Ce protocole démontre l’hétérogénéité de la composition, de la structure et de la morphologie des pièges extracellulaires à neutrophiles, en fonction de leur stimulus induisant dans des conditions in vitro comparables chez les neutrophiles humains d’individus sains. Une pureté et une viabilité élevées des neutrophiles sont obtenues. Cela permet de comparer la concentration d’ADN, de LL-37 et l’activité enzymatique de la myéloperoxydase, de l’élastase et de la cathepsine G, libérée par les pièges extracellulaires des neutrophiles.
Ce protocole a permis d’analyser l’effet des facteurs solubles ou du contact cellulaire ou des thérapies ou mécanismes possibles pour fermer la production de TNE dans les maladies auto-immunes. Ces méthodes peuvent aider à l’investigation des maladies auto-immunes. En raison de la reproduction cellulaire incontrôlée des TNE et de la durée de l’alignement de leurs composants, qui sont considérés comme des biomarqueurs de la maladie.
La microscopie à fluorescence permet de capturer l’image des TNE montrant la dispersion de l’ADN en association avec des protéines telles que LL37, qui co-localisées avec des micro-organismes aidant à comprendre comment ils apparaissent. Pour commencer, effectuez une ponction veineuse pour recueillir 10 millilitres de sang périphérique dans des tubes contenant de l’EDTA dipotassique comme anticoagulant. Ensuite, effectuez une biométrie sanguine standard et un test de protéine C-réactive pour exclure une infection ou une inflammation afin de garantir la qualité de l’échantillon.
Centrifuger l’échantillon de sang périphérique pour éliminer le plasma riche en plaquettes, suivi d’une deuxième centrifugation et éliminer le plasma restant. Diluer l’ensemble érythrocytaire et leucocytaire résultant dans un rapport de volume un pour un avec une DPBS 1X. Ensuite, dans un tube de verre stérile de 10 millilitres, déposez d’abord un millilitre de solution de densité de 1,08 gramme par millilitre, suivi d’un millilitre de solution de densité de 1,079 gramme par millilitre.
Ensuite, ajoutez quatre millilitres de l’érythrocyte dilué et du paquet de leucocytes en versant sur les parois. Centrifuger sans accélération ni décélération pour éviter de perturber la pente. Aspirer la phase correspondant aux granulocytes et transférer dans un autre tube de verre stérile de 10 millilitres.
Laver avec quatre millilitres de 1X DPBS à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Pour éliminer les érythrocytes restants, traiter les cellules avec un choc osmotique en ajoutant quatre millilitres de solution saline à 0,2%. Incuber pendant deux minutes à quatre degrés Celsius et centrifuger.
Jeter le surnageant et ajouter quatre millilitres de solution saline à 0,65%. Incuber pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour rétablir l’intégrité de la membrane et répéter la centrifugation. Retirez le surnageant et re-suspendez les cellules dans quatre millilitres de 1X DPBS pour éliminer les débris cellulaires.
Encore une fois, centrifugez et remettez en suspension la pastille de cellule dans deux millilitres de tampon HBSS froid. Pour effectuer un test d’exclusion du bleu de trypan, diluez cinq microlitres de la suspension cellulaire dans 20 microlitres de bleu de trypan à 0,4%. Compter les cellules dans une nouvelle chambre de bower et déterminer la viabilité cellulaire à l’aide d’un test d’exclusion.
Ensuite, montez 5 microlitres de la suspension cellulaire sur une glissière et colorez avec la tache de Wright pendant 15 secondes. Fixez immédiatement l’échantillon, lavez à l’eau distillée et observez la morphologie au microscope optique. Ensuite, ajoutez une fois 10 aux cellules cinquièmes pour écouler les tubes de cytométrie et colorez avec un microlitre de 7AAD dans 100 microlitres de tampon FACS pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius dans l’obscurité.
Laver avec 500 microlitres de tampon FACS à 300 G pendant 10 minutes. Fixez les cellules avec 500 microlitres de paraformaldéhyde à 2% et stockez à quatre degrés Celsius jusqu’à l’analyse par cytométrie en flux. Pour un contrôle des cellules mortes, fixez les cellules avec 200 microlitres de paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes et lavez avec 500 microlitres de 1XPBS à 300 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius.
Jetez le surnageant et ajoutez 200 microlitres de 0,1% Triton X-100. Incuber pendant une heure à quatre degrés Celsius. Laver avec 500 microlitres de 1X PBS et teindre avec 7AAD.
Analysez les données capturées dans le logiciel de cytomètre en flux. Chargez les fichiers et double-cliquez sur le fichier neutrophile non taché. Choisissez la diffusion vers l’avant ou FSC sur l’axe X et la diffusion latérale ou SSC sur l’axe Y pour afficher la population cellulaire correspondant aux neutrophiles.
Sélectionnez ensuite le canal B3-A:PerCP vio 700-A sur l’axe X pour délimiter l’autofluorescence des cellules et choisissez l’histogramme sur l’axe Y. Ensuite, ouvrez le fichier des neutrophiles tachés. Choisissez FSC sur l’axe X et SSC sur l’axe Y pour afficher la population cellulaire correspondant aux neutrophiles.
Encore une fois, sélectionnez le canal B3-A:PerCP vio 700-A pour délimiter la population de neutrophiles positifs pour le colorant 7AAD. Générez l’histogramme final en cliquant avec le bouton droit de la souris sur la fenêtre et en sélectionnant Copier dans l’éditeur de mise en page. Ajouter des pseudohyphes bactériens ou fongiques dans des microtubes de 1,5 millilitre.
Ajoutez 200 microlitres, donc cinq micromolaires CFSC dans 1X PBS. Mélanger et incuber à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes dans l’obscurité. Arrêtez la réaction en ajoutant 500 microlitres de plasma décomplété et de centrifugeuse.
Jetez le surnageant et lavez la pastille avec un millilitre de 1XPBS avec centrifugation. Ensuite, re-suspendez les micro-organismes dans 250 microlitres de 1X PBS. Préparer 50 microlitres aliquotes dans des microtubes de 1,5 millilitre avec deux fois 10 à la septième bactérie ou deux fois 10 à la cinquième pseudohyphe pour l’induction NET.
Placez des couvercles de verre stérile de 10 millimètres sur 10 millimètres dans une assiette de 24 puits. Couvrir avec 10 microlitres de 0,001% poly l-lysine pendant une heure à température ambiante et laver deux fois avec 100 microlitres de 1X PBS. Sécher à l’air libre et irradier à la lumière UV pendant 15 minutes.
Ensuite, remplacer la solution HBSS de la suspension de neutrophiles préparée précédemment par un milieu RPMI 1640 complété par du plasma autologue décomplété à 10% par la chaleur. Ajouter 350 microlitres de cette suspension cellulaire à la plaque de 24 puits pour une concentration finale de deux fois 10 à cinq neutrophiles par puits. Incuber la plaque pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius avec 5% de dioxyde de carbone pour permettre aux cellules d’adhérer au fond des puits.
Pour induire la formation de filets, ajoutez les stimuli bactériens MOI100 et pseudohyphes à MOI1. Ajoutez également les stimuli biochimiques et préparez un contrôle sans stimulus en ajoutant 50 microlitres de HBSS. Obtenir un volume final de 400 microlitres par puits et mélanger sur un agitateur à plaques à 140 RPM pendant 30 secondes.
Puis incuber pendant quatre heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Après induction nette, retirer le surnageant des puits en le pipetant soigneusement et fixer les cellules avec 300 microlitres de paraformaldéhyde à 4% pendant 30 minutes. Lavez les cellules avec 200 microlitres de 1X PBS sans centrifuger et ajoutez 200 microlitres de tampon bloquant pendant 30 minutes.
Pour la coloration LL37, perméabiliser les cellules avec 200 microlitres de 0,2% Triton X-100 dans 1X PBS pendant 10 minutes et laver avec 1X PBS deux fois. Montez les bordereaux de couverture sur des lames de verre. L’ADN colore les cellules avec deux microlitres de DAPI et les stocke à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse par microscopie confocale à fluorescence.
Les phases cellulaires dynamiques ont été visualisées après purification à double gradient de densité. La morphologie typique des neutrophiles a été confirmée par une coloration droite. Les cellules ont également montré une viabilité optimale observée par exclusion du bleu de trypan sans perturbation de la membrane.
L’analyse des SSC par rapport aux FSC par cytométrie en flux a confirmé une population correspondant à la PMN avec une pureté cellulaire élevée. Les diagrammes de points PMN pour les cellules non colorées par rapport aux cellules colorées 7AAD et leurs histogrammes respectifs ont indiqué une viabilité cellulaire élevée dans les neutrophiles fraîchement isolés par rapport aux cellules témoins perméabilisées. Après avoir stimulé les neutrophiles avec des stimulants chimiques et microbiens, les TNE ont été visualisées par microscopie à fluorescence à l’aide de l’ADN DPI et de l’anti-LL37.
Les micro-organismes ont été pré-colorés avec CFSE. Formation de filet suicidaire induite par la PMA indiquée par co-localisation avec LL37. Alors que les TNE formées avec HOCI ont montré une dispersion mineure de l’ADN dans l’espace extracellulaire qui correspondait à la formation vitale de TNE.
Les TNE induites par les pseudohyphes fongiques ont montré de faibles concentrations d’ADN libérées dans l’espace extracellulaire avec des structures filamenteuses caractéristiques de la formation vitale de TNE. S. aureus a montré une formation vitale de TNE tandis que P. aeruginosa a induit la libération de grandes concentrations d’ADN avec une morphologie trouble qui co-localisée avec LL37 indiquant la formation de NET suicidaire. La réalisation d’une méthodologie de gradient de double densité nous permet d’obtenir une pureté et une viabilité élevées des neutrophiles.
Et nous élevons les lavages, nous évitons d’endommager la structure de ceux-ci. En suivant cette méthode, nous pouvons analyser l’effet de substances ou de cellules dans la production de TNE ainsi que si elles sont impliquées dans un mécanisme ou leur utilisation comme thérapies dans les maladies auto-immunes.
