Name: real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons
Uploaded: 2014-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 53 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons at JoVE.com

Nous tenons à remercier Yue (Pauline) Hu, Rachel Sinit pour leur assistance technique. L&#39;étude est soutenue par de subvention du NIH (PN2 EY016525) et par le financement de la recherche et du syndrome de Down Treatment Foundation et la Fondation Larry L. Hillblom.

Les interventions chirurgicales et animales sont réalisées dans le strict respect de la NIH Guide pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Toutes les expériences impliquant l&#39;utilisation d&#39;animaux sont approuvés par l&#39;UCSD institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation Comité. 1. plasmide de clonage, expression et purification de Mono-biotinylé BDNF (mBtBDNF) REMARQUE: construire pré-proBDNFavi et BirA ADNc dans le vecteur pcDNA3.1 et coexprimer dans les cellules HEK293FT 10. Purifiez mBtBDNF utilisant des billes de Ni-NTA selon la méthode précédemment publiée de la production du facteur de croissance nerveuse monobiotinylé mature et biologiquement active (mBtNGF) 10. 2 Préparation de microfluidiques Chambers Dispositif microfluidique neurone de culture permet d&#39;isoler fluidiquement axones des corps cellulaires des neurones. Assemblez chambres avec lamelles fraîchement enduites juste avant chaque dissection. Chambres microfluidiques utilisésdans ce protocole sont achetés dans le commerce (voir matériaux et la table de l&#39;équipement). Lavage à la main et réutilisés chambres achetés dans le commerce jusqu&#39;à 5-6x. <ol><li> Lavage à la main des chambres microfluidiques en 1% Alconox. Rincer trois fois avec de l&#39;eau Milli-Q pendant 30 min chacun. chambres à nouveau dans 70% d&#39;éthanol de lavage des mains. </li><li> Disposez chambres à sécher sur du parafilm dans la hotte à flux laminaire. Irradier et stériliser les deux côtés des chambres de 20 minutes sous UV. Magasin chambres stérilisée en 15 cm plat stérile scellée avec du parafilm à la température ambiante. </li><li> Placer 24 x 40 mm n ° 1 des lamelles de verre dans un récipient en verre. Tremper les lamelles de 35% de l&#39;acide chlorhydrique nuit sur un agitateur. Le jour suivant, les lamelles rincer trois fois pendant 30 minutes chacune avec de l&#39;eau. </li><li> Stériliser les lamelles couvre-objet, un par un en trempant chaque lamelle couvre-objet dans de l&#39;éthanol à 100% et plus de flammes d&#39;un brûleur Bunsen. Rangez les lamelles sèches dans une boîte de Pétri stérile et le laisser à température ambiante jusqu&#39;à ce que le revêtement. </li><li> Poser oust les lamelles dans une boîte de culture de 15 cm. Manteau de chaque lamelle avec 0,7 ml de 0,01% de poly-L-lysine (PLL) et incuber à la hotte à température ambiante. </li><li> Après 1 heure, rincez les lamelles à trois reprises avec de l&#39;eau stérile. Lamelles sèches avec vide et le lieu de chaque lamelle dans une boîte de culture de 6 cm. </li><li> Pour assembler la chambre microfluidique, placez la chambre à côté microsillon en bas sur la lamelle enduit PLL avec prudence pour ne pas toucher les microsillons. Doucement pressé vers le bas dans la chambre avec une pointe de pipette afin d&#39;assurer la chambre est hermétiquement scellée. </li></ol> 3. Dissection neuronale Culture et plaque sur les chambres <ol><li> Placez deux hippocampes E17-E18 rat (un cerveau) disséqués dans un tube conique de 15 ml contenant 2 ml de tampon de dissection (HBSS, sans calcium, pas de magnésium, avec 1% stylo / angine et HEPES 10 mM. Rincer les tissus 3x avec 5 ml dissection tampon à chaque fois. Retirez le tampon de dissection autant que possible et ajouter 900 ul de di fraisssection tampon. </li><li> Pour digérer le tissu, ajouter 100 pl de 10x la trypsine (2,5%) dans le tampon de dissection à faire 1x concentration de travail. Placer le tube conique dans un bain d&#39;eau à 37 C °. Après 10 minutes de digestion, ajouter 100 ul de 10 mg / ml de DNase I à une concentration finale d&#39;environ 1 mg / ml. </li><li> En utilisant une pipette en verre de Pasteur polie au feu, triturer doucement les tissus par aspiration et refoulement 5-10x. Juste après trituration, étancher la trypsine avec 2 ml de placage milieu Neurobasal (avec 10% de FBS, 2 mM de Glutamax, 2% de B27). </li><li> Laisser l&#39;échantillon dans la hotte pendant 5 minutes pour permettre à tous les débris des tissus de s&#39;installer au fond. Retirez délicatement 2 ml de surnageant dans un tube de 15 ml conique stérile et centrifuger à 200 g pendant 5 min pour sédimenter les cellules. Reprendre le culot dans 50 ul placage médias </li><li> Compter les cellules avec un hémocytomètre. Charge de 15 à 20 ul de suspension cellulaire (~ 40 000 cellules) dans un compartiment de la chambre microfluidique. Placer la chambredans l&#39;incubateur pendant 10 min pour permettre aux cellules de se fixer à la lamelle. Après 10 min, ajouter des médias plus placage de remplir les deux compartiments de la chambre. </li><li> Le deuxième jour de la dissection, remplacer complètement les milieux d&#39;étalement avec support de maintien (Neurobasal avec Glutamax 2 mM, 2% de B27) à la fois dans le corps de la cellule et le compartiment de l&#39;axone. Les axones des neurones de l&#39;hippocampe commencent à traverser les microsillons dans les jours 3 et atteindre le compartiment axone entre le jour 5-7. Au cours de cette période de temps, remplacer la moitié du milieu de culture avec des milieux d&#39;entretien frais tous les 24 ~ 48 h. </li></ol> 4. axonale Transport de QD-BDNF <ol><li> Avant de vivre l&#39;imagerie de QD-BDNF transport axonal, épuiser BDNF à la fois du corps cellulaire et l&#39;axone compartiments de la chambre microfluidique par rincer soigneusement les deux compartiments avec BDNF-libres, du milieu sans sérum Neurobasal toutes les 30 min pendant 2 h. </li><li> Au cours de BDNF épuisement, préparer les conjugués QD-BDNF. Mélanger 50 nM de mono-biotinylé BDNF dimère avec 50 nM conjugués QD655-streptavidine dans les médias Neurobasal et incuber sur de la glace pendant 60 min. </li><li> Retirez le support dans le compartiment axone et ajouter 300 ul QD-BDNF avec une concentration finale de 0,25 nM pendant 4 heures à 37 ° C. Pour réduire au minimum le diffuseur de QD-BDNF dans le compartiment du corps de la cellule, il est très important de maintenir toujours un niveau supérieur de support dans le compartiment du corps de la cellule que dans le compartiment de l&#39;axone. Laver non lié QD-BDNF après incubation avant l&#39;imagerie en direct. </li><li> Faire de l&#39;imagerie en temps réel des transports QD-BDNF l&#39;aide d&#39;un microscope inversé équipé d&#39;une huile 100X objectif. Chauffer le cadre et la chambre de l&#39;environnement qui s&#39;y rattachent à une température constante (37 ° C) et CO 2 (5%). Utilisez un ensemble de Texas cubes rouge d&#39;excitation / émission de visualiser le signal de QD655. </li><li> Acquérir et capturer des images en accéléré dans les axones moyen à la vitesse de 1 image / s pour un total de 2 min à l&#39;aide d&#39;une caméra CCD. Utilisez microsillons sans axones that n&#39;ont pas QD et donc aucun signal de contrôle pour l&#39;infiltration. </li><li> Analyser le transport du BDNF utilisant n&#39;importe quel logiciel d&#39;analyse d&#39;image ou NIH ImageJ. </li></ol>

<ol>
	<li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+dynein-microtubule+network+is+required+for+NGF+signaling+through+the+Rap1/MAPK+pathway.">A functional dynein-microtubule network is required for NGF signaling through the Rap1/MAPK pathway.</a> Traffic. 8, 1503-1520 (2007).</li><li>Wortzel, I., Seger, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ERK+Cascade:+Distinct+Functions+within+Various+Subcellular+Organelles.">The ERK Cascade: Distinct Functions within Various Subcellular Organelles.</a> Genes &amp; cancer. 2, 195-209 (2011).</li><li>Huang, E. J., Reichardt, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trk+receptors:+roles+in+neuronal+signal+transduction.">Trk receptors: roles in neuronal signal transduction.</a> Annual review of biochemistry. 72, 609-642 (2003).</li><li>Nonomura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+and+survival+effects+of+BDNF+and+NT-3+on+cultured+cerebellar+granule+cells.">Signaling pathways and survival effects of BDNF and NT-3 on cultured cerebellar granule cells.</a> Brain research. Developmental brain research. 97, 42-50 (1996).</li><li>Weissmiller, A. M., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+advances+in+using+neurotrophic+factors+to+treat+neurodegenerative+disorders.">Current advances in using neurotrophic factors to treat neurodegenerative disorders.</a> Translational neurodegeneration. 1, 14 (2012).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+axonal+transport+of+Rab7+GTPase+results+in+dysregulated+trophic+signaling.">Defective axonal transport of Rab7 GTPase results in dysregulated trophic signaling.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 33, 7451-7462 (2013).</li><li>Taylor, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+microfluidic+culture+platform+for+CNS+axonal+injury,+regeneration+and+transport.">A microfluidic culture platform for CNS axonal injury, regeneration and transport.</a> Nature methods. 2, 599-605 (2005).</li><li>Cui, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+at+a+time,+live+tracking+of+NGF+axonal+transport+using+quantum+dots.">One at a time, live tracking of NGF axonal transport using quantum dots.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 13666-13671 (2007).</li><li>Xie, W., Zhang, K., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+and+axonal+transport+of+quantum+dot+labeled+BDNF.">Functional characterization and axonal transport of quantum dot labeled BDNF.</a> Integrative biology : quantitative biosciences from nano to macro. 4, 953-960 (2012).</li><li>Sung, K., Maloney, M. T., Yang, J., Wu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+producing+mono-biotinylated,+biologically+active+neurotrophic+factors:+an+essential+reagent+for+single+molecule+study+of+axonal+transport.">A novel method for producing mono-biotinylated, biologically active neurotrophic factors: an essential reagent for single molecule study of axonal transport.</a> Journal of neuroscience methods. 200, 121-128 (2011).</li><li>Tani, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trafficking+of+a+ligand-receptor+complex+on+the+growth+cones+as+an+essential+step+for+the+uptake+of+nerve+growth+factor+at+the+distal+end+of+the+axon:+a+single-molecule+analysis.">Trafficking of a ligand-receptor complex on the growth cones as an essential step for the uptake of nerve growth factor at the distal end of the axon: a single-molecule analysis.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 2181-2191 (2005).</li><li>Bronfman, F. C., Tcherpakov, M., Jovin, T. M., Fainzilber, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ligand-induced+internalization+of+the+p75+neurotrophin+receptor:+a+slow+route+to+the+signaling+endosome.">Ligand-induced internalization of the p75 neurotrophin receptor: a slow route to the signaling endosome.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 3209-3220 (2003).</li><li>Kruttgen, A., Heymach, J. V., Kahle, P. J., Shooter, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+nerve+growth+factor+carboxyl+terminus+in+receptor+binding+and+conformational+stability.">The role of the nerve growth factor carboxyl terminus in receptor binding and conformational stability.</a> The Journal of biological chemistry. 272, 29222-29228 (1997).</li><li>Zuccato, C., Cattaneo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+in+neurodegenerative+diseases.">Brain-derived neurotrophic factor in neurodegenerative diseases.</a> Nature reviews. Neurology. 5, 311-322 (2009).</li><li>Gharami, K., Xie, Y., An, J. J., Tonegawa, S., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor+over-expression+in+the+forebrain+ameliorates+Huntington's+disease+phenotypes+in+mice.">Brain-derived neurotrophic factor over-expression in the forebrain ameliorates Huntington's disease phenotypes in mice.</a> Journal of neurochemistry. 105, 369-379 (2008).</li><li>Gauthier, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Huntingtin+controls+neurotrophic+support+and+survival+of+neurons+by+enhancing+BDNF+vesicular+transport+along+microtubules.">Huntingtin controls neurotrophic support and survival of neurons by enhancing BDNF vesicular transport along microtubules.</a> Cell. 118, 127-138 (2004).</li><li>Her, L. S., Goldstein, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+sensitivity+of+striatal+neurons+to+axonal+transport+defects+induced+by+mutant+huntingtin.">Enhanced sensitivity of striatal neurons to axonal transport defects induced by mutant huntingtin.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 28, 13662-13672 (2008).</li><li>Rong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intracellular+trafficking+of+huntingtin-associated+protein-1+is+critical+for+TrkA+protein+levels+and+neurite+outgrowth.">Regulation of intracellular trafficking of huntingtin-associated protein-1 is critical for TrkA protein levels and neurite outgrowth.</a> The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 26, 6019-6030 (2006).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

Dans cette étude, nous rapportons le développement d&#39;une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. En conjuguant la protéine de quantum dot de la streptavidine, et en utilisant une chambre microfluidique, le procédé permet de détecter le transport axonal de BDNF dans les neurones primaires avec sensibilité molécule unique, en temps réel et avec une résolution spatiale et temporelle. Les outils utili...

Les neurones sont des cellules dont la très processus long et souvent très élaborés sont fondamentales pour établir et maintenir la structure et la fonction des circuits neuronaux polarisés. L&#39;axone joue un rôle essentiel dans le transport de cargaisons à destination et à partir de synapses. Les protéines et organites synthétisés dans le corps cellulaire doivent être transportés à travers les axones pour atteindre la terminaison présynaptique pour soutenir la fonction neuronale. De même, les signaux reçus à axones distaux doivent être transduites et transmis au soma. Ces processus sont essentiels pour la survie neuronale, la différenciation et la maintenance. Dans ce transport axonal dans certains neurones doit être effectuée sur des distances de plus de 1 000 fois le diamètre du corps de la cellule, la possibilité est envisagée facilement que même de petites déficits pourraient avoir une incidence nettement la fonction neuronale et circuit. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), un membre de la famille des neurotrophines de facteurs de croissance, est présent en marégions du cerveau ny, y compris l&#39;hippocampe, le cortex cérébral, et cerveau antérieur basal. BDNF joue un rôle crucial dans la cognition et la mémoire formation en soutenant la survie, la différenciation et la fonction des neurones qui participent à des circuits cognitifs. BDNF se lie à son récepteur, le TrkB tyrosine kinase, à la terminaison axonale où il active les voies de signalisation TrkB médiée dont le mitogène protéine kinase activée / extracellulaire de la protéine kinase régulée par un signal (MAPK / ERK), le phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) et la phospholipase C-gamma (PLCy). Les protéines qui participent à ces voies de signalisation sont conditionnés sur des structures vésiculaires endocytose pour former l&#39;endosome 1-6, qui sont ensuite transportées de façon rétrograde vers le soma neuronal signalisation BDNF / TrkB. La chambre de culture microfluidique est une plate-forme très utile pour étudier la biologie des axones dans les conditions normales, ainsi que dans le cadre des lésions et des maladies 7,8. Par isoler les axonesde corps cellulaires, le dispositif a permis d&#39;étudier un transport spécifiquement dans les axones 8-10. Les plates-formes microfluidiques PDMS base avec 450 um barrières microsillons utilisées dans cette étude ont été achetés dans le commerce (voir le tableau des matériaux). Pour d&#39;étudier le transport du BDNF, nous avons développé une nouvelle technologie pour produire monobiotinylé BDNF (mBtBDNF). Nous avons profité du peptide biotine accepteur, AP (également connu sous le nom AviTag). Il s&#39;agit d&#39;une séquence d&#39;acides 15 aminés qui contient un résidu de lysine qui peut être spécifiquement lié à un par la biotine ligase coli Escherichia enzyme biotine, BirA. Nous avons fusionné la AviTag à l&#39;extrémité C-terminale de la souris pré-proBDNF ADNc par PCR (figure 1A). La construction a été clonée dans le vecteur d&#39;expression de mammifère, pcDNA3.1-myc son vecteur. Nous avons également cloné l&#39;ADN BirA bactérienne dans le pCDNA3.1 myc son vecteur. Les deux plasmides ont été transitoirement co-transfectées dans des cellules HEK293FT d&#39;exprimer les deux protéines. BirA catalysé la ligature de Bioten particulier de la lysine résident dans le AviTag à l&#39;extrémité C-terminale de BDNF dans un rapport de 1: 1 pour produire monobiotinylé monomère BDNF. Biotinylé, BDNF matures avec une masse moléculaire de ~ 18 kDa a été récupéré et purifié à partir du support à l&#39;aide de résine Ni-(Figure 1C). La biotinylation du BDNF a été terminée, comme jugé par l&#39;incapacité à détecter BDNF non modifié par immunoblot (Figure 1D). Streptavidine points quantiques conjugués, QD 655, ont été utilisés pour étiqueter mBtBDNF faire QD-BDNF. La présence de la AviTag n&#39;interfère pas avec l&#39;activité de BDNF comme le mBtBDNF était capable d&#39;activer TrkB phosphorylée (figure 1E) et de stimuler la croissance des neurites (figure 1F), dans la mesure du BDNF humain recombinant (rhBDNF). Immunocoloration montré que QD-BDNF colocalisé avec TrkB dans les axones de l&#39;hippocampe, ce qui indique que QD-BDNF est bioactif (figure 1G). Pour étudier le transport du BDNF, QD-BDNF a été ajouté à distale compartiment axone d&#39;cultures microfluidiques contenant rat E18 neurones de l&#39;hippocampe (figure 2A). QD-BDNF transport rétrograde dans les axones a été capturé par imagerie en temps réel en direct de l&#39;étiquette fluorescente rouge (Soutien vidéos de S1, S2). En analysant le produit kymographe, QD-BDNF a été observée pour être transportée de manière rétrograde, à une vitesse de l&#39;ordre de 1,06 um / sec (figure 3A) en mouvement. GFP ou mCherry étiqueté BDNF ont été utilisés pour suivre le mouvement des axones de BDNF. Les principaux inconvénients sont qu&#39;ils ne sont pas assez brillant pour les études de molécules uniques. En outre, la présence à la fois antérograde et rétrograde BDNF mouvements, il est difficile d&#39;évaluer si oui ou non le BDNF a été transportée de manière rétrograde dans un complexe neurotrophine / récepteur. Dans cette vidéo, nous démontrons les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires. Le ultrabrightness et une excellente photostabilité de points quantiques makes permettant d&#39;effectuer un suivi à long terme du transport du BDNF. Ces techniques peuvent être exploitées pour améliorer les études de la fonction axonale dans AD, HD, et d&#39;autres maladies neurodégénératives.

<table><tbody><tr><td>Platinum pfx DNA polymerase&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11708021</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0274</td><td></td></tr><tr><td>BamHI&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>FD0054</td><td></td></tr><tr><td>HEK293FT cells</td><td>Invitrogen</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-high glucose media</td><td>Mediatech</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>D-biotin&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>TurboFect&amp;nbsp;</td><td>Fermentas</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma</td><td>A6279</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resins</td><td>Qiagen</td><td>30250</td><td></td></tr><tr><td>Protease inhibitors cocktail</td><td>Sigma</td><td>&amp;nbsp;S8820</td><td></td></tr><tr><td>Silver staining kit&amp;nbsp;</td><td>G-Biosciences</td><td>786-30</td><td></td></tr><tr><td>Human recombinant BDNF</td><td>Genentech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidic chambers</td><td>Xona</td><td>SND450</td><td></td></tr><tr><td>24 x 40 mm No. 1 glass coverslips&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>48393-060</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine&amp;nbsp;</td><td>Cultrex</td><td>3438-100-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14185-052</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Gibco</td><td>15090-046</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>B27&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>QD655-streptavidin conjugates</td><td>Invitrogen</td><td>&amp;nbsp;Q10121MP</td><td></td></tr><tr><td>anti-Avi tag antibody</td><td>GenScript</td><td>A00674</td><td></td></tr><tr><td>streptavidin-agarose beads&amp;nbsp;</td><td>Life Technology</td><td>&amp;nbsp;SA100-04</td><td></td></tr><tr><td>Trichloroacetic acid</td><td>Sigma</td><td>T6399</td><td></td></tr><tr><td>HRP-streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>N100</td><td></td></tr><tr><td>anti-pTrkB antibody</td><td>a generous gift from Dr M. Chao of NYU</td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-TrkB antibody</td><td>BD Science</td><td>610101</td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of axonal transport of quantum dot-labeled bdnf in primary neurons

BDNF joue un rôle important dans plusieurs aspects de la survie neuronale, la différenciation et la fonction. Les déficits structurels et fonctionnels dans les axones sont de plus en plus considérés comme une caractéristique précoce des maladies neurodégénératives, dont la maladie d&#39;Alzheimer (MA) et la maladie de Huntington (HD). Ne sait pas encore, c&#39;est le mécanisme (s) par lequel des lésions axonales est induite. Nous avons signalé le développement d&#39;une nouvelle technique pour produire biologiquement active, monobiotinylé BDNF (mBtBDNF) qui peut être utilisé pour tracer le transport axonal de BDNF. Quantum dot marqué BDNF (QD-BDNF) a été produit par la conjugaison de points quantiques 655 à mBtBDNF. Un dispositif microfluidique a été utilisé pour isoler les axones des corps cellulaires des neurones. Ajout de QD-BDNF dans le compartiment axonal permis imagerie en temps réel du transport du BDNF dans les axones. Nous avons démontré que QD-BDNF déplacé essentiellement exclusivement rétrograde, avec très peu de pauses, à une vitesse de l&#39;ordre de 1,06 um / s en mouvement. Ce système peut être utilisé pour enquêter sur moicanismes de la fonction axonale perturbé dans AD ou HD, ainsi que d&#39;autres maladies dégénératives.

Production et purification de biologiquement active BDNF Mono-biotinylé Le vecteur d&#39;expression de BDNF fusionnée avec une séquence AviTag (GGGLNDIFEAQKIEWHE) a été réalisé selon un protocole précédemment publié 10. La masse moléculaire de la protéine de fusion pleine longueur a été prévue pour être ~ 32 kDa ( <a href="http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html" target="_blank">http://ca.expasy.org/tools/pi_tool.html</a> ) monobiotinylé BDNF mûr avec une masse m...

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons at JoVE.com

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Le transport axonal de BDNF, un facteur neurotrophique, est essentiel pour la survie et la fonction de plusieurs populations neuronales. Certaines maladies dégénératives sont marqués par la rupture de la structure et de la fonction axonale. Nous avons démontré les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires.

Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

real-time-imaging-axonal-transport-quantum-dot-labeled-bdnf-primary

Research

JoVE Journal

Neuroscience

15.1K vues.  University of California, San Diego.  Le transport axonal de BDNF, un facteur neurotrophique, est essentiel pour la survie et la fonction de plusieurs populations neuronales. Certaines maladies dégénératives sont marqués par la rupture de la structure et de la fonction axonale. Nous avons démontré les techniques utilisées pour examiner le trafic en direct de QD-BDNF dans des chambres microfluidiques utilisant neurones primaires. 

Vidéo: Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

Live Imaging of Dense-core Vesicles in Primary Cultured Hippocampal Neurons

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  Vital fluorescent probes, particularly green fluorescent protein (GFP) have revolutionized cell biology stemming from the ability to label specific intracellular compartments and cellular structures. For example, the live imaging of GFP (and its spectral variants) chimeras have allowed for a dynamic 
analysis of the cytoskeleton, organelle transport, and membrane dynamics in a multitude of organisms and cell types [1-3].  Although live imaging has become prevalent, this approach still poses many technical challenges, particularly in primary cultured neurons.  One challenge is the expression of GFP-tagged proteins in post-mitotic neurons; the other is the ability to capture fluorescent images while minimizing phototoxicity, photobleaching, 
and maintaining general cell health.  Here we provide a protocol that describes a lipid-based transfection method that yields a relatively low transfection rate (~0.5%), however is ideal for the imaging of fully polarized neurons.  A low transfection rate is essential so that single axons and dendrites can be characterized as to their orientation to the cell body to confirm directionality of transport, i.e., anterograde v. retrograde.  Our approach to imaging 
GFP expressing neurons relies on a standard wide-field fluorescent microscope outfitted with a CCD camera, image capture software, and a heated imaging chamber. We have imaged a wide variety of organelles or structures, for example, dense-core vesicles, mitochondria, growth cones, and actin without any special optics or excitation requirements other than a fluorescent light source. Additionally, spectrally-distinct, fluorescently 
labeled proteins, e.g., GFP and dsRed-tagged proteins, can be visualized near simultaneously to characterize co-transport or other coordinated cellular events.  The imaging approach described here is flexible for a variety of imaging applications and can be adopted by a laboratory for relatively little cost provided a microscope is available.

Live cell imaging is of particular utility when studying the dynamics of organelle trafficking. Here we describe a protocol for live imaging of dense-core vesicles in cultured neurons using wide-field fluorescence microscopy. This protocol is flexible and can be adapted to image other organelles such as mitochondria, endosomes, and peroxisomes.

Imagerie en temps réel du noyau dense de vésicules cultures primaires neurones de l&#39;hippocampe

Observing and characterizing dynamic cellular processes can yield important information about cellular activity that cannot be gained from static images.  ...

Recherche

Biologie

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding environment and initiate contacts with potential synaptic partners. Although the connection between dendritic branch dynamics and synaptogenesis is well established, how developmental and activity-dependent processes regulate dendritic branch dynamics is not well understood. This is partly due to the technical difficulties associated with the live imaging and quantitative analyses of these fine structures using an in vivo system. We established a method to study dendrite dynamics using Drosophila larval ventral lateral neurons (LNvs), which can be individually labeled using genetic approaches and are accessible for live imaging. Taking advantage of this system, we developed protocols to capture branch dynamics of the whole dendritic arbor of a single labeled LNv through time-lapse live imaging. We then performed post-processing to improve image quality through drift correction and deconvolution, followed by analyzing branch dynamics at the single-branch level by annotating spatial positions of all branch terminals. Lastly, we developed R scripts (Supplementary File) and specific parameters to quantify branch dynamics using the coordinate information generated by the terminal tracing. Collectively, this protocol allows us to achieve a detailed quantitative description of branch dynamics of the neuronal dendritic arbor with high temporal and spatial resolution. The methods we developed are generally applicable to sparsely labeled neurons in both in vitro and in vivo conditions.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons

Here, we describe the method we employed to image highly motile dendritic filopodia in a live preparation of the Drosophila larval brain, and the protocol we developed to quantify time-lapse 3D imaging datasets for quantitative assessments of dendrite dynamics in developing neurons.

Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-lapse Live Imaging and Quantification of Fast Dendritic Branch Dynamics in Developing Drosophila Neurons Time-

Highly motile dendritic filopodia are widely present in neurons at early developmental stages. These exploratory dynamic branches sample the surrounding ...

Neurosciences

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

An Improved Protocol to Purify and Directly Mono-Biotinylate Recombinant BDNF in a Tube for Cellular Trafficking Studies in Neurons

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A reproducible protocol was developed to directly&#160;mono-biotinylate BDNFAvi with the enzyme BirA in a tube. In this reaction, mono-biotinylated BDNFAvi retains its biological activity.
Neurotrophins are target-derived growth factors playing a role in neuronal development and maintenance. They require rapid transport mechanisms along the endocytic pathway to allow long-distance signaling between different neuronal compartments. The development of molecular tools to study the trafficking of neurotrophins has enabled the precise tracking of these proteins in the cell using in vivo recording. In this protocol, we developed an optimized and cost-effective procedure for the production of mono-biotinylated BDNF. A recombinant BDNF variant containing a biotinylable avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in the microgram range and then purified in an easily scalable procedure using affinity chromatography. The purified BDNF can then be homogeneously mono-biotinylated by a direct in vitro reaction with the enzyme BirA in a tube. The biological activity of the mono-biotinylated BDNF (mbtBDNF) can be conjugated to streptavidin-conjugated to different fluorophores. BDNFAvi and mbtBDNF retain their biological activity demonstrated through the detection of downstream phosphorylated targets using western blot and activation of the transcription factor CREB, respectively. Using streptavidin-quantum dots, we were able to visualize mbtBDNF internalization concomitant with activation of CREB, which was detected with a phospho-CREB specific antibody. In addition, mbtBDNF conjugated to streptavidin-quantum dots was suitable for retrograde transport analysis in cortical neurons grown in microfluidic chambers. Thus, in tube produced mbtBDNF is a reliable tool to study physiological signaling endosome dynamics and trafficking in neurons.

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells in a cost-effective manner and is purified by affinity chromatography. BDNFavi is then directly mono-biotinylated with the enzyme BirA in a tube. BDNFavi and mono-biotinylated BDNFavi retain their biological activity when compared to commercially available BDNF.

Un protocole amélioré pour purifier et directement mono-biotinylate recombinant BDNF dans un tube pour les études de trafic cellulaire dans les neurones

Recombinant BDNF containing an Avi sequence (BDNFAvi) is produced in HEK293 cells and then cost-effectively purified by affinity chromatography. A ...

Imaging and Analysis of Neurofilament Transport in Excised Mouse Tibial Nerve

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study of this movement in situ was only possible using radioisotopic pulse-labeling, which permits analysis of axonal transport in whole nerves with a temporal resolution of days and a spatial resolution of millimeters. To study neurofilament transport in situ with higher temporal and spatial resolution, we developed a hThy1-paGFP-NFM transgenic mouse that expresses neurofilament protein M tagged with photoactivatable GFP in neurons. Here we describe fluorescence photoactivation pulse-escape and pulse-spread methods to analyze neurofilament transport in single myelinated axons of tibial nerves from these mice ex vivo. Isolated nerve segments are maintained on the microscope stage by perfusion with oxygenated saline and imaged by spinning disk confocal fluorescence microscopy. Violet light is used to activate the fluorescence in a short axonal window. The fluorescence in the activated and flanking regions is analyzed over time, permitting the study of neurofilament transport with temporal and spatial resolution on the order of minutes&#160;and microns, respectively. Mathematical modeling can be used to extract kinetic parameters of neurofilament transport including the velocity, directional bias and pausing behavior from the resulting data. The pulse-escape and pulse-spread methods can also be adapted to visualize neurofilament transport in other nerves. With the development of additional transgenic mice, these methods could also be used to image and analyze the axonal transport of other cytoskeletal and cytosolic proteins in axons.

We describe fluorescence photoactivation methods to analyze the axonal transport of neurofilaments in single myelinated axons of peripheral nerves from transgenic mice that express a photoactivatable neurofilament protein.

Imagerie et analyse du transport neurofilament dans le nerf tibial de souris excisée

Neurofilament protein polymers move along axons in the slow component of axonal transport at average speeds of ~0.35-3.5 mm/day. Until recently the study ...

Time-Lapse Imaging of Neuronal Arborization using Sparse Adeno-Associated Virus Labeling of Genetically Targeted Retinal Cell Populations

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a powerful model system for the investigation of cell type-specific mechanisms of neuronal morphogenesis and connectivity. The organization and composition of retinal subtypes are well-defined, and genetic tools are available to access specific types during development. Many retinal cell types also constrain their dendrites and/or axons to narrow layers, which facilitates time-lapse imaging. Mouse retina explant cultures are well suited for live-cell imaging using confocal or multiphoton microscopy, but methods optimized for imaging dendrite dynamics with temporal and structural resolution are lacking. Presented here is a method to sparsely label and image the development of specific retinal populations marked by the Cre-Lox system. Commercially available adeno-associated viruses (AAVs) used here expressed membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner. Intraocular delivery of AAVs in neonatal mice produces fluorescent labeling of targeted cell types by 4-5 days post-injection (dpi). The membrane fluorescent signals are detectable by confocal imaging and resolve fine branch structures and dynamics. High-quality videos spanning 2-4 h are acquired from imaging retinal flat-mounts perfused with oxygenated artificial cerebrospinal fluid (aCSF). Also provided is an image postprocessing pipeline for deconvolution and three-dimensional (3D) drift correction. This protocol can be used to capture several cellular behaviors in the intact retina and to identify novel factors controlling neurite morphogenesis. Many developmental strategies learned in the retina will be relevant for understanding the formation of neural circuits elsewhere in the central nervous system.

Here, we present a method for investigating neurite morphogenesis in postnatal mouse retinal explants by time-lapse confocal microscopy. We describe an approach for sparse labeling and acquisition of retinal cell types and their fine processes using recombinant adeno-associated virus vectors that express membrane-targeted fluorescent proteins in a Cre-dependent manner.

Imagerie en accéléré de l’arborisation neuronale à l’aide du marquage clairsemé du virus adéno-associé à des populations de cellules rétiniennes génétiquement ciblées

Discovering mechanisms that pattern dendritic arbors requires methods to visualize, image, and analyze dendrites during development. The mouse retina is a ...

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal transport have devastating consequences for individual neurons and their networks, and contribute to a plethora of neurological disorders. As many of these conditions involve both cell autonomous and non-autonomous mechanisms, and often display a spectrum of pathology across neuronal subtypes, methods to accurately identify and analyze neuronal subsets are imperative.
This paper details protocols to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria in sciatic nerves of anesthetized mice. Stepwise instructions are provided to 1) distinguish motor from sensory neurons in vivo, in situ, and ex vivo by using mice that selectively express fluorescent proteins within cholinergic motor neurons; and 2) separately or concurrently assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria. These complementary intravital approaches facilitate the simultaneous imaging of different cargoes in distinct peripheral nerve axons to quantitatively monitor axonal transport in health and disease.

Expanding the Toolkit for In Vivo Imaging of Axonal Transport

Using transgenic fluorescent mice, detailed protocols are described to assess in vivo axonal transport of signaling endosomes and mitochondria within motor and sensory axons of the intact sciatic nerve in live animals.

Élargir la boîte à outils pour l’imagerie in vivo du transport axonal

Axonal transport maintains neuronal homeostasis by enabling the bidirectional trafficking of diverse organelles and cargoes. Disruptions in axonal ...

Measuring Axonal Cargo Transport in Mouse Primary Cortical Cultured Neurons

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient bidirectional transport by motor proteins. Various reports have suggested that defects in axonal transport are associated with neurodegenerative diseases. Also, the mechanism of the coordination of multiple motor proteins has been an attractive topic. Since the axon has uni-directional microtubules, it is easier to determine which motor proteins are involved in the movement. Therefore, understanding the mechanisms underlying the transport of axonal cargo is crucial for uncovering the molecular mechanism of neurodegenerative diseases and the regulation of motor proteins. Here, we introduce the entire process of axonal transport analysis, including the culturing of mouse primary cortical neurons, transfection of plasmids encoding cargo proteins, and directional and velocity analyses without the effect of pauses. Furthermore, the open-access software "KYMOMAKER" is introduced, which enables the generation of a kymograph to highlight transport traces according to their direction and allow easier visualization of axonal transport.

The present protocol describes the whole procedure of analysis for axonal transport. In particular, the calculation of transport velocity, not including the pausing, and the visualization method using open-access software "KYMOMAKER" are shown here.

Neuronal cells are highly polarized cells that stereotypically harbor several dendrites and an axon. The length of an axon necessitates efficient ...

<meta charset="utf8"></head><body>Visualisation des protéines dans les neurones primaires de l’hippocampe par imagerie de cellules vivantes

Using Live&#45;Cell Imaging to Measure the Effects of Pathological Proteins on Axonal Transport in Primary Hippocampal Neurons

Bidirectional transport of cargos along the axon is critical for maintaining functional synapses, neural connectivity, and healthy neurons. Axonal transport is disrupted in multiple neurodegenerative diseases, and projection neurons are particularly vulnerable because of the need to transport cellular materials over long distances and sustain substantial axonal mass. Pathological modifications of several disease-related proteins negatively affect transport, including tau, amyloid-&#946;, &#945;-synuclein, superoxide dismutase, and huntingtin, providing a potential common mechanism by which pathological proteins exert toxicity in disease. Methods to study these toxic mechanisms are necessary to understand neurodegenerative disorders and identify potential therapeutic interventions.
Here, cultured primary rodent hippocampal neurons are co-transfected with multiple plasmids to study the effects of pathological proteins on fast axonal transport using live-cell confocal imaging of fluorescently-tagged cargo proteins. We begin with the harvest, dissociation, and culturing of primary hippocampal neurons from rodents. Then, we co-transfect the neurons with plasmid DNA constructs to express fluorescent-tagged cargo protein and wild-type or mutant tau (used as an exemplar of pathological proteins). Axons are identified in live cells using an antibody that binds an extracellular&#160;domain of neurofascin, an axon initial segment protein, and an axonal region of interest is imaged to measure fluorescent cargo transport.
Using KymoAnalyzer, a freely available ImageJ macro, we extensively characterize the velocity, pause frequency, and directional cargo density of axonal transport, all of which may be affected by the presence of pathological proteins. Through this method, we identify a phenotype of increased cargo pause frequency associated with the expression of pathological tau protein. Additionally, gene-silencing shRNA constructs can be added to the transfection mix to test the role of other proteins in mediating transport disruption. This protocol is easily adaptable for use with other neurodegenerative disease-related proteins and is a reproducible method to study the mechanisms of how those proteins disrupt axonal transport.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Comprendre l’impact des protéines pathologiques sur le transport axonal dans les maladies neurodégénératives

Here, we demonstrate how to combine transfection of primary hippocampal rodent neurons with live-cell confocal imaging to analyze pathological protein-induced effects on axonal transport and identify mechanistic pathways mediating these effects.

Utilisation de l’imagerie de cellules vivantes pour mesurer les effets de protéines pathologiques sur le transport axonal dans les neurones primaires de l’hippocampe

Imagerie en temps réel des axonale Transport de Quantum Dot marqué BDNF dans les neurones primaires

Résumé

Explorer plus de vidéos

PLAYLIST