The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

NOTE: Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices éthiques institutionnels locaux. 1. Dessin de sang <ol><li> Grâce venipucture coude, de recueillir 14 tubes de sang à partir d&#39;un volontaire sain en Top Green tubes (héparine) et inverser chaque tube avant de se installer sur la glace. Prélever le sang dans les 10 à 15 min de l&#39;expérience pour assurer un rendement optimal des neutrophiles. </li></ol> 2. Isolement des neutrophiles du sang total <ol><li> Laver chaque tube vert en haut de sang avec 5 ml de PBS sans Ca et Mg à diluer le sang. Dans chacun des 4 x 50 ml tubes coniques, ajouter 15 ml de séparation de lymphocytes Media (LSM) à température ambiante. En utilisant une aiguille 18 G monté sur une seringue de 60 ml, couche attentivement le sang dilué sur la LSM, créant une interface LSM-sang forte. REMARQUE: Éviter de mélanger des couches autant que possible. </li><li> Centrifuger à 800 g pendant 30 min à 21 ° C sans interruption. NOTE: Sudden pauses peutprovoquer le mélange des différentes couches. </li><li> Observez le érythrocytes et des neutrophiles sédiments au fond. Aspirer et jeter les deux couches supérieures (plasma et LSM) en veillant à se débarrasser de l&#39;interface entre ces couches qui contient les lymphocytes et les cellules mononucléaires, ne laissant que la couche rouge en bas. </li><li> Pour chaque tube, ajouter 20 ml de tampon phosphate salin (PBS) et une solution de Dextran 20 ml de 6%. Retourner doucement chaque tube pour mélanger avec la couche d&#39;érythrocytes et des neutrophiles et laisser reposer à température ambiante pendant 30 min. NOTE: Cela permettra de globules rouges (hématies) dans les sédiments au fond. </li><li> Après 30 minutes, transférer le surnageant riche en polynucléaires neutrophiles dans des tubes frais et jeter les pastilles RBC. surnageants de centrifuger à 450 g à 4 ° C pendant 5 min. Après centrifugation, éliminer le surnageant. Le culot contient principalement des neutrophiles et quelques globules rouges. </li><li> Préparer une solution de lyse par addition de 0,5 ml de tampon de lyse pour 4,5 ml d&#39;eau stérile. Lyse reste RBC til a préparé 5 ml de solution de lyse, le transfert de tous les culots remis en suspension dans un tube. Autoriser lyse à la température ambiante dans l&#39;obscurité pendant 10 min. </li><li> Centrifuger à 450 xg à 4 ° C pendant 5 min. Rejeter le surnageant et laver culot avec 5 ml de PBS sans Ca et Mg et centrifuger à nouveau à 450 g à 4 ° C pour se débarrasser de toute solution de lyse restant. Le culot obtenu à ce stade contient les neutrophiles. Reprendre le culot dans 30 ml de froid 3% RPMI et de mettre sur la glace. NOTE: 3% RPMI est faite en complétant un milieu RPMI avec 3% de sérum fœtal bovin (FBS) </li><li> Vérifiez la pureté de l&#39;échantillon en utilisant une coloration au bleu de méthylène. &gt; 95% des cellules doit être granulocytes avec des noyaux multi-lobaires. Utilisez Trypan coloration au bleu de vérifier&gt; 95% la viabilité des cellules et compter le rendement des neutrophiles finale. Diluer neutrophiles dans la glace froide 3% du RPMI pour obtenir une concentration finale de 5 x 10 6 / ml neutrophiles. </li></ol> 3. NET Generation <ol><li> Stimuler neutrophiles avec 500 nM de PMA (par 30 ml d&#39;une solution de neutrophiles) et incuber sur un tissu plat plat 150 x 25 mm de culture de 20 mm grille pendant 4 heures à 37 ° C 5% CO 2. Cela permettra NETosis. </li><li> Après 4 heures de stimulation, aspirer délicatement et jeter les médias, laissant la couche de filets et de neutrophiles adhéré au fond. Ne pas perturber cette couche. </li><li> Utilisation d&#39;un total de 15 ml de PBS froid sans Ca et Mg par boîte, laver la partie inférieure de chaque boîte en pipetant 15 ml de PBS sur le fond de la boîte pour enlever toutes les matières adhérentes à partir du bas. </li><li> Recueillir la solution obtenue à partir de chaque boîte de lavage (étape 3.3) dans un tube conique de 15 ml et on centrifuge pendant 10 minutes à 450 xg à 4 ° C. Neutrophiles et toutes les cellules restantes seront culot au fond, laissant un riche NET surnageant acellulaire. </li><li> Diviser surnageant dans 1,5 ml tubes micro-centrifugeuse et de spin pendant 10 min à 18 000 g à 4 ° C. Cela permettra à tout l&#39;ADN à Pellet. REMARQUE: La centrifugation à plus grande tubes est plus facile et moins de temps si de telles vitesses élevées sont réalisables sur la centrifugeuse régulière, sinon devront diviser surnageants dans des tubes plus petits afin d&#39;utiliser à grande vitesse micro-centrifugeuse. </li><li> Rejeter le surnageant et remettre en suspension les culots obtenus ensemble dans du PBS froid sur glace à une concentration correspondant à 2 x 10 7 cellules neutrophiles par 100 ul de PBS. Cela donnera le stock net franco-cellule qui peut être utilisé pour des expériences ultérieures. </li><li> Mesurer la concentration d&#39;ADN dans l&#39;échantillon obtenu par spectrophotométrie ou suppléant outil de quantification de l&#39;ADN. Une concentration adéquate dans l&#39;échantillon doit être comprise entre 140 à 180 ng / ul. </li></ol> 4. NET-cancer cellule statique Essai d&#39;adhésion <ol><li> Ajouter 100 ul du stock NET précédemment obtenue par puits dans une plaque de fond bien à plat 96 et laisser manteau puits O / N à 4 ° C dans l&#39;obscurité. </li><li> Entre 12 et 20 heures plus tard, vérifier la formation d&#39;une monocouche de cellule uniformeNET gratuits au fond des puits au microscope (Figure 1). À ce stade, aspirer délicatement toutes les matières non-adhérentes sur les puits, en veillant à ne pas perturber la monocouche NET au fond. </li><li> Ajouter 100 ul de 1% de sérumalbumine bovine (BSA) une solution de blocage à chaque puits et laisser reposer pendant 1 h à température ambiante. </li><li> Détacher les cellules du cancer de la A549 à partir d&#39;un flacon T-75 à l&#39;aide de 2 ml de solution de trypsine à 0,25%. Une fois détachée, ajouter 10 ml de milieu de cellules A549 traitées à la trypsine et centrifuger à 450 xg à 4 ° C pendant 5 min. Jeter les cellules du surnageant et remettre en suspension dans un milieu pour obtenir une concentration de 2 x 10 4 cellules cancéreuses par 100 ul de médias. REMARQUE: Les cellules A549 ont été cultivées séparément. Brièvement, les cellules ont été cultivées et maintenues dans du DMEM F12 contenant 10% de FBS et 1% de pénicilline streptomycine et on incube à 37 ° C 5% CO 2. Une fois que 70 à 80% de confluence de cellules a été atteint, ils ont été détachées en utilisant 0,25% de trypsine-EDTA et remises en suspension dans le même milieudécrit ci-dessus. </li><li> cellules de cancer du CFSE par tache en utilisant l&#39;ajout d&#39;une pi de CFSE par ml de milieu et laisser tache à TA pendant 10 min. Après coloration, la centrifugeuse vers le bas à 450 xg à 4 ° C pendant 5 min puis jeter cellules surnageant et remettre en suspension dans le volume initial de médias pour obtenir une concentration de 2 x 10 4 cellules cancéreuses par 100 ul de médias. </li><li> Après 1 h de NET de blocage, doucement bloquant aspiration solution et ajouter 2 x10 4 cellules cancéreuses dans les médias, ce qui équivaut à 100 pi par puits sur la monocouche NET et laisser adhérer pendant 90 min à 37 ° C 5% de CO 2. Aspirer délicatement les cellules et ajouter 100 pi de PBS à chaque puits pour laver toutes les cellules non-adhérentes. </li><li> Dans certains puits, ajouter des 1000U DNAse1 par puits pendant 10 minutes avant de les laver à dégrader NET. Cela servira de témoin négatif. En d&#39;autres puits, ajouter 100 pl d&#39;eau stérile par puits pendant 10 min, ce qui servira de commande de véhicule (VC). NOTE: trois répétitions par condition sont généralement effectués pour augmenter la taille de l&#39;échantillon. </li><li> Aspirer et jeter toute la solution dans les puits ne laissant que NET et les cellules cancéreuses adhérentes au fond. Ajouter 100 pi de solution de formaldéhyde 4% par puits pour fixer les cellules cancéreuses adhérentes aux filets et lire dosage sous le microscope de fluorescence (Figure 1). Terrain et analyser les résultats (Figure 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1.">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA.">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs:+a+new+strategy+for+using+old+weapons.">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li><li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis.">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis.">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+NETs+in+reproduction:+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss.">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li><li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression.">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils.">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes,+granulocytes+and+macrophages.">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li><li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+hormones,+acting+on+the+TERT+gene,+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells.">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li><li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells.">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li><li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides/protamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging.">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death:+a+predominant+role+of+histones.">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

Les auteurs ne ont rien à divulguer

Le protocole d&#39;isolement de neutrophiles Piège extracellulaire démontré dans cette vidéo combine différentes techniques utilisées dans la littérature pour l&#39;isolement des neutrophiles et formation NET. Il simplifie un processus assez complexe et variable et offre un moyen très fiable et reproductible pour isoler NET sans cellules purifiées avec moins d&#39;étapes que les autres protocoles. En outre, des réactifs facilement disponibles sont employés ajoutent à la simplicité des protocoles et de réd...

Pièges extracellulaires neutrophiles (TNE) sont nouvellement découvert des éléments de neutrophiles dérivés composées de brins d&#39;ADN extracellulaire décorées par des centaines de protéines et les histones. Elles sont sécrétées par les neutrophiles dans le contexte de l&#39;infection et l&#39;inflammation suivants stimuli spécifiques et ils ont été comptabilisés initialement faire partie des mécanismes de défense de l&#39;neutrophiles contre les infections. Ils ont d&#39;abord été présentés à promouvoir le piégeage de divers envahisseurs microbiens tels que les bactéries, virus et champignons 1-3. Le piégeage du microbe serait alors conduire à sa destruction à la fois directement par les protéines de NET-associé 3,4 et indirectement par le recrutement local des cellules phagocytaires 5,6. Le rôle des filets ne semble toutefois pas être limité à défense de l&#39;hôte. Plus récemment, ils ont été montré à jouer un rôle important dans les maladies auto-immunes 7,8, 9 thrombose, des troubles liés à la grossesse 10 et même la progression du cancer11,12. En conséquence, il apparaît que les filets jouent un rôle important dans un grand nombre de divers processus physiologiques. Toutefois, étant donné le roman nature de ces recherches, il reste beaucoup à élucider ce qui concerne les mécanismes par lesquels NET exercent leurs effets. Ici, nous présentons une méthode simplifiée pour l&#39;isolement de NET en l&#39;absence de neutrophiles. Dans la vidéo suivante, nous démontrons une technique simplifiée et facile à isoler NET au sang total humain. NET sans cellules peuvent ensuite être utilisés dans un certain nombre d&#39;expériences in vitro, y compris coloration, imuunofluorescence, effaçant ainsi que d&#39;un certain nombre d&#39;analyses telles que l&#39;adhérence, la prolifération et la migration. D&#39;autres protocoles existent 13, 19, mais ils sont généralement long, complexe, coûteux, et souvent, faible rendement 13. Ce protocole simplifié utilise des réactifs de base et diminue le nombre d&#39;étapes nécessaires pour isoler les neutrophiles, ce qui réduit donc la longueur du procre tout en maximisant le rendement. Procédé suivant combine différentes techniques pour l&#39;isolement des neutrophiles décrits précédemment dans la littérature pour obtenir un protocole simple qui donne un échantillon très pur de neutrophiles vivants. Comme suggéré dans la littérature, le sang veineux est recueilli dans des tubes EDTA et utilisé dans les 10 minutes pour éviter l&#39;activation des neutrophiles 14. Nous utilisons des médias de séparation de lymphocytes (LSM) centrifugation en gradient de densité pour isoler les granulocytes et les globules rouges à partir de sang entier héparinisé, une méthode adaptée de la technique de centrifugation par densité de Ficoll initialement décrite par Boyum 15 et al. LSM est une modification de la formulation Boyum qui substitue le diatrizoate de sodium pour le métrizoate de sodium et a été utilisé avec succès dans de nombreuses études pour isoler les neutrophiles 16-18. Après centrifugation différentielle de densité, les monocytes et les lymphocytes sont rejetés; les globules rouges sont ensuite sédimentéesen utilisant une solution de dextrane à 6% et 14 les globules rouges restants sont lysées pour obtenir une population de neutrophiles purs, ce qui est vérifié au bleu Trypan et une coloration au bleu de méthylène. De nombreux agents ont été utilisés pour induire NETosis la fois in vitro et in vivo, y compris un lipopolysaccharide (LPS) et de l&#39;acétate myristate de phorbol (PMA) et les interleukines (IL-8) 3,5,6. Dans le protocole suivant, les neutrophiles isolés sont stimulés avec 500 nM de PMA pendant 4 h, ce qui a été montré être une concentration suffisante pour permettre la formation NET cohérente et fiable sans favoriser l&#39;apoptose 19,20. Après isolement, nous montrons comment NET sans cellules obtenues à partir de ce protocole peuvent être utilisés dans un test d&#39;adhérence. DNAse1 est utilisé pour digérer et dégrader NET comme décrit précédemment et sert de témoin 2,3,11 ainsi. D&#39;autres options incluent l&#39;utilisation d&#39;un inhibiteur de l&#39;élastase neutrophile (IEN) pour inhiber formati NETsur, qui est une alternative acceptable lorsque l&#39;objectif est d&#39;inhiber la formation NET plutôt que de réaliser leur dégradation 11. Bien NEi a un certain nombre de fonctions variées, il a été précédemment montré que le dépôt NET peut être inhibée par NEi par blocage de la décondensation de la chromatine, la dégranulation des neutrophiles nucléaire et la mort 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

Neutrophiles extracellulaires Pièges (EVF) ont été récemment identifiés comme faisant partie de l&#39;arsenal antimicrobienne de neutrophiles. Outre leur rôle dans la lutte contre les infections, des recherches récentes ont démontré qu&#39;ils peuvent être impliqués dans de nombreux autres processus de la maladie, y compris la progression du cancer. Isoler NET purifiés est un élément crucial pour permettre l&#39;étude de ces fonctions. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode simplifiée de l&#39;isolement de NET exempt de cellules du sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. NET isolés peuvent ensuite être utilisés pour immunofluorescence, buvard ou de divers tests fonctionnels. Cela permet une évaluation de leurs propriétés biologiques, en l&#39;absence des effets de confusion potentiels de neutrophiles eux-mêmes. Une technique de séparation en gradient de densité est utilisée pour isoler des neutrophiles à partir de sang entier de donneurs en bonne santé. Les neutrophiles isolés sont ensuite stimulées par du phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA) pour induire NETosis. Les neutrophiles activés sont ensuite rejetées, et un stock net sans cellules sont obtenues. Nous montrons ensuite comment TNE isolé peut être utilisé dans un essai d&#39;adhérence avec des cellules de cancer du poumon humain A549. Le stock net est utilisé pour recouvrir les puits d&#39;une 96 puits culture cellulaire plaque O N, et après s&#39;être assuré une formation de monocouche NET adéquate sur le fond des puits, CFSE étiquetés cellules / A549 sont ajoutés. Les cellules adhérentes sont quantifiés à l&#39;aide d&#39;un microscope à fluorescence Nikon TE300. Dans certains puits, 1000U DNAse1 est ajouté 10 min avant de compter à dégrader NET

La réalisation d&#39;un test d&#39;adhésion statique avec des filets nécessite revêtement adéquat des puits avec une monocouche de NET avant l&#39;addition des cellules cancéreuses (Figure 1). Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées avec soin de ne pas perturber cette couche. Lorsque une couche suffisante de NET est formé, on se attend à voir significative cellules cancéreuses adhérence aux filets comme on le voit dans la figure 2A et 2C. Cet ef...

Watch this Scientific Journal Video about Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling at JoVE.com

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Dans le protocole suivant, nous décrivons une façon très simple d&#39;isoler les pièges neutrophiles extracellulaires (EVF) de sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. Nous montrons ensuite comment les EVF isolées peuvent être utilisées dans un essai in vitro de l&#39;adhésion avec les cellules cancéreuses.

Simplifié droits de neutrophiles extracellulaires Piège (NET) Isolement et Manipulation

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

simplified-human-neutrophil-extracellular-traps-nets-isolation

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

29.5K vues.  McGill University.  Dans le protocole suivant, nous décrivons une façon très simple d'isoler les pièges neutrophiles extracellulaires (EVF) de sang total humain en utilisant des réactifs facilement disponibles. Nous montrons ensuite comment les EVF isolées peuvent être utilisées dans un essai in vitro de l'adhésion avec les cellules cancéreuses. 

Vidéo: Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them intracellularly when their antimicrobial granules fuse with the phagosome. We found that neutrophils have an additional way of killing microorganisms: upon activation, they release granule proteins and chromatin that together form extracellular fibers that bind pathogens. These novel structures, or Neutrophil Extracellular Traps (NETs), degrade virulence factors and kill bacteria1, fungi2 and parasites3. The structural backbone of NETs is DNA, and they are quickly degraded in the presence of DNases. Thus, bacteria expressing DNases are more virulent4. Using correlative microscopy combining TEM, SEM, immunofluorescence and live cell imaging techniques, we could show that upon stimulation, the nuclei of neutrophils lose their shape and the eu- and heterochromatin homogenize. Later, the nuclear envelope and the granule membranes disintegrate allowing the mixing of NET components. Finally, the NETs are released as the cell membrane breaks. This cell death program (NETosis) is distinct from apoptosis and necrosis and depends on the generation of Reactive Oxygen Species by NADPH oxidase5. 
Neutrophil extracellular traps are abundant at sites of acute inflammation. NETs appear to be a form of innate immune response that bind microorganisms, prevent them from spreading, and ensure a high local concentration of antimicrobial agents to degrade virulence factors and kill pathogens thus allowing neutrophils to fulfill their antimicrobial function even beyond their life span. There is increasing evidence, however, that NETs are also involved in diseases that range from auto-immune syndromes to infertility6.
We describe methods to isolate Neutrophil Granulocytes from peripheral human blood7 and stimulate them to form NETs. Also we include protocols to visualize the NETs in light and electron microscopy.

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) are an important innate immune mechanism to fight pathogenic bacteria, fungi and parasites. Here we describe methods to isolate neutrophil granulocytes from human blood and to activate them to form NETs. We present preparation techniques to visualize NETs in light and electron microscopy.

Neutrophiles pièges extracellulaires: Comment générer et de les visualiser

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Recherche

Immunologie et infection

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of lipids. The function of lipids (e.g., in host-pathogen interactions or host entry) has been reported to play a crucial role in cellular processes. Here, we show a method to determine lipid composition, with a focus on the cholesterol level of primary blood-derived neutrophils, by HPTLC in comparison to high performance liquid chromatography (HPLC). The aim was to investigate the role of lipid/cholesterol alterations in the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). NET release is known as a host defense mechanism to prevent pathogens from spreading within the host. Therefore, blood-derived human neutrophils were treated with methyl-&#946;-cyclodextrin (M&#946;CD) to induce lipid alterations in the cells. Using HPTLC and HPLC, we have shown that M&#946;CD treatment of the cells leads to lipid alterations associated with a significant reduction in the cholesterol content of the cell. At the same time, M&#946;CD treatment of the neutrophils led to the formation of NETs, as shown by immunofluorescence microscopy. In summary, here we present a detailed method to study lipid alterations in neutrophils and the formation of NETs.

Lipids are known to play an important role in cellular functions. Here, we describe a method to determine the lipid composition of neutrophils, with emphasis on the cholesterol level, by using both HPTLC and HPLC to gain a better understanding of the underlying mechanisms of neutrophil extracellular trap formation.

Méthodes d&#39;étude Les modifications lipidiques de neutrophiles et de la formation subséquente des neutrophiles pièges extracellulaires

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal microscopy methods to visualize macrophage extracellular traps (METs). These extracellular traps are defined by the presence of extracellular chromatin with co-expression of other components such as granule proteases, citrullinated histones, and peptidyl arginase deiminase (PAD). The expression of METs is generally measured after exposure to a stimulus and compared to un-stimulated samples. Samples are also included for background and isotype control. Cells are analyzed using well-defined image analysis software. Confocal microscopy may be used to define the presence of METs both in vitro and in vivo in lung tissue.

Macrophage extracellular traps are a newly described entity. This article will concentrate on confocal microscopy methods and how they are visualized in vitro and in vivo from lung samples.

Visualisation des pièges extracellulaires de Macrophage à l’aide de la microscopie confocale

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. Immunofluorescence microscopy and image-based quantification methods remain important tools to quantitate neutrophil extracellular trap formation. However, there are key limitations to the immunofluorescence-based methods that are currently available for quantifying NETs. Manual methods of image-based NET quantification are often subjective, prone to error and tedious for users, especially non-experienced users. Also, presently available software options for quantification are either semi-automatic or require training prior to operation. Here, we demonstrate the implementation of an automated immunofluorescence-based image quantification method to evaluate NET formation called NETQUANT. The software is easy to use and has a user-friendly graphical user interface (GUI). It considers biologically relevant parameters such as an increase in the surface area and DNA:NET marker protein ratio, and nuclear deformation to define NET formation. Furthermore, this tool is built as a freely available app, and allows for single-cell resolution quantification and analysis.

Here, we present a protocol for generating neutrophil extracellular traps (NETs) and operating NETQUANT, a fully automatic software option for quantification of NETs in immunofluorescence images.

Quantification automatisée basée sur l'image des pièges extracellulaires neutrophiles à l'aide de NETQUANT

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by neutrophils in response to systemic inflammation or pathogens. Although NETs have previously been shown to augment clot formation and inhibit fibrinolysis in humans and dogs, the role of NETs in cats with cardiogenic arterial thromboembolism (CATE), a life-threatening complication secondary to hypertrophic cardiomyopathy, is unknown. A standardized method to identify and quantify NETs in cardiogenic arterial thrombi in cats will advance our understanding of their pathological role in CATE. Here, we describe a technique to identify NETs in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded thrombi within the aortic bifurcation, extracted during necropsy. Following deparaffinization with xylene, aortic sections underwent indirect heat-induced antigen retrieval. Sections were then blocked, permeabilized, and ex vivo NETs were identified by colocalization of cell-free DNA (cfDNA), citrullinated histone H3 (citH3), and neutrophil elastase (NE) using immunofluorescence microscopy. To optimize the immunodetection of NETs in thrombi, autofluorescence of tissue elements was limited by using an autofluorescence quenching process prior to microscopy. This technique could be a useful tool to study NETs and thrombosis in other species and offers new insights into the pathophysiology of this complex condition.

We describe a method to identify neutrophil extracellular traps (NETs) in formaldehyde-fixed and paraffin-embedded feline cardiogenic arterial thrombi using heat-induced antigen retrieval and a double immunolabeling protocol.

Identification des pièges extracellulaires Neutrophil dans paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi à l’aide de la microscopie à l’immunofluorescence

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of neutrophil extracellular traps (NETs). This study analyzes the morphological and compositional changes in NETs induced by microbial and chemical stimuli using standardized in vitro methodologies for NET induction and characterization with human cells. The procedures described here allow the analysis of NET morphology (lytic or non-lytic) and composition (DNA-protein structures and enzymatic activity), and the effect of soluble factors or cellular contact on such characteristics. Additionally, the techniques described here could be modified to evaluate the effect of exogenous soluble factors or cellular contact on NET composition.
The applied techniques include the purification of polymorphonuclear cells from human peripheral blood using a double density gradient (1.079-1.098 g/mL), guaranteeing optimal purity and viability (&#8805; 95%) as demonstrated by Wright's staining, trypan blue exclusion, and flow cytometry, including FSC versus SSC analysis and 7AAD staining. NET formation is induced with microbial (Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, and Candida albicans) and chemical (phorbol myristate acetate, HOCl) stimuli, and the NETs are characterized by DNA-DAPI staining, immunostaining for the antimicrobial peptide cathelicidin (LL37), and quantification of enzymatic activity (neutrophil elastase, cathepsin G, and myeloperoxidase). The images are acquired through fluorescence microscopy and analyzed with ImageJ.

Presented here is a protocol for the induction and analysis of in vitro neutrophil extracellular traps (NETs). Quantification of DNA, cathelicidin (LL37), and enzyme activity yielded data that show the variability in the composition and morphology of NETs induced by microbial and chemical stimuli under similar controlled conditions.

Analyse morphologique et compositionnelle des pièges extracellulaires neutrophiles induits par des stimuli microbiens et chimiques

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures composed of DNA with granule proteins, such as myeloperoxidase (MPO) and neutrophil elastase (NE), and cytoplasmic and cytoskeletal proteins. Although interest in NETs has increased recently, no sensitive, reliable assay method is available for measuring NETs in clinical settings. This article describes a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay to quantitatively measure two components of circulating NETs, MPO-DNA and NE-DNA complexes, which are specific components of NETs and are released into the extracellular space as breakdown products of NETs. The assay uses specific monoclonal antibodies for MPO or NE as the capture antibodies and a DNA-specific detection antibody. MPO or NE binds to one site of the capture antibody during the initial incubation of samples containing MPO-DNA or NE-DNA complexes. This assay shows good linearity and high inter-assay and intra-assay precision. We used it in 16 patients with COVID-19 with accompanying acute respiratory distress syndrome and found that the plasma concentrations of MPO-DNA and NE-DNA were significantly higher than in the plasma obtained from healthy controls. This detection assay is a reliable, highly sensitive, and useful method for investigating the characteristics of NETs in human plasma and culture supernatants.

We present a protocol for a modified sandwich enzyme-linked immunosorbent assay technique to quantitatively measure two components of neutrophil extracellular trap remnants, myeloperoxidase conjugated-DNA and neutrophil elastase conjugated-DNA complexes,derived from activated neutrophils.

Quantification des complexes myéloperoxydase-ADN et neutrophile élastase-ADN à partir de pièges extracellulaires neutrophiles à l’aide d’un test ELISA sandwich modifié

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Coloration et imagerie pour visualiser les pièges extracellulaires des neutrophiles

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in autoimmune diseases and sterile inflammation. They are web-like structures composed of double-stranded DNA filaments, histones, and antimicrobial proteins. Once released, NETs can trap and kill extracellular pathogens in blood and tissue. Furthermore, NETs participate in homeostatic regulation by stimulating platelet adhesion and coagulation. However, the dysregulated production of NETs has also been associated with various diseases, including sepsis or autoimmune disorders, which makes them a promising target for therapeutic intervention. Apart from electron microscopy, visualizing NETs using immunofluorescence imaging is currently one of the only known methods to demonstrate NET interactions in tissue. Therefore, various staining methods to visualize NETs have been utilized. In the literature, different staining protocols are described, and we identified four key components showing high variability between protocols: (1) the types of antibodies used, (2) the usage of autofluorescence-reducing agents, (3) antigen retrieval methods, and (4) permeabilization. Therefore, in vitro immunofluorescence staining protocols were systemically adapted and improved in this work to make them applicable for different species (mouse, human) and tissues (skin, intestine, lung, liver, heart, spinal disc). After fixation and paraffin-embedding, 3 &#181;m thick sections were mounted onto slides. These samples were stained with primary antibodies for myeloperoxidase (MPO), citrullinated histone H3 (H3cit), and neutrophil elastase (NE) according to a modified staining protocol. The slides were stained with secondary antibodies and examined using a widefield fluorescence microscope. The results were analyzed according to an evaluation sheet, and differences were recorded semi-quantitatively.
Here, we present an optimized NET staining protocol suitable for different tissues. We used a novel primary antibody to stain for H3cit and reduced non-specific staining with an autofluorescence-reducing agent. Furthermore, we demonstrated that NET staining requires a constant high temperature and careful handling of samples.

Pleins feux sur l’auteur : Imagerie des pièges extracellulaires à neutrophiles dans les tissus humains et de souris 

Neutrophil extracellular traps (NETs) are associated with various diseases, and immunofluorescence is often used for their visualization. However, there are various staining protocols, and, in many cases, only one type of tissue is examined. Here, we establish a generally applicable protocol for staining NETs in mouse and human tissue.

Imagerie par immunofluorescence des pièges extracellulaires des neutrophiles dans les tissus humains et murins

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...