The authors thank the DFG (Hu 997/2-2) for financial support. FS acknowledges the Hanns-Seidel-Stiftung (HSS). SKr was supported by the Elitenetzwerk Bayern in the framework of the doctorate program Material Science of Complex Interfaces. SKi thanks the SFB 863 for financial support.

REMARQUE: Voir la Figure 2 pour un aperçu du flux de traitement comprenant la préparation, l&#39;acquisition des données et d&#39;analyse de données étapes. 1. Réactif Setup REMARQUE: Tous les produits chimiques doivent être manipulés avec soin, et donc une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de protection devraient être utilisées. Toutes les opérations doivent être effectuées dans une hotte de laboratoire. En particulier, des gants spéciaux doivent être portés en cas d&#39;utilisation de chloroforme. <ol><li> Utiliser des produits chimiques avec faible teneur en eau tel que le chloroforme sèche rapidement et de stockage à sec, mais pas plus d&#39;une semaine. Stocker à la fois les produits chimiques à -20 ° C et sous atmosphère d&#39;azote ou d&#39;argon gazeux car APTES ((3-aminopropyl) triethoxysilan) (voir tableau 1) et PEG (polyéthylèneglycol) sont hygroscopiques et PEG est soumis à une oxydation à l&#39;air. </li><li> Pour éviter l&#39;exposition fréquente du stock à l&#39;oxygène atmosphérique et de l&#39;humidité, de préparer des aliquotes plus petites, idéalement au sein d&#39;un système de boîte à gants en salle et d&#39;azotere. </li></ol> 2. Installation du matériel NOTE: Pour éviter la contamination croisée, utiliser des récipients frais et propre pour chaque étape. <ol><li> Nettoyer la verrerie et des pinces dans une solution de détergent pendant 30 min dans un bain à ultrasons à 60 ° C. </li><li> Rincer et équipements de traitement par ultrasons de l&#39;étape 2.1 deux fois avec de l&#39;eau ultra-pure. </li><li> Matériel de chaleur provenant de l&#39;étape 2.1 en solution RCA (eau ultra-pure, l&#39;eau oxygénée et d&#39;ammoniaque (5: 1: 1)) à 75 ° C dans un four pendant 45 min, puis les rincer avec de l&#39;eau ultrapure. </li><li> Enfin, sécher la verrerie et pinces sous un courant d&#39;azote sec ou dans un four (100 ° C, 3 h). </li></ol> 3. Conseil fonctionnalisation REMARQUE: Utilisez une pince à épiler, navires, etc. en acier inoxydable, PTFE, verre ou tout autre matériau qui est chimiquement stable dans des solutions organiques le cas échéant. Sauf indication contraire, effectuer toutes les étapes à RT. La quantité de solution d&#39;incubation nécessaire dépend du nombre de puces en porte à faux. Assurez-vous que les leviers sont immergés dans les solutions respectives à tous les temps. REMARQUE: Utilisez une hotte pour éviter l&#39;inhalation de vapeurs organiques. <ol><li> Formation de groupes OH sur la surface de cantilever («d&#39;activation») (environ 0,5 h): <ol><li> Utilisez des pinces pour placer frites fraîches cantilever (matériel: SiN, constants de printemps: 10-100 PN / nm) sur une lame de verre propre et les mettre dans une chambre à plasma (100 W). </li><li> Évacuer chambre (~ 0,1 mbar). </li><li> chambre de Flood avec du gaz d&#39;oxygène et d&#39;évacuer à nouveau. </li><li> Activer le processus de plasma (puissance: 20%, durée: 15 min, la pression du procédé: 0,25 mbar). </li></ol></li><li> Amino-silanisation des cantilevers (environ 1 h): <ol><li> Préparer les 2,5 ml de solution APTES (voir le tableau 1) dans une boîte de Pétri en verre - le faire idéalement pendant le processus de plasma. </li><li> Immediately après le processus de plasma, chaque cantilever tremper pendant 1 sec dans de l&#39;acétone et les placer immédiatement après, dans la solution d&#39;APTES. </li><li> Incuber pendant 15 min à température ambiante. </li><li> Rincer soigneusement les copeaux de cantilever deux fois dans 10 ml d&#39;acétone et une fois dans 10 ml de chloroforme. </li><li> Finales étape facultative: puces place en porte à faux de l&#39;étape précédente sur une lame de verre propre et les faire cuire pendant 30 min à 70 ° C. Notez qu&#39;il existe également des stratégies alternatives pour l&#39;activation de surface, par exemple, le traitement UV 12. </li></ol></li><li> PEGylation (environ 2 h): REMARQUE: Effectuer les étapes 3.3.1-3.3.4 pendant amino-silanisation. NHS et groupes maléimide sont soumis à l&#39;hydrolyse en milieu aqueux et le PEG lui-même est soumis à une oxydation à l&#39;air. Par conséquent cadencement (notamment entre les étapes) est un paramètre critique. Reportez-vous à 13 pour plus d&#39;informations. <ol><li> Préparer la solution de chloroforme (voir le tableau 1). </li><li> Pour éviter la condensation, Chaleureux PEG saupoudre à TA avant d&#39;ouvrir l&#39;aliquote et en pesant le montant approprié. </li><li> Pour le couplage de polymères ou de lipides avec des groupes amino, de résoudre séparément NHS-PEG-NHS (6 kDa) et la méthyl-NHS-PEG (5 kDa) dans la solution de chloroforme en les vortexant jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient complètement résolus. Reportez-vous au tableau 1 pour les concentrations. <ol><li> Alternativement. pour le couplage de polymères avec des groupes thiol résoudre séparément Mal-NHS- PEG et PEG-méthyl-NHS dans la solution de chloroforme. </li></ol></li><li> Mélanger les solutions selon les besoins pour ajuster un certain rapport entre le nombre de NHS- ou la maleimide- et les molécules de PEG à terminaison méthyle (typiquement 1: 500). On notera que le rapport idéal doit être déterminée de manière itérative à une série de cycles de préparation-expérimentation. </li><li> Incuber puces en porte à faux dans la solution de PEG pendant 1 heure dans une atmosphère saturée en chloroforme pour empêcher l&#39;évaporation du chloroforme. </li></ol></li><li> Sonder la conjugaison molécule(&gt; 1 h): NOTE: Dans le 3.4.1-3.4.3 suivante, trois exemples pour le couplage covalent de différentes molécules de sonde à la pointe de l&#39;AFM sont décrits. Pour chaque molécule du protocole doit être ajusté. Note en outre, que dans l&#39;exemple 1 et de 3-chimie NHS est utilisé que dans l&#39;exemple 2, le polymère fonctionnalisé thiol PI- g -PS est couplé au PEG maléimide via la chimie. Pour plus de détails, voir 14. <ol><li> Pour le poly (acide aminé) le poly-D-tyrosine (40-100 kDa) <ol><li> Dissoudre le polytyrosine conjugué molécule sonde dans 1 M de NaOH. Ajuster la concentration de 1 mg / ml. </li><li> Remplacez le NaOH pour le tampon de borate de sodium (pH 8,1) en utilisant des colonnes de spin de dessalage (7 kDa MWCO) immédiatement avant la fonctionnalisation </li><li> Rincer les leviers d&#39;abord avec 5 ml de chloroforme, puis avec 5 ml d&#39;éthanol et finalement avec 5 ml de tampon borate. </li><li> Incuber les puces en porte à faux pendant 1 h dans la solution tampon de borate polytyrosine puis rincer avec un tampon borateet de l&#39;eau ultrapure. Conserver dans l&#39;eau ultra pure jusqu&#39;à la mesure. </li></ol></li><li> Pour les polymères à squelette linéaire (polyisoprène, 119 kDa) ayant des chaînes latérales greffées (polystyrène, 88 kDa) 14 <ol><li> Dissoudre le PI g -PS dans le chloroforme sec. Ajuster la concentration de la solution de conjugaison à 4 mg / ml. </li><li> Rincer les cantilevers avec 5 ml de chloroforme et incuber pendant au moins 1 heure dans la solution de conjugaison. </li><li> Rincer à nouveau dans 5 ml de chloroforme et de stocker dans le chloroforme dans un environnement saturé de chloroforme (pour éviter l&#39;évaporation du chloroforme) jusqu&#39;à ce que la mesure. </li></ol></li><li> Pour le pape lipidique <ol><li> Dissoudre PAPE dans le chloroforme sec. Ajuster la concentration à 20 mM. </li><li> Rincer les cantilevers avec 5 ml d&#39;éthanol et 5 ml d&#39;eau ultrapure avant incubation des cantilevers pendant 1 heure dans la solution lipidique. </li><li> Après incubation, rincer avec cantilevers 5 ml de chloroforme, 5 ml d&#39;éthanol et 5 ml d&#39;eau chaude ultra-pure (dans cet ordre) pour éliminer les molécules de la sonde non liée et de se débarrasser des résidus de chloroforme. Utiliser immédiatement conseils fonctionnalisés. Alternativement, les stocker dans le chloroforme jusqu&#39;à ce que nécessaire. </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig1.jpg" /> Figure 1. (A) Schéma montrant le processus de fonctionnalisation de renseignements en utilisant l&#39;exemple de la chimie NHS. Liaison (B) chimique utilisé pour fixer une molécule sonde à la pointe via un groupe amino. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig1large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 4. Préparation de Surface <ol><li> monocouche auto-assemblées (SAM) NOTE: En surface pour le premier exemple, une monocouche auto-assemblée a été choisi. Reportez-vous à la littérature 15 </sjusqu&#39;à&gt; pour plus de détails. <ol><li> Nettoyer les lames de verre avec une solution détergente, puis deux fois dans de l&#39;eau ultra pure dans un bain à ultrasons pendant 30 min chacune. Puis, comme une étape de nettoyage supplémentaire, placez-les dans la solution RCA (voir l&#39;étape 2.3) à 75 ° C pendant 15 min. </li><li> Enduire les lames avec 10 nickel chrome nm et 100 nm d&#39;or dans une coucheuse à vide. Puis stocker dans le réfrigérateur et propre à nouveau dans la solution RCA directement avant l&#39;étape suivante. </li><li> Incuber les lames de l&#39;étape précédente en solution 1-dodecanthiol / éthanol 2 mM pendant 12 heures. Les groupes thiol se lient à la surface d&#39;or et une monocouche auto assemble hydrophobe. Rincer les lames avec de l&#39;éthanol et de l&#39;eau ultra pure et sécher par un flux d&#39;azote gazeux. Confirmer le caractère hydrophobe de la surface préparée avec des mesures d&#39;angle de contact statique dans un goniomètre avec une caméra CCD 10. </li></ol></li><li> Hydrogène diamant terminé NOTE: En tant que surface pour le deuxième exemple, un diamant à terminaison hydrogène a été choisi. La préparation de surface a été réalisée comme décrit précédemment 16. </li><li> Soutenu bicouche lipidique NOTE: Dans le dernier exemple, une surface soutenue bicouche lipidique (SLB) a été utilisé comme une surface. Pour obtenir une telle surface, une solution (0,1 mg / ml) de grandes vésicules unilamellaires (LUV) consistant en phospholipide de la POPC ont été formées par le procédé d&#39;extrusion. Ensuite, 50 ul de la solution de LUV ont été placés sur une feuille de mica fraîchement clivé (A = 1 cm²) et incubées pendant 30 min. Enfin, la solution a été rincé avec 20 ml d&#39;eau ultrapure. Voir 17,18 pour une description détaillée de la préparation de SLBS. </li></ol> 5. Acquisition de données NOTE: Pour les expériences, utiliser un AFM, qui offre la possibilité de mesurer dans les liquides. Les procédures d&#39;acquisition de données et d&#39;analyse des données sont applicables indépendamment du modèle AFM utilisé. En outre, dans certaines expériences, il est avantageux d&#39;avoir la possibilité de contrôler la température dans la cellule liquide. Cantilever déviation a été détectée par le procédé de déviation du faisceau laser 19. constantes de rappel ont été déterminées par la méthode 20 de bruit thermique. <ol><li> Insérez le cantilever fonctionnalisé dans un support de cantilever AFM qui est adapté à la mesure dans des liquides. </li><li> Mettez la surface (préparation, voir ci-dessus) doit être échantillonné en l&#39;AFM et le couvrir avec du liquide. Les deux, en porte à faux et la surface devrait maintenant être immergé dans le liquide avec la pointe cantilever pointant vers la surface. A noter que dans de nombreux cas, une goutte de liquide est suffisante. Dans tous les cas, l&#39;évaporation du liquide doit être évitée, par exemple en utilisant une cellule de fluide fermé. </li><li> Le cas échéant, régler la température désirée sur le contrôleur. </li><li> Laisser le système se équilibrer pendant au moins une demi-heure. </li><li> Enregistrer un spectre de bruit thermique du cantilever avec le cantilever loin de la surface afin d&#39;exclure ne importe quelle surface effets d&#39;amortissement. Notez que généralement une0 ou plusieurs spectres doivent être accumulés pour obtenir un rapport suffisant signal-sur-bruit. </li><li> Approcher la surface. Notez que dans le but de conserver la géométrie de la buse et la buse fonctionnalisation le processus d&#39;approche doit être réalisée avec soin. Ceci peut être accompli, par exemple, se rapprochant en mode contact intermittent. </li><li> Déterminer la sensibilité optique inverse de levier (de InvOLS) mesurée en nm / volt. Pour ce faire, en poussant la pointe cantilever contre une surface dure. <ol><li> Déterminer les InvOLS en mesurant la pente de la distance de Voyage piézo contre le changement de tension de la photodiode. Monter une ligne à la partie de la courbe force-distance à laquelle la pointe cantilever est en contact avec la surface. Dans les expériences impliquant une surface molle comme bicouches lipidiques, réaliser cette étape sur les zones qui ne sont pas couverts par une bicouche lipidique (les «points défaut»). </li></ol></li><li> Déterminer la constante de ressort (pN / nm) en ajustant un oscillateur harmonique du spectre de bruit thermique. Utilisationfonction de logiciel automatisé pour le printemps volonté constante; sinon, contacter la littérature 20. </li><li> Commencez l&#39;expérience. <ol><li> Courbes force-distance de nombreux records à chaque condition expérimentale. Typiquement, utiliser les valeurs suivantes pour les paramètres expérimentaux: Taux d&#39;échantillonnage de 5 kHz, la vitesse de 1 pm / s de bout, retirer distance de 1 um. REMARQUE: Parfois, en fonction de la dynamique de l&#39;expérience étudiée, il peut être nécessaire d&#39;attendre un certain temps avec la pointe en contact avec la surface («temps de pause»). REMARQUE: les paramètres spécifiques L&#39;expérience peut se écarter sensiblement des valeurs indiquées ci-dessus. </li><li> Lors des mesures à long terme, la position zéro du laser sur la photodiode de temps à autre par le repositionnement de la photodiode. </li><li> Facultatif: Après chaque courbe de force, déplacer l&#39;AFM pointe à un autre poste de xy. </li><li> A la fin de l&#39;expérience, de déterminer la sensibilité et le ressort constant à nouveau pour vérifier la cohérence et la stabilité du système. REMARQUE: La comparaison de la constante de rappel et de la sensibilité avant et après l&#39;expérience est aussi un moyen pour se assurer que les propriétés du système et les propriétés de la pointe sont restées inchangées au cours de l&#39;expérience. Si la différence des constantes de ressort ne est pas trop grande (&lt;= 15%), ils peuvent être en moyenne, depuis le incertitude intrinsèque du printemps volonté constante est aussi autour de 15%. Pour des différences plus importantes, il est conseillé de d&#39;abord trouver et éliminer la cause de la constante de rappel apparente changer avant de poursuivre d&#39;autres expériences. </li></ol></li></ol> 6. Préparation des données NOTE: Dans cette section générale étapes de préparation de données qui sont généralement effectué indépendamment du type spécifique de l&#39;expérience pour convertir les unités Newton et nanomètre ainsi que pour corriger les données sont décrits. Les analyses de données spécifiques d&#39;expérimentation sont briefly décrite plus en détail ci-dessous dans la section des exemples représentatifs respectifs. <ol><li> Typiquement, effectuer toute la préparation des données et étapes d&#39;analyse automatiquement par un algorithme maison écrite, par exemple, basé sur le logiciel IGOR Pro 6. </li><li> Convertir le signal de déviation brut (Defl) [V] en vigueur en multipliant avec les InvOLS [nm / V] et la constante du ressort [nN / nm]. </li><li> La force de décalage de telle sorte que la force exercée sur la poutre à une distance suffisante de la surface (en porte-charge) devient 0 nN. </li><li> Calculer la position de la pointe réelle (également appelé de séparation lorsqu&#39;il est mesuré par rapport à la surface) z *, qui prend la flexion de la poutre en compte: <img alt="Equation 1" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/52456/52456eq1.jpg" /></li><li> Z * Décalage de telle sorte que z * = 0 correspond à la position z de la surface. REMARQUE: Ici, F est la force qui agit sur ​​la pointe et donc courbureest le cantilever (déterminée à l&#39;étape 6.2.), z est la position z du capteur mesurée (donnée directement par l&#39;instrument) et k représente la constante d&#39;élasticité (déterminé à l&#39;étape 5.8). </li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52456/52456fig2.jpg" /> Figure 2. organigramme du processus montrant la préparation de l&#39;échantillon, l&#39;acquisition de données et l&#39;analyse des données. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52456/52456fig2large.jpg" target="_blank">Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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S., Cwiklik, L., Jungwirth, P., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Lipid+Extraction:+The+Anchoring+Strength+of+Cholesterol+in+Liquid-Ordered+and+Liquid-Disordered+Phases.">Single Lipid Extraction: The Anchoring Strength of Cholesterol in Liquid-Ordered and Liquid-Disordered Phases.</a> Biophysical Journal. 107 (5), 1167-1175 (2014).</li><li>Horinek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide+adsorption+on+a+hydrophobic+surface+results+from+an+interplay+of+solvation,+surface,+and+intrapeptide+forces.">Peptide adsorption on a hydrophobic surface results from an interplay of solvation, surface, and intrapeptide forces.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (8), 2842-2847 (2008).</li><li>Ebner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionalization+of+probe+tips+and+supports+for+single-molecule+recognition+force+microscopy.">Functionalization of probe tips and supports for single-molecule recognition force microscopy.</a> Topics in current chemistry. 285 (April), 29-76 (2008).</li><li>Geisler, M., Balzer, B. N., Hugel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymer+Adhesion+at+the+Solid-Liquid+Interface+Probed+by+a+Single-Molecule+Force+Sensor.">Polymer Adhesion at the Solid-Liquid Interface Probed by a Single-Molecule Force Sensor.</a> Small. 5 (24), 2864-2869 (2009).</li><li>Morfill, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Affinity-matured+recombinant+antibody+fragments+analyzed+by+single-molecule+force+spectroscopy.">Affinity-matured recombinant antibody fragments analyzed by single-molecule force spectroscopy.</a> Biophysical journal. 93 (10), 3583-3590 (2007).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Durant les dernières décennies, des expériences de molécules simples ont donné un aperçu sans précédent sur les mécanismes moléculaires et se est avéré être une approche précieuse en sciences de la vie et au-delà. Pour obtenir de bons et significatives expériences statistiques de SMF, idéalement une seule et même molécule est utilisée sur toute la durée de l&#39;expérience. Contrairement aux expériences avec des ensembles de molécules, des expériences SMF sont capables de détecter des événeme...

Au cours des 30 dernières années, la microscopie à force atomique (AFM) se est avérée être une technique d&#39;imagerie précieux pour étudier biologiques 1,2 synthétiques et des matériaux et des surfaces 3, car il fournit une résolution spatiale moléculaire dans les trois dimensions et peut être utilisé dans divers solvant environnements. En outre, la force de molécule spectroscopie AFM-unique (SMFS) permet de mesurer des forces allant de la PN μN régime et a donné un aperçu sans précédent par exemple dans le repliement des protéines 4,5, la physique des polymères 6-8, et seule interaction molécule-surface 9 - 12 .La raison d&#39;étudier des molécules simples plutôt que d&#39;un ensemble de molécules est d&#39;éviter les effets qui masquent souvent des événements rares ou états moléculaires cachés moyenne. En outre, une multitude de paramètres moléculaires telles que la longueur du contour, la longueur Kuhn, l&#39;énergie libre d&#39;adhérence, etc., peuvent êtreobtenu. Ceci est détaillé dans les exemples ci-dessous. Dans une expérience typique AFM-SMFS, la molécule sonde est couplé à une pointe très fine par une molécule de liaison. L&#39;embout lui-même est situé à l&#39;extrémité d&#39;un cantilever flexible. Si l&#39;embout est mis en contact avec la surface de la molécule sonde va interagir avec cette surface. En observant la déviation du levier lors de la rétraction de la pointe, la force, et donc l&#39;énergie libre, à détacher de la molécule de la surface peut être déterminé. Pour obtenir des statistiques significatives, un grand nombre de soi-disant courbes force-distance doivent être acquises. En outre, d&#39;avoir de véritables expériences seule molécule (ce est à dire, en utilisant une seule et même molécule sonde sur la durée de l&#39;ensemble de l&#39;expérience) la molécule de la sonde doit être couplé de manière covalente à la pointe de l&#39;AFM. Ici, un protocole expérimental pour la fonctionnalisation cantilever avec une seule molécule par l&#39;intermédiaire d&#39;une liaison covalente est présentée. La seule molécule peut être soit couplé par un amino ou un thiol Groupe à la pointe de l&#39;AFM. Le procédé de conjugaison peut être effectuée dans une large variété de solvants organiques et aqueux () pour tenir compte des propriétés de solvatation des polymères utilisés. Dans la première partie, un protocole général pour fixer de manière covalente une molécule unique (&quot;molécule de sonde») via une molécule de liaison à une pointe d&#39;AFM est décrit. À cette fin, NHS- organique ou maléimide-chimie est utilisé 13. Avec le protocole de trois molécules d&#39;exemple, le processus d&#39;acquisition de données et d&#39;analyse de données sont décrites et les références de lectures complémentaires sont fournis. Les exemples de molécules sont: le (linéaire) de la tyrosine de polymère, le polymère greffé PI g -PS et la POPE lipidique. Cela inclut de légères variations du protocole, par exemple pour fixer de manière covalente cystéines. En outre, une partie est consacrée à la préparation des surfaces différentes, comme une surface de diamant, un groupe CH 3 -self-assemblé monocouche et les bicouches lipidiques. Ces interfaces ont proven être de bonnes références et des exemples.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Hellmanex III alkaline liquid concentrate (detergent solution)</td><td>Hellma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RCA (ultrapure water, hydrogen peroxide (35%), ammonia (32%); 5:1:1(v/v/v))</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectabond reagent / APTES (3-Aminopropyl)triethoxysilane</td><td>Vectorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry acetone (&amp;lt; 50 ppm H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry chloroform (&gt; 99.9%)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triethylamine</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure water</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Di-sodium tetraborate (&gt;&amp;nbsp;99.5%)</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Biochrom, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Monofunctional &amp;alpha;-methoxy-&amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;methyl-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;,&amp;omega;-bis-NHS PEG, 6&amp;nbsp;kDa, &amp;ldquo;NHS-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heterobifunctional &amp;alpha;-maleimidohexanoic- &amp;omega;-NHS PEG, 5 kDa, &amp;ldquo;Mal-PEG-NHS&amp;rdquo;</td><td>Rapp, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probe molecule (polymer, lipid, &lt;em&gt;etc.&lt;/em&gt;)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sufficient amount of glass crystallising dishes with spout (10&amp;nbsp;ml), glass Petri dishes (500 &amp;micro;l) and glass lids</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td>&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;&lt;br /&gt;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Laboratory oven model UF30</td><td>Memmert, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Temperature controlled sonicator</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasma system &quot;Femto&quot;, 100 W</td><td>Diener, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>One separate glass syringe for each organic solvent</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>VWR International GmbH, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (0.5 ml or 1.5 ml)</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipettes: 10-100 &amp;micro;l, 50-200 &amp;micro;l and 100-1,000&amp;nbsp;&amp;micro;l</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AFM with temperature controlled fluid cell (&lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MFP-3D with BioHeater)</td><td>Asylulm Research, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soft SiN cantilevers cantilever, typically made from silicon nitride (SiN) (spring constant less than 100 pN/nm, &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; MLCT)</td><td>Bruker AXS, Santa Barbara</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

investigating single molecule adhesion by atomic force spectroscopy

La spectroscopie de force atomique est un outil idéal pour étudier des molécules sur des surfaces et des interfaces. Un protocole expérimental pour coupler une grande variété de molécules simples de manière covalente sur une pointe d&#39;AFM est présenté. Dans le même temps la pointe AFM est passive pour prévenir les interactions non spécifiques entre la pointe et le substrat, qui est une condition préalable pour étudier molécules simples attachés à la pointe de l&#39;AFM. Analyses pour déterminer la force d&#39;adhérence, la longueur d&#39;adhérence, et l&#39;énergie libre de ces molécules sur des surfaces solides et bio-interfaces sont peu présentés et références externes pour davantage de lecture sont fournis. molécules d&#39;exemple sont les polytyrosine poly (acides aminés), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide (1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine). Ces molécules sont désorbés de surfaces différentes, comme CH 3 -SAMs, l&#39;hydrogène fin diamant et soutenus bicouches lipidiques dans diverses conditions de solvant. Enfin, laavantages de la force spectroscopiques expériences de molécules simples sont discutés comprenant des moyens pour décider si vraiment une seule molécule a été étudié dans l&#39;expérience.

Dans ce qui suit, les résultats décrits ci-dessus pour l&#39;exemple des molécules, à savoir la polytyrosine polymères poly (acide aminé), le polymère greffé PI g -PS et la POPE phospholipide, sont présentés. Première pour chaque exemple, expérimenter des détails spécifiques pour l&#39;acquisition des données et la préparation des données sont fournies. Ensuite, les résultats exemplaires pour des expériences où ces molécules ont été désorbé de surfaces différentes (CH 3 -SAM...

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Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

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Research

JoVE Journal

Engineering

10.3K vues.  Technische Universität München. A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

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Quantitative and Qualitative Examination of Particle-particle Interactions Using Colloidal Probe Nanoscopy

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate using the Atomic Force Microscope (AFM), can provide key insights into physical interactions present within colloidal systems. Colloidal systems are widely existent in several applications including, pharmaceuticals, foods, paints, paper, soil and minerals, detergents, printing and much more.1-3 Furthermore, colloids can exist in many states such as emulsions, foams and suspensions. Using colloidal probe nanoscopy one can obtain key information on the adhesive properties, binding energies and even gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of the colloids present within. Additionally, colloidal probe nanoscopy can be used with biological cells to aid in drug discovery and formulation development. In this paper we describe a method for conducting colloidal probe nanoscopy, discuss key factors that are important to consider during the measurement, and show that both quantitative and qualitative data that can be obtained from such measurements.

Colloidal probe nanoscopy can be used within a variety of fields to gain insight into the physical stability and coagulation kinetics of colloidal systems and aid in drug discovery and formulation sciences using biological systems. The method described within provides a quantitative and qualitative means to study such systems.

Examen quantitative et qualitative des interactions entre particules à l&#39;aide de la sonde colloïdale nanoscopie

Colloidal Probe Nanoscopy (CPN), the study of the nano-scale interactive forces between a specifically prepared colloidal probe and any chosen substrate ...

Recherche

Chimie

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood cell (RBC) as adhesion sensor and presenting cell for one of the interacting molecules. It employs micromanipulation to bring the RBC into contact with another cell that expresses the other interacting molecule with precisely controlled area and time to enable bond formation. The adhesion event is detected as RBC elongation upon pulling the two cells apart. By controlling the density of the ligands immobilized on the RBC surface, the probability of adhesion is kept in mid-range between 0 and 1. The adhesion probability is estimated from the frequency of adhesion events in a sequence of repeated contact cycles between the two cells for a given contact time. Varying the contact time generates a binding curve. Fitting a probabilistic model for receptor-ligand reaction kinetics1 to the binding curve returns the 2D affinity and off-rate.
The assay has been validated using interactions of Fc&gamma; receptors with IgG Fc1-6, selectins with glycoconjugate ligands6-9, integrins with ligands10-13, homotypical cadherin binding14, T cell receptor and coreceptor with peptide-major histocompatibility complexes15-19.
The method has been used to quantify regulations of 2D kinetics by biophysical factors, such as the membrane microtopology5, membrane anchor2, molecular orientation and length6, carrier stiffness9, curvature20, and impingement force20, as well as biochemical factors, such as modulators of the cytoskeleton and membrane microenvironment where the interacting molecules reside and the surface organization of these molecules15,17,19.
The method has also been used to study the concurrent binding of dual receptor-ligand species3,4, and trimolecular interactions19 using a modified model21.
The major advantage of the method is that it allows study of receptors in their native membrane environment. The results could be very different from those obtained using purified receptors17. It also allows study of the receptor-ligand interactions in a sub-second timescale with temporal resolution well beyond the typical biochemical methods.
To illustrate the micropipette adhesion frequency method, we show kinetics measurement of intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) functionalized on RBCs binding to integrin &alpha;L&beta;2 on neutrophils with dimeric E-selectin in the solution to activate &alpha;L&beta;2.

Adhesion Frequency Assay for In Situ Kinetics Analysis of Cross-Junctional Molecular Interactions at the Cell-Cell Interface

An adhesion frequency assay for measuring receptor-ligand interaction kinetics when both molecules are anchored on the surfaces of the interacting cells is described. This mechanically-based assay is exemplified using a micropipette-pressurized human red blood cell as adhesion sensor and integrin &alpha;L&beta;2 and intercellular adhesion molecule-1 as interacting receptors and ligands.

Essai Fréquence d&#39;adhérence pour In Situ Analyse cinétique de la Croix-jonctionnelle interactions moléculaires à l&#39;interface cellule-cellule

The micropipette adhesion assay was developed in 1998 to measure two-dimensional (2D) receptor-ligand binding kinetics1. The assay uses a human red blood ...

Bio-ingénierie

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Spectroscopie de force unique de molécules de protéines à l’aide d’un Microscope à Force atomique

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Biochimie

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and functions. It gave us the opportunity to explore a multiplicity of biophysical mechanisms, e.g., how bacterial adhesins bind to host surface receptors in more detail. Among other factors, the success of SMFS experiments depends on the functional and native immobilization of the biomolecules of interest on solid surfaces and AFM tips. Here, we describe a straightforward protocol for the covalent coupling of proteins to silicon surfaces using silane-PEG-carboxyls and the well-established N-hydroxysuccinimid/1-ethyl-3-(3-dimethyl-aminopropyl)carbodiimid (EDC/NHS) chemistry in order to explore the interaction of pilus-1 adhesin RrgA from the Gram-positive bacterium Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) with the extracellular matrix protein fibronectin (Fn). Our results show that the surface functionalization leads to a homogenous distribution of Fn on the glass surface and to an appropriate concentration of RrgA on the AFM cantilever tip, apparent by the target value of up to 20% of interaction events during SMFS measurements and revealed that RrgA binds to Fn with a mean force of 52 pN. The protocol can be adjusted to couple via site specific free thiol groups. This results in a predefined protein or molecule orientation and is suitable for other biophysical applications besides the SMFS.

This protocol describes the covalent immobilization of proteins with a heterobifunctional silane coupling agent to silicon-oxide surfaces designed for the atomic force microscopy based single molecule force spectroscopy which is exemplified by the interaction of RrgA (pilus-1 tip adhesin of S. pneumoniae) with fibronectin.

Immobilisation covalente de protéines pour la spectroscopie de Force seule molécule

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals leads to the formation of composite materials with unique properties. In addition, the undesirable process of biofouling is initiated by the adsorption of biomolecules, mainly proteins, on surfaces. This organic layer is an adhesion layer for bacteria and allows them to interact with the surface. Understanding the fundamental forces that govern the interactions at the organic-inorganic interface is therefore important for many areas of research and could lead to the design of new materials for optical, mechanical and biomedical applications. This paper demonstrates a single-molecule force spectroscopy technique that utilizes an AFM to measure the adhesion force between either peptides or amino acids and well-defined inorganic surfaces. This technique involves a protocol for attaching the biomolecule to the AFM tip through a covalent flexible linker and single-molecule force spectroscopy measurements by atomic force microscope. In addition, an analysis of these measurements is included.

Here we present a protocol to measure the force of interactions between a well-defined inorganic surface and either peptides or amino acids by single-molecule force spectroscopy measurements using an atomic force microscope (AFM). The information obtained from the measurement is important to better understand the peptide-inorganic material interphase.

Regards sur les interactions des acides aminés et Peptides avec matériaux inorganiques à l&#39;aide d&#39;une seule molécule de travail Spectroscopy

The interactions between proteins or peptides and inorganic materials lead to several interesting processes. For example, combining proteins with minerals ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Covalent Attachment of Single Molecules for AFM-based Force Spectroscopy

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and surfaces. For a true single molecule experiment, covalent attachment of the probe molecule is essential because only then can hundreds of force-extension traces with one and the same single molecule be obtained. Many traces are in turn necessary to prove that a single molecule alone is probed. Additionally, passivation is crucial for preventing unwanted interactions between the single probe molecule and the AFM cantilever tip as well as between the AFM cantilever tip and the underlying surface. The functionalization protocol presented here is reliable and can easily be applied to a variety of polymers. Characteristic single molecule events (i.e., stretches and plateaus) are detected in the force-extension traces. From these events, physical parameters such as stretching force, desorption force and desorption length can be obtained. This is particularly important for the precise investigation of stimuli-responsive systems at the single molecule level. As exemplary systems poly(ethylene glycol) (PEG), poly(N-isopropylacrylamide) (PNiPAM) and polystyrene (PS) are stretched and desorbed from SiOx (for PEG and PNiPAM) and from hydrophobic self-assembled monolayer surfaces (for PS) in aqueous environment.

Covalent attachment of probe molecules to atomic force microscopy (AFM) cantilever tips is an essential technique for the investigation of their physical properties. This allows us to determine the stretching force, desorption force and length of polymers via AFM-based single molecule force spectroscopy with high reproducibility.

Attachement covalent de molécules uniques pour la spectroscopie de force basée sur l’AFM

Atomic force microscopy (AFM)-based single molecule force spectroscopy is an ideal tool for investigating the interactions between a single polymer and ...

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Microscopie à force atomique Nanoindentation basée sur le porte-à-faux: mesures des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique dans l’air et les fluides

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Ingénierie

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Application de la microscopie de force atomique pour détecter l’arthrose précoce

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie

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