jours plus tard, ajouter un autre 10 ml de RPMI 10% SVF à 20 ng / l de rmGM-CSF à chacun des plats préparés. </li><li> Trois jours plus tard, 10 ml de suspension cellulaire sont récupérés à partir de chaque boîte de Pétri, centrifugé comme dans 1.6, remis en suspension dans le même volume de RPMI 10% SVF avec rmGM-CSF et retourné à la boîte de Pétri. Les cellules sont cultivées pendant 2 jours supplémentaires dans l&#39;incubateur CO 2. </li></ol> 2. Collecte et l&#39;étiquetage des PED <ol><li> Après 8 jours de culture des cellules faiblement adhérentes sont récupérées par lavage de la boîte de Pétri avec un milieu frais. Ce protocole rend environ 2-4 x10 8 PED dans nos mains. Les cellules peuvent être analysés pour phénotype DC par cytométrie en flux. </li><li> Cellules prélevées sont ensuite étiquetées avec le Qtracker 655 Kit marquage cellulaire suivant strictement les instructions du fabricant. </li><li> Nous avons obtenu d&#39;excellents résultats étiquetage dérivées de la moelle osseuse de souris avec les PED Qdots à une concentration de 10 nM. Pour ce faire, des aliquotes de composants cellulaires Kit Qtracker Etiquetage A et B sont mélangés dans des volumes égaux, incubé pendant 5 min à température ambiante, et immédiatement après dilution 1 / 100 en milieu frais avec vortex pendant 30 s. </li><li> Pour tache 5 x 10 6 CD, mélanger 5 ul de chaque composants du kit A et B dans un tube Eppendorf et incuber pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, ajoutez 1 ml de RPMI FBS incuber 10%, et le vortex pendant 30 secondes. </li><li> Ajouter 0,5 ml de suspension cellulaire contenant 5 x10 6 CD, et incuber à 37 ° C pendant 60 min. </li><li> Ensuite, laver les cellules 2X dans RPMI 10% SVF (1100 RPM). Les cellules peuvent être remises en suspension dans du RPMI pour la culture d&#39;autres ou en PBS pour injection dans des souris expérimentales. </li></ol> 3. Evaluation de DC étiquetés <ol><li> Marquage cellulaire peut être évaluée au moyen de la microscopie à fluorescence. Pour ce faire, une goutte de suspension cellulaire sont ajoutés à une lame de microscope, recouvert d&#39;une lamelle de verre, et évaluées avec un microscope à fluorescence en tenant compte que ces Qdots ont émission et d&#39;excitation des spectres de 565nm et 525nm, respectivement de 405 (fig. 3 ) </li><li> À ce stade, les cellules marquées peuvent être utilisées pour injecter des animaux, ou de maturation peut être induite en incubant ces cellules pendant 48 h (37 ° C, 5 CO 2), en présence de LPS (100 ng / ml) et le TNF-( 20 ng / ml). Fluorescent étiquetage n&#39;est pas affectée par la maturation des CD (fig. 4). </li></ol> 4. Les résultats représentatifs: Par la présente, nous avons décrit comment préparer dérivées de la moelle osseuse de souris et comment les PED étiquetés avec Qdots fluorescentes. Fig. 1 résume la procédure pour obtenir la cellule, tandis que la Fig. 2 illustre la procédure à les étiqueter avec Qdots. Comme le montre la Fig. 3, presque toutes les cellules sont marquées par cette procédure, et ce n&#39;est pas affectée par la maturation des CD avec des facteurs inflammatoires (Fig. 4). Fig. 5 montre que Qdot teinté PED (Fig.5a) se comportent similaires aux non-tachés cellules lorsqu&#39;elles sont traitées avec un cocktail inflammatoires. Les deux préparations cellulaires de la même réguler positivement l&#39;expression des molécules de costimulation (Fig. 5b), et de produire des quantités similaires de l&#39;IL-6 (fig. 5c) et l&#39;oxyde nitrique (fig. 5d) à des stimuli de maturation. Ceci concorde avec précédes unités d&#39;organisation des données publiées indiquant que la coloration Qdot n&#39;affecte pas la capacité de DC à se transformer en cellules matures capables de provoquer des réponses immunitaires [6]. Ces cellules peuvent ensuite être utilisées pour injecter des animaux de laboratoire. Comme le montre la Fig. 6, 2 jours après l&#39;injection intraveineuse de PED étiquetés dans des souris, nous avons été capables de détecter Qdot cellules colorées dans la rate. Ceci est également en accord avec les précédents données publiées montrant l&#39;utilisation des nanocristaux Qdot pour évaluer la migration des DC in vivo [6] par l&#39;imagerie non invasive et cytométrie de flux. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig1.jpg" alt="Figure 1"/> Organigramme Figure 1. Génération du CC de la moelle osseuse. Par la présente, nous dépeignent le processus pour obtenir la moelle osseuse DC dérivées. Les deux tibias et les fémurs sont disséqués et propre à partir de tissus environnants. Conseils osseuse sont préservées et l&#39;intérieur de l&#39;os sont rincées avec support. Après l&#39;élimination des globules rouges, cellules de moelle osseuse sont cultivés pendant 8 jours en présence de GM-CSF pour les différencier en DC. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig2.jpg" alt="Figure 2"/> Organigramme Figure 2. De la procédure d&#39;étiquetage. Aliquotes égales des composants de la cellule Kit Qtracker Etiquetage A et B sont mélangés dans un tube Eppendorf. Les cellules dendritiques sont collectées à partir de 8 jours cultures de moelle osseuse avec GM-CSF et mélangé avec le colorant d&#39;étiquetage pour 60 min à 37C. Puis les cellules sont lavées dans les médias afin d&#39;éliminer les particules d&#39;étiquetage excès. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig3.jpg" alt="Figure 3"/> Figure 3. Microphotographie fluorescent des PED immédiatement après l&#39;étiquetage. Une goutte de cellules marquées a été déposé sur une lame de verre et couverts par une lamelle. Ensuite, des échantillons ont été évalués dans un microscope à fluorescence et images ont été acquises par une caméra numérique 5.0 Micropublisher CCD couleur (QImaging, Surrey, BC Canada). <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig4.jpg" alt="Figure 4"/> Figure 4. Microphotographie fluorescent des PED après 48 h de maturation in vitro. PED étiquetés ont été cultivés pendant 48 h avec le LPS (100 ng / ml) et le TNF-α (20 ng / ml) sur des lames de verre sur un incubateur à CO 2 (37 ° C, 5% CO 2). Ensuite, des échantillons ont été lavés avec du PBS (5 min, 2X), fixées à l&#39;acétone (15 min, 4 ° C) et de contraste avec le DAPI. Les cellules ont été évaluées dans un microscope à fluorescence comme ci-dessus. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig5.jpg" alt="Figure 5"/> Figure 5. L&#39;activité biologique des Qdot teinté CD matures. PED étiquetés mûri in vitro, comme ci-dessus ont été analysés par cytométrie en flux (A) et (B). (A) Qdot cellules colorées donner un signal fort dans le FL3 (PerCP) canal. Shaded histogramme: contrôle non colorées. (B) PED Qdot-colorées et non colorées ont en outre été colorés avec des anticorps spécifiques contre la maturation des marqueurs CD86 et CD40, et contrôle isotypique. Les cellules ont ensuite été analysées dans un cytomètre en flux FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA). De plus, l&#39;IL-6 (C) et l&#39;oxyde nitrique (NO) ont été déterminés dans les surnageants de maturité Qdot teinté PED et les contrôles. Les niveaux d&#39;IL-6 et de l&#39;oxyde nitrique ont été déterminés par analyse ELISA et test de Griess que nous avons décrit précédemment 7, 8. Toutes les données ont montré dans cette figure est représentative de deux ou trois expériences indépendantes montrant des résultats similaires. Les données ont été analysées par ANOVA en utilisant le logiciel GraphPad. <img src="/files/ftp_upload/2785/2785fig6.jpg" alt="Figure 6"/> Figure 6. Détection des PED dans les tissus étiquetés disséqués. Étiquetés CD matures (1x10 6 cellules) ont été injectés par voie intraveineuse à des souris C57BL / 6. (A) Deux jours plus tard, les souris ont été sacrifiées et les rates recueillies, snap congelés, embarqué dans un PTOM, et 8 sections uM préparés en utilisant un cryostat. Ensuite, des échantillons ont été fixés avec de l&#39;acétone (15 min, 4 ° C) et de contraste avec le DAPI. Les cellules ont été évaluées dans un microscope à fluorescence comme ci-dessus figure 6a:. Grossissement de 40X, fig 6b: grossissement 100X, fig. 6C, grossissement 400x.

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	<li>Banchereau, J., Briere, F., Caux, C., Davoust, J., Lebecque, S., Liu, Y. J., Pulendran, B., Palucka, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunobiology+of+dendritic+cells.">Immunobiology of dendritic cells.</a> Annu Rev Immunol. 18, 767-811 (2000).</li><li>Bonasio, R., von Andrian, U. 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Murin myéloïde) PED ont été largement utilisées afin de déterminer l&#39;efficacité et l&#39;amélioration des vaccins à base de DC; enquêter sur DC: les interactions des cellules T ou de développement continu, et déterminer leur rôle dans diverses maladies 9-11. Par la présente, nous montrons comment générer les PED à partir de précurseurs récupéré de courges os de tibias et les fémurs. Nous récupérons les os sans couper les bouts, nous permettant de les stériliser par immersion dans l&#39;éthanol à 70%, réduisant ainsi la probabilité de contamination. Pour différencier les PED à partir des cellules de moelle osseuse, nous n&#39;utilisons que le GM-CSF que 5 décrit précédemment. Bien que certains protocoles utilisent aussi l&#39;IL-4, il a été rapporté que cette cytokine n&#39;est pas nécessaire lorsqu&#39;on travaille avec des niveaux élevés de GM-CSF 12. En effet, nous l&#39;avons déjà démontré que ces contrôleurs sont capables d&#39;induire des réponses immunitaires 13. Aussi, les soins doivent être prises pour récupérer uniquement les cellules faiblement adhérentes à partir de 8 jours cultures par lavage de la boîte de Pétri avec un milieu de cellules attachées depuis montrent un phénotype plus monocyte. Ici, nous montrons l&#39;étiquetage des PED avec des particules fluorescentes Qdot. Cet étiquetage a peu de respect avantages à d&#39;autres méthodes. Premièrement, les particules Qdots sont facilement incorporés dans les cellules. Deuxièmement, le signal fluorescent est très élevé et n&#39;est pas altérée par la maturation des CD. Troisièmement, la fluorescence n&#39;est pas perdu lorsque les cellules ou les tissus sont fixés avec des solvants comme l&#39;acétone, contrairement à ce qui se passe si la GFP est utilisé pour marquer les PED 14, donnant plus de flexibilité au moment de choisir les protocoles de coloration. Enfin, le signal haute fluorescente donnée par ces particules permet de visualiser les cellules des tissus, malgré l&#39;auto-fluorescence. Comme décrit précédemment 6, coloration Qdot n&#39;a pas affecté la capacité de maturation de ces cellules. Par la présente, nous montrons que Qdot teinté PED se comportent de façon similaire que les non-tachés PED, upregulating molécules de costimulation, et la production d&#39;IL-6 et l&#39;oxyde nitrique en réponse aux stimuli inflammatoires. Bien que les PED sont des cellules spécialisées dans le déclenchement des réponses immunitaires, elles ont été montrées à participer dans des conditions pathologiques comme le cancer et l&#39;athérosclérose 4, 15, 16. Ils ont été également affirmé à participer au processus angiogénique 17, 18, ​​a même suggéré que la structure participe à l&#39;élaboration de nouveaux vaisseaux 19, 20. Ainsi, les méthodes qui permettent de DC suivi in vivo, et de déterminer leur localisation géographique dans les différents tissus 4, 21, 22 sont très précieux.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> Souris C57BL / 6 </td><td> Laboratoires Jackson </td><td></td><td> Les femelles, âgées de 6-8 semaines </td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Invitrogen </td><td> 11875-119 </td><td></td></tr><tr><td> Sérum fœtal bovin, qualifié </td><td> Invitrogen </td><td> 10437-028 </td><td></td></tr><tr><td> Antibiotiques antimycosiques </td><td> Invitrogen </td><td> 15240-096 </td><td></td></tr><tr><td> PBS </td><td> Invitrogen </td><td> 10010-049 </td><td></td></tr><tr><td> Tampon de lyse ACK </td><td> Lonza Walkersville, Inc </td><td> 10-548E </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant GM-CSF murin </td><td> PeproTech Inc </td><td> 315-03 </td><td></td></tr><tr><td> Qtracker 655 kit de marquage cellulaire </td><td> Invitrogen </td><td> Q25021MP </td><td></td></tr><tr><td> Lipopolysaccharide </td><td> Invivogen </td><td> tlrl-eblps </td><td></td></tr><tr><td> Recombinant murin TNF alpha </td><td> Peprotech </td><td> 315-01A </td><td></td></tr><tr><td> CD86 anticorps </td><td> BD Biosciences </td><td> 553691 </td><td></td></tr><tr><td> CD40 anticorps </td><td> BD Biosciences </td><td> 553791 </td><td></td></tr><tr><td> Système réactif de Griess </td><td> Promega </td><td> G2930 </td><td></td></tr><tr><td> IL-6 anticorps de capture </td><td> eBioscience </td><td> 13-7061-81 </td><td></td></tr><tr><td> D&#39;anticorps de détection d&#39;IL-6 </td><td> eBioscience </td><td> 13-7062-81 </td><td></td></tr></tbody></table>

generation and labeling of murine bone marrow-derived dendritic cells with qdot nanocrystals for tracking studies

Cellules dendritiques (CD) sont des cellules présentant l&#39;antigène professionnelles (APC) a trouvé dans les tissus périphériques et dans les organes immunologiques comme le thymus, la moelle osseuse, la rate, les ganglions lymphatiques et les plaques de Peyer 1-3. PED présente dans l&#39;échantillon des tissus périphériques de l&#39;organisme à la présence d&#39;antigènes, dont ils prennent, traiter et présenter dans leur surface dans le contexte des molécules de complexe majeur d&#39;histocompatibilité (CMH). Ensuite, l&#39;antigène CD chargés de migrer vers les organes immunologiques où ils présentent l&#39;antigène aux lymphocytes T traitées déclenchement des réponses immunitaires spécifiques. Une façon d&#39;évaluer les capacités migratoires des PED est de les étiqueter avec des colorants fluorescents 4. Par la présente, nous démontrons l&#39;utilisation de nanocristaux fluorescents Qdot à l&#39;étiquette dérivées de moelle osseuse murine DC. L&#39;avantage de cet étiquetage est que Qdot nanocristaux possèdent stable et à long fluorescence durables qui les rendent idéales pour la détection de cellules marquées dans les tissus récupérés. Pour ce faire, les premières cellules seront récupérés auprès des courges d&#39;os murins et cultivés pendant 8 jours dans la présence de granulocytes macrophages facteur stimulant les colonies afin d&#39;induire la différenciation DC. Ces cellules seront ensuite marqués avec Qdots fluorescents par de courtes incubation in vitro. Les cellules colorées peuvent être visualisées avec un microscope à fluorescence. Les cellules peuvent être injectées dans les animaux de laboratoire à ce point ou peut être en cellules matures après incubation in vitro avec des stimuli inflammatoires. Dans nos mains, la maturation des CD n&#39;a pas de déterminer la perte de signal fluorescent ni coloration Qdot affecter les propriétés biologiques des PED. Lors de l&#39;injection, ces cellules peuvent être identifiées dans les organes immunitaires par microscopie à fluorescence après la dissection typiques et des procédures de fixation.

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Generation and Labeling of Murine Bone Marrow-derived Dendritic Cells with Qdot Nanocrystals for Tracking Studies

Dendritiques antigènes des cellules d&#39;absorption et de migrer vers les organes à l&#39;abri de présenter les antigènes aux cellules T traitées. Qdot nanocristal étiquetage fournit un signal de longue durée et stable fluorescentes. Cela permet le suivi des cellules dendritiques à différents organes par microscopie fluorescente.

Génération et d&#39;étiquetage des murins de la moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des nanocristaux Qdot pour les études de suivi

Dendritic cells (DCs) are professional antigen presenting cells (APCs) found in peripheral tissues and in immunological organs such as thymus, bone ...

generation-labeling-murine-bone-marrow-derived-dendritic-cells-with

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

24.7K vues.  Ohio University. Dendritiques antigènes des cellules d'absorption et de migrer vers les organes à l'abri de présenter les antigènes aux cellules T traitées. Qdot nanocristal étiquetage fournit un signal de longue durée et stable fluorescentes. Cela permet le suivi des cellules dendritiques à différents organes par microscopie fluorescente.

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Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic stem/progenitor cells from the bone marrow are directed into monocytic differentiation, followed by M1 or M2 stimulation. The activation status can be tracked by changes in cell surface antigens, gene expression and cell signaling pathways.

Enquête de la polarisation des macrophages aide de moelle osseuse macrophages dérivés

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Recherche

Immunologie et infection

Bone Marrow-derived Macrophage Production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because of their powerful microbicidal activities. Macrophages are widely distributed throughout the body and are present in the lymphoid organs, liver, lungs, gastrointestinal tract, central nervous system, bone, and skin. Because of their repartition, they participate in a wide range of physiological and pathological processes. Macrophages are highly versatile cells that are able to recognize microenvironmental alterations and to maintain tissue homeostasis. Numerous pathogens have evolved mechanisms to use macrophages as Trojan horses to survive, replicate in, and infect both humans and animals and to propagate throughout the body. The recent explosion of interest in evolutionary, genetic, and biochemical aspects of host-pathogen interactions has renewed scientific attention regarding macrophages. Here, we describe a procedure to isolate and cultivate macrophages from murine bone marrow that will provide large numbers of macrophages for studying host-pathogen interactions as well as other processes.

Macrophages have long been recognized as a critical component of the innate and adaptive immune responses. The recent explosion of knowledge pertaining to evolutionary, genetic, and biochemical aspects of the interaction between macrophages and microbes has renewed scientific attention to macrophages. This article describes a method to differentiate macrophages from mouse bone marrow.

Dérivées de moelle osseuse Macrophages production

Macrophages are critical components of the innate and adaptive immune responses, and they are the first line of defense against foreign invaders because ...

Isolation and Intravenous Injection of Murine Bone Marrow Derived Monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of various fields in biomedical science. The method described below is a simple and effective way to isolate murine monocytes from heterogeneous bone marrow.
Bone marrow from the femur and tibia of Balb/c mice is harvested by flushing with phosphate buffered saline (PBS). Cell suspension is supplemented with macrophage-colony stimulating factor (M-CSF) and cultured on ultra-low attachment surfaces to avoid adhesion-triggered differentiation of monocytes. The properties and differentiation of monocytes are characterized at various intervals. Fluorescence activated cell sorting (FACS), with markers like CD11b, CD115, and F4/80, is used for phenotyping. At the end of cultivation, the suspension consists of 45%&#177; 12% monocytes. By removing adhesive macrophages, the purity can be raised up to 86%&#177; 6%. After the isolation, monocytes can be utilized in various ways, and one of the most effective and common methods for in vivo delivery is intravenous tail vein injection. 
This technique of isolation and application is important for mouse model studies, especially in the fields of inflammation or immunology. Monocytes can also be used therapeutically in mouse disease models.

Here we present a protocol that generates large amounts of murine monocytes from heterogeneous bone marrow for translational applications. In comparison to others, this new method helps reduce the number of sacrificed animals and lowers costs by avoiding expensive methods such as high gradient magnetic cell separation (MACS).

Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

As a subtype of leukocytes and progenitors of macrophages, monocytes are involved in many important processes of organisms and are often the subject of ...

Generation of Immature, Mature and Tolerogenic Dendritic Cells with Differing Metabolic Phenotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. The immune system is a constant balance in maintaining tolerance to self-molecules and reacting rapidly to pathogens. Dendritic cells (DCs) are powerful professional antigen presenting cells that link the innate immune system to the adaptive immune system and balance the adaptive response between self and non-self. Depending on the maturation signals, immature dendritic cells can be selectively stimulated to differentiate into immunogenic or tolerogenic DCs. Immunogenic dendritic cells provide proliferation signals to antigen-specific T cells for clonal expansion; while tolerogenic dendritic cells regulate tolerance by antigen-specific T-cell deletion or clonal expansion of regulatory T-cells. Due to this unique property, dendritic cells are highly sought after as therapeutic agents for cancer and autoimmune diseases. Dendritic cells can be loaded with specific antigens in vitro and injected into the human body to mount a specific immune response both immunogenic and tolerogenic. This work presents a means to generate in vitro from monocytes, immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), tolerogenic and mature moDCs that differ in surface marker expression, function and metabolic phenotypes.

Immature dendritic cells can be selectively differentiated into tolerogenic or mature dendritic cells to regulate the balance between immunity and tolerance. This work presents a means to generate from immature monocyte derived dendritic cells (moDCs), in vitro tolerogenic and mature moDCs that differ in metabolic phenotypes.

Génération de Immature, d&#39;âge mûr et tolérogène cellules dendritiques avec Metabolic Différentes phénotypes

Immune response results from a complex interplay between the antigen non-specific innate immune system and the antigen specific adaptive immune system. ...

Generation and Identification of GM-CSF Derived Alveolar-like Macrophages and Dendritic Cells From Mouse Bone Marrow

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. However, they are difficult to isolate in sufficient numbers to study them in detail, therefore, in vitro models have been developed. In vitro cultures of bone marrow-derived macrophages and dendritic cells are well-established and valuable methods for immunological studies. Here, a method for culturing and identifying both DCs and macrophages from a single culture of primary mouse bone marrow cells using the cytokine granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) is described. This protocol is based on the established procedure first developed by Lutz et al. in 1999 for bone marrow-derived DCs. The culture is heterogeneous, and MHCII and fluoresceinated hyaluronan (FL-HA) are used to distinguish macrophages from immature and mature DCs. These GM-CSF derived macrophages provide a convenient source of in vitro derived macrophages that closely resemble alveolar macrophages in both phenotype and function.

Bone marrow cells cultured with granulocyte macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) generate a heterogeneous culture containing macrophages and dendritic cells (DCs). This method highlights using MHCII and hyaluronan (HA) binding to differentiate macrophages from the DCs in the GM-CSF culture. Macrophages in this culture have many similarities to alveolar macrophages.

Génération et identification de GM-CSF dérivé alvéolaires comme Macrophages et cellules dendritiques à partir de moelle osseuse de souris

Macrophages and dendritic cells (DCs) are innate immune cells found in tissues and lymphoid organs that play a key role in the defense against pathogens. ...

Generation of Human Monocyte-derived Dendritic Cells from Whole Blood

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition receptors (PRRs) expressed on their cell surface and thereby activate and regulate immunity. 
The major function of DCs is the induction of adaptive immunity in the lymph nodes by presenting antigens via MHC I and MHC II molecules to na&#239;ve T lymphocytes. Therefore, DCs have to migrate from the periphery to the lymph nodes after the recognition of pathogens at the sites of infection. For in vitro experiments or DC vaccination strategies, monocyte-derived DCs are routinely used. These cells show similarities in physiology, morphology, and function to conventional myeloid dendritic cells. They are generated by interleukin 4 (IL-4) and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) stimulation of monocytes isolated from healthy donors. Here, we demonstrate how monocytes are isolated and stimulated from anti-coagulated human blood after peripheral blood mononuclear cell (PBMC) enrichment by density gradient centrifugation. Human monocytes are differentiated into immature DCs and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting after 5 days of incubation.

Here, we demonstrate how monocytes are isolated by magnetic bead separation from peripheral blood mononuclear cells after density gradient centrifugation of human anti-coagulated blood. Following incubation for 5 days, human monocytes are differentiated into immature dendritic cells and are ready for experimental procedures in a non-clinical setting.

Génération de cellules humaines dérivées de monocytes dendritiques du sang total

Dendritic cells (DCs) recognize foreign structures of different pathogens, such as viruses, bacteria, and fungi, via a variety of pattern recognition ...

Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have recently been recognized to be more heterogeneous than previously appreciated. These cultures routinely contain moDC as well monocyte-derived macrophages (moMac), and even some less developed cells such as monocytes. The goal of this protocol is to provide a consistent method for identification and separation of the many cell types present in these cultures as they develop, so that their specific functions may be further investigated. The sorting strategy presented here separates cells first into four populations based on expression of Ly6C and CD115, both of which are expressed transiently by cells as they develop in GM-CSF-driven culture. These four populations include Common myeloid progenitors or CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage progenitors or GMP (Ly6C+, CD115-), monocytes (Ly6C+, CD115+), and monocyte-derived macrophages or moMac (Ly6C-, CD115+). CD11c is also added to the sorting strategy to distinguish two populations within the Ly6C-, CD115- population: CMP (CD11c-) and moDC (CD11c+). Finally, two populations may be further distinguished within the Ly6C-, CD115+ population based on the level of MHC class II expression. MoMacs express lower levels of MHC class II, while a monocyte-derived DC precursor (moDP) expresses higher MHC class II. This method allows for the reliable isolation of several developmentally distinct populations in numbers sufficient for a variety of functional and developmental analyses. We highlight one such functional readout, the differential responses of these cell types to stimulation with Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).

Here we provide a method for identifying and isolating large numbers of GM-CSF driven myeloid cells using high speed cell sorting. Five distinct populations (Common myeloid progenitors, granulocyte/macrophage progenitors, monocytes, monocyte-derived macrophages, and monocyte-derived DCs) can be identified based on Ly6C and CD115 expression.

Génération d’un grand nombre de progéniteurs myéloïdes et précurseurs des cellules dendritiques de murin la moelle osseuse à l’aide d’une nouvelle cellule stratégie de tri

Cultures of monocyte-derived dendritic cells (moDC) generated from mouse bone marrow using Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) have ...

Detection of Inflammasome Activation and Pyroptotic Cell Death in Murine Bone Marrow-derived Macrophages

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote inflammatory and autoinflammatory diseases. Inflammasomes are activated by cytosolic pattern recognition receptors, including members of the NOD-like receptor (NLR) family. These receptors oligomerize upon the detection of microbial or damage-associated stimuli. Subsequent recruitment of the adaptor protein ASC forms a microscopically visible inflammasome complex, which activates caspase-1 through proximity-induced auto-activation. Following the activation, caspase-1 cleaves pro-IL-1&#946; and pro-IL-18, leading to the activation and secretion of these pro-inflammatory cytokines. Caspase-1 also mediates the inflammatory form of cell death termed pyroptosis, which features the loss of membrane integrity and cell lysis. Caspase-1 cleaves gasdermin D, releasing the N-terminal fragment which forms plasma membrane pores, leading to osmotic lysis.
In vitro, the activation of caspase-1 can be determined by labeling bone marrow-derived macrophages with the caspase-1 activity probe FAM-YVAD-FMK and by labeling the cells with antibodies against the adaptor protein ASC. This technique allows the identification of inflammasome formation and caspase-1 activation in individual cells using fluorescence microscopy. Pyroptotic cell death can be detected by measuring the release of cytosolic lactate dehydrogenase into the medium. This procedure is simple, cost effective and performed in a 96-well plate format, allowing adaptation for screening. In this manuscript, we show that activation of the NLRP3 inflammasome by nigericin leads to the co-localization of the adaptor protein ASC and active caspase-1, leading to pyroptosis.

We describe the detection of NLRP3 inflammasome activation on cellular basis using fluorescence microscopy and staining for active caspase-1 and the adaptor, ASC. A lactate dehydrogenase release assay is presented to detect pyroptotic lysis on a population basis. These techniques can be adapted to study many aspects of inflammasome biology.

Détection d’Activation Inflammasome et mort cellulaire de Pyroptotic dans les Macrophages dérivés de la moelle osseuse Murine

Inflammasomes are innate immune signaling platforms that are required for the successful control of many pathogenic organisms, but also promote ...

An In Vivo Mouse Model to Measure Na&#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played by T cells in an immune response. This protocol describes the in vitro differentiation of bone marrow (BM) progenitors to obtain granulocyte macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) derived-dendritic cells (DCs). The protocol also describes the adoptive transfer of ovalbumin peptide (OVAp)-loaded GM-CSF-derived DCs and na&#239;ve CD4 T cells from OTII transgenic mice in order to analyze the in vivo activation, proliferation, and Th1 differentiation of the transferred CD4 T cells. This protocol circumvents the limitation of purely in vivo methods imposed by the inability to specifically manipulate or select the studied cell population. Moreover, this protocol allows studies in an in vivo environment, thus avoiding alterations to functional factors that may occur in vitro and including the influence of cell types and other factors only found in intact organs. The protocol is a useful tool for generating changes in DCs and T cells that modify adaptive immune responses, potentially providing important results to understand the origin or development of numerous immune associated diseases.

An &lt;em&gt;In Vivo&lt;/em&gt; Mouse Model to Measure Na&amp;#239;ve CD4 T Cell Activation, Proliferation and Th1 Differentiation Induced by Bone Marrow-derived Dendritic Cells

Here, we present a protocol for the in vivo determination of na&#239;ve CD4 T cell (T cell) activation, proliferation, and Th1 differentiation induced by GM-CSF bone marrow (BM)-derived dendritic cells (DCs). In addition, this protocol describes BM and T-cell isolation, DC generation, and DC and T-cell adoptive transfer.

Un modèle de souris In Vivo à l’Activation des cellules T CD4 naïves mesure, la prolifération et la différenciation Th1 induite par les cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse

Quantification of na&#239;ve CD4 T cell activation, proliferation, and differentiation to T helper 1 (Th1) cells is a useful way to assess the role played ...

Economical and Efficient Protocol for Isolating and Culturing Bone Marrow-derived Dendritic Cells from Mice

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method for isolating DCs primarily involves inducing bone marrow (BM) differentiation into DCs by injecting large doses (&#62;10 ng/mL) of granulocyte-macrophage colony-stimulating factor/interleukin-4 (GM-CSF/IL-4), making the procedure complex and expensive. In this protocol, using all BM cells cultured in 10 ng/mL GM-CSF/IL-4 medium, after 3-4 half-culture exchanges, up to 2.7 x 107 CD11c+ cells&#160;(DCs) per mouse (two femurs) were harvested with a purity of 80%-95%. After 10 days in culture, the expression of CD11c, CD80, and MHC II increased, whereas the number of cells decreased. The number of cells peaked after 7 days of culture. Moreover, this method only took 10 min to harvest all bone marrow cells, and a high number of DCs were obtained after 1 week of culture.

Here, we present an economical and efficient method to isolate and generate high-purity bone marrow-derived dendritic cells from mice after 7 days of culture with 10 ng/mL GM-CSF/IL-4.

Protocole économique et efficace pour isoler et cultiver des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse à partir de souris

The demand for dendritic cells (DCs) is gradually increasing as immunology research advances. However, DCs are rare in all tissues. The traditional method ...