Ce travail a été soutenu par la Société Max Planck, le cancer Centre allemand de recherche, l&#39;Université de Tübingen, et le Bundesministerium für Bildung und Forschung (accorder. Pas 0312040). Nous remercions Eduard Hermann de nous aider à automatiser l&#39;analyse des données de la courbe de la force et le Dr Jakob Suckale la lecture attentive de ce manuscrit.

1. Préparation de bicouches lipidiques supportées (SLB) 11,12,21 <ol><li> Préparation de lipides Mélange vésicules multilamellaires et Suspensions <ol><li> Préparer les tampons suivants à l&#39;avance. <ol><li> Préparer tampon PBS à des concentrations de 2,7 mM de KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4 et NaCl 137 mM, pH 7,2. </li><li> Préparer SLB (soutenu bicouche lipidique) à des concentrations de tampon NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. </li><li> Préparer une solution de 1 M de CaCl2. </li></ol></li><li> Dissoudre les lipides suivants dans le chloroforme à une concentration désirée: par exemple, la di-oléyl-phosphatidylcholine (DOPC) à 25 mg / ml, la sphingomyéline (SM) à 25 mg / ml et le taux de cholestérol (Chol) à 10 mg / ml. </li><li> Prenez 18,38 pi de DOPC, 17,10 pi de SM et 11,30 pi de Chol pour faire une solution avec 1 mg de lipides totaux dans un 2: 2: 1 DOPC: rapport molaire Chol: SM. Variez les volumes en conséquence sur la base du concentrations des lipides préparés en 1.1.2. Cependant, maintenir le rapport molaire de 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, que de changer le rapport molaire va changer les caractéristiques de phase de la membrane 25. </li><li> Mélanger la solution complètement au vortex. Ajouter un colorant fluorescent lipidique à 0,05% en moles si l&#39;on veut visualiser la bicouche par un microscope à fluorescence. Remarque: La famille de dialkylcarbocyanines à longue chaîne, comme l&#39;a fait, Dil et DiO couvrent un large éventail de longueurs d&#39;onde et peuvent être idéalement utilisés pour marquer des membranes lipidiques. En variante, des lipides marqués par fluorescence, tels que la phosphatidyléthanolamine ou la rhodamine-BODIPY-cholestérol peuvent être utilisés. Dans tous les cas, la concentration du colorant doit être optimisée en fonction du réglage de la microscopie, en gardant à l&#39;esprit que des concentrations élevées du fluorophore lié au lipide peuvent modifier le comportement des lipides 19. </li><li> Séchez le chloroforme en utilisant du gaz N 2 (ou tout gaz inerte disponibles tels que Ar et He). </li><li> En outre t secil lipide mélange sous vide pendant au moins 1 heure. Note: Si vous rangez ce mélange lipidique, purger l&#39;air avec un gaz inerte (N 2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C. Aliquoter excès de lipides-en-chloroforme dans de petits flacons bruns. Séchez-les d&#39;une manière similaire à celle du mélange de lipides, déplacer l&#39;air avec un gaz inerte (N 2, Ar ou He) et conserver à -20 ° C. </li><li> Dissoudre les lipides séchés dans du tampon PBS à une concentration de 10 mg / ml. </li><li> Vortex vigoureusement le mélange pendant environ 20 sec à 1 min pour obtenir une suspension trouble, contenant des vésicules multilamellaires. Assurez-vous que la il n&#39;y a pas de films lipidiques coller aux parois de la fiole. </li><li> Distribuer cette suspension dans 10 aliquotes (1 mg de lipides fait 10 aliquotes). </li><li> Stocker à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. </li></ol></li><li> Préparation de vésicules unilamellaires Remarque: Les diverses tailles des vésicules unilamellaires peuvent être préparés en utilisant le procédé de sonication ou le procédé d&#39;extrusion. Sonication utilise sound énergie pour agiter le mélange et séparer les couches de la suspension multilamellaire. Ceci est indiqué par le nettoyage de la suspension brumeux. Extrusion force les vésicules multilamellaires de passer à travers un filtre à membrane ayant une taille de pore définie. <ol><li> Méthode de Sonication <ol><li> Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB. </li><li> Transférer le mélange dans de petits (2 ml) flacons de verre plafonnés et sceller avec du Parafilm. </li><li> Soniquer le mélange à la température ambiante dans un bain sonique pendant 10 min ou jusqu&#39;à ce qu&#39;il devienne clair pour donner de petites vésicules unilamellaires (SUV, en dessous de 50 nm de diamètre). </li></ol></li><li> Extrusion Méthode <ol><li> Prenez les 10 pi de suspensions lipidiques multilamellaires et ajouter 150 pi de tampon SLB. </li><li> Transférer la suspension dans un tube cryogénique. </li><li> Geler la suspension de lipides en immergeant le tube cryogénique pour quelques secondes dans de l&#39;azote liquide. </li><li> Décongeler lesuspension lipidique en immergeant le tube cryogénique dans un bain d&#39;eau à température ambiante ou 37 ° C pendant quelques minutes. Répétez les étapes de gel-dégel au moins 10 fois. </li><li> Pour extruder la suspension de lipides, en utilisant une membrane de polycarbonate de 200 nm de taille de pores (d&#39;autres tailles de pores sont disponibles comme, 100 nm ou 400 nm) et un dispositif d&#39;extrusion 26 commerciale. Remarque: Actuellement, il existe deux dispositifs d&#39;extrusion disponibles dans le commerce: une extrudeuse manuel est disponible pour de petits volumes (200 pi à quelques ml). Dans ce cas, l&#39;échantillon est extrudé à travers la membrane en poussant manuellement la suspension avant et en arrière entre deux seringues. Selon le fabricant, devraient être combinées pour atteindre son volume minimum de la mise en place des aliquotes lipidiques. Pour de plus grands volumes (jusqu&#39;à 50 ml) dispositifs plus sophistiqués qui sont utilisés dans la suspension est forcée à travers la membrane de polycarbonate à l&#39;aide de gaz comprimé. SET-UP et extrusion conditions peuvent changer selon le model. Reportez-vous aux instructions du fabricant avant de l&#39;utiliser. Ce protocole se réfère à l&#39;extrudeuse manuelle pour les petits volumes. </li><li> Equilibrer l&#39;extrudeuse dans l&#39;eau en faisant passer l&#39;eau à travers l&#39;extrudeuse. Plonger la membrane dans l&#39;eau. </li><li> Placer la membrane entre les deux pistons, l&#39;assemblage du dispositif et équilibrer dans du tampon, en faisant passer le tampon à travers l&#39;extrudeuse, d&#39;une seringue à l&#39;autre. Cette étape permet de tester en outre la perméabilité du système. En cas de fuite, démonter et le remonter à nouveau changer la membrane. </li><li> Prendre la suspension de lipides en utilisant une seringue de l&#39;extrudeuse («côté sale &#39;). </li><li> Fixer la seringue contenant la suspension de lipides sur une chambre et la seringue vide sur la chambre adverse. </li><li> Poussez la seringue sur une extrémité. Filtrer la solution à travers la membrane et dans la seringue opposée. Ceci est la passe 1 er. </li><li> Passer à travers la membrane pour un total de 31 fois cesque la solution se termine sur la seringue opposée («côté propre»). Remarque: Vérifiez la membrane après extrusion. Si elle a été rompue, puis procédé d&#39;extrusion a échoué et doit être répétée. </li><li> Vider la seringue dans un petit tube. Grandes vésicules unilamellaires (LUV) sont stables pendant 1-2 jours si elles sont conservées à 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Préparation de Mica et Lamelles <ol><li> Laver lamelles de première dans l&#39;eau puis dans l&#39;éthanol. Sécher à l&#39;air. </li><li> Prenez disques de mica et de décoller la couche externe avec du ruban adhésif. </li><li> Fixez le disque de mica sur la lamelle. Colles optiques transparents est optimisé de manière que l&#39;on peut vérifier les bicouches avec un microscope à fluorescence. </li><li> Attacher des cylindres en plastique (diamètre extérieur 2,5 cm, 2 cm de diamètre intérieur et 0,5 cm de hauteur) en utilisant de la colle optique / graisse. Assurez-vous que tout est scellé et qu&#39;il n&#39;y a pas de fuites. Utiliser de la graisse quand on veut réutiliser les bouteilles, car ils peuvent être facilement détachés de ee lamelle et lavé. Les dimensions des cylindres en plastique dépendent de la taille du support de cantilever AFM et doivent être ajustés en conséquence. </li></ol></li><li> Dépôt de vésicules unilamellaires sur support solide <ol><li> Pipeter l&#39;ensemble de la solution de liposome directement sur le mica. Ajouter davantage de tampon SLB pour atteindre un volume de 300 pi. </li><li> Ajouter 0,9 pl d&#39;une solution de chlorure de calcium M pour atteindre une concentration finale de 3 mM de Ca 2+. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 2 minutes et ensuite à 65 ° C pendant au moins 10 min. Toujours couvrir les bicouches avec le tampon. Le contact avec les bulles d&#39;air et aériennes détruire. Pendant l&#39;incubation, ajouter plus de mémoire tampon si nécessaire, surtout si incubation à des températures plus élevées. Remarque: Les températures d&#39;incubation varient en fonction des mélanges lipidiques et les phases nécessaires. Le temps d&#39;incubation d&#39;au moins 10 min est nécessaire pour former des bicouches en charge, mais il pourrait être plus long, en fonction de la température et de la composition. </li><li> Lavageavec la bicouche chaude (65 ° C) de 15 à 20 fois SLB tampon pour éliminer le calcium et les vésicules non fusionnées. Prenez soin supplémentaire pendant les étapes de lavage pour garder la bicouche sous tampon et pipeter doucement la solution de lavage pour éviter de détruire la bicouche. </li><li> Bicouches frais pris en charge à la température ambiante avant les mesures de l&#39;AFM. Cela est nécessaire pour former les différentes phases de la membrane ainsi que de minimiser la dérive thermique dans l&#39;instrument. </li></ol></li></ol> 2. microscopie à force atomique Mesures 11,12 <ol><li> Imagerie Remarque: Effectuez imagerie par microscopie à force atomique en mode contact ou en mode taraudage. Image supportés bicouches en solution; ne permettent pas de solution à évaporer complètement car cela va détruire les bicouches. Comme on pouvait travailler avec tampon, s&#39;il vous plaît respecter les consignes de sécurité à faire en sorte qu&#39;une partie de l&#39;AFM est protégée contre les déversements de liquides. <ol><li> Sélectionnez un cantilever douce (inférieure à 0,2 N / m constante de ressort est conseillé) et le monter à til AFM. Le choix de la raideur en porte à faux est plus critique pour la spectroscopie de force (et cela sera discuté plus tard). </li><li> Monter l&#39;échantillon sur la scène de l&#39;AFM et assurez-vous que tous les modules de vibration-isolement sont allumés. Attendez au moins 15 minutes pour équilibrer et de réduire la dérive thermique du système. Selon l&#39;AFM set-up, tuning et d&#39;imagerie spécifications peuvent varier. Consultez le manuel du fabricant. </li><li> Approchez l&#39;échantillon avec la pointe de l&#39;AFM jusqu&#39;à ce contact. </li><li> Depuis bicouches lipidiques sont habituellement de 4 nm de hauteur, utiliser le Z-gamme de l&#39;instrument qui donnera la plus haute résolution z (par exemple 1,5 um). </li><li> Sélectionnez une région à l&#39;image. Pour avoir un aperçu de la bicouche lipidique, 50 um x 50 um ou 25 um x 25 um région sera un bon point à l&#39;image de départ. Si les petites fonctionnalités apparaissent, on peut image dans des zones plus petites (10 um x 10 um, ou 2 x 2 pm pm). Le choix de la zone de formation d&#39;image dépend également de la r travailange du scanner piézoélectrique. S&#39;il vous plaît consulter le manuel de l&#39;instrument pour cela. </li><li> Comme bicouches sont très fragiles, régler le point de la pointe AFM de jeu lors de l&#39;imagerie de garder la force au minimum et corriger la dérive thermique, tout en maintenant le contact avec l&#39;échantillon. En mode de contact, de minimiser le point de consigne. En mode tapping, maximiser le point de consigne. </li><li> Traiter les images en ajustant chaque ligne de balayage à des fonctions de mise à niveau de polynômes. Effectue la suppression de la ligne pour les scans qui perdent contact avec la membrane en utilisant le logiciel propriétaire de l&#39;entreprise de fabrication de l&#39;AFM. </li></ol></li><li> Spectroscopie de force <ol><li> Calibrer le cantilever en suivant les instructions selon le protocole du fabricant. L&#39;étalonnage permet la conversion du signal électrique des photodiodes de force (Figure 1B). <ol><li> Calibrer la sensibilité de la pointe pour mesurer la déviation que le mouvement z-piézo (en unités de longueur) à la place du signal électrique en volts. <br /&gt; Remarque: AFM détecte les variations de la déviation du cantilever l&#39;aide d&#39;un laser réfléchi à l&#39;arrière du cantilever. Le laser atteint une photodiode qui peut spatialement détecter la position de la tache laser. Une modification de la déviation du cantilever tel qu&#39;il se plie lors d&#39;un contact avec l&#39;échantillon est détectée par la photodiode en tant que cette &quot;déviation verticale&quot;, ce qui est dans les unités de tension. Étant donné que le cantilever est proposé par l&#39;élément piézo-z, la déviation verticale est en relation avec le mouvement dans la piézo-z. Le rapport entre la déviation verticale et z-mouvement est appelé la sensibilité et la conversion de la tension à la distance. </li><li> Calculer la constante de ressort en porte à faux en utilisant la méthode de fréquence de bruit thermique, habituellement incorporé dans le logiciel de l&#39;AFM. Dans ce procédé, tracer l&#39;amplitude de vibration de bruit par rapport à la fréquence d&#39;oscillation, la création d&#39;un diagramme de densité spectrale de puissance. Cette parcelle se montrer un pic autour de la fréquence de résonance. La fréquence où l&#39;amplitude is la plus grande est la fréquence de résonance. Monter une fonction lorentzienne autour du pic de calculer automatiquement la constante de rappel par le logiciel. Certaines des ressources utiles pour la théorie de la méthode de bruit thermique sont données dans les références 27-30. </li></ol></li><li> Après imager une zone de la bicouche, sélectionner une région de 5 x 5 pm pm dans la bicouche à effectuer la spectroscopie de force. </li><li> Mettre en place l&#39;AFM afin qu&#39;il prenne courbes de force dans une grille de cette région 16 x 16. Cela se traduit par 256 courbes de force par région. L&#39;espace entre deux points voisins devrait être suffisant pour éviter que la surface de la membrane est sondée par un point coïnciderait avec le point suivant. Cela dépend sur le rayon de la pointe. Une distance de 100 nm entre deux points serait idéal. Diviser la région x 5 pm 5 pm en 16 x 16 grille. Selon la taille de la phase, on peut sélectionner une région plus ou moins grande, et ensuite ajuster la taille de la grille en conséquence. </li><li> Ensemble piézo-z de déplacement400 nm. Cela détermine la portée maximale de mouvement de la z-piézo. Il devrait être assez grand pour faire en sorte que le cantilever a complètement rétractée loin de l&#39;échantillon entre les deux mesures. </li><li> Réglez la vitesse d&#39;approche de 800 nm / s et se rétracter vitesse à 200 nm / sec. Utiliser une vitesse d&#39;approche entre 400 à 6000 nm / s en fonction de la composition de la bicouche lipidique et de la phase à étudier 6,16. </li><li> Après la mise en place de tous les paramètres, acquérir courbes de force, en appuyant sur le bouton &quot;run&quot; du logiciel de l&#39;AFM. </li><li> Enregistrer courbes de force que la force en fonction des courbes de hauteur (une mesure de mouvement z-piézo). Ceci ne tient pas compte de la flexion de la poutre lors du contact avec l&#39;échantillon. Lors de l&#39;étape de traitement de données, le logiciel de l&#39;AFM permet correction pour cantilever pliage pour obtenir la force en fonction des courbes de séparation pointe de l&#39;échantillon (figure 1C), ce qui donnera des valeurs correctes pour l&#39;épaisseur de la bicouche. Les valeurs de correction sont habituellement incorporés dans le calibration, qui est enregistré avec chaque courbe de force. Calculer la séparation pointe-échantillon en soustrayant la déviation verticale du mouvement piézoélectrique à un moment donné. Remarque: Le pic de la courbe de force d&#39;approche (la valeur de la force descend même si le mouvement en porte à faux est toujours sur le cycle d&#39;approche) est la force de rupture de la membrane, tandis que la différence entre la position de ce pic et la position du point où la force commence à se lever à nouveau fournit l&#39;épaisseur de la membrane. </li><li> Acquérir au moins 500 courbes de force pour chaque condition d&#39;obtenir de bonnes statistiques. Tracer un histogramme des valeurs en utilisant des programmes comme origine ou de MatLab, et monter les histogrammes pour une distribution gaussienne pour obtenir le pic et la largeur de la distribution. </li></ol></li></ol>

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	<li>Binnig, G., Quate, C. F., Gerber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscope.">Atomic Force Microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 56, 930-933 (1986).</li><li>Hansma, P. K., Elings, V. B., Marti, O., Bracker, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scanning+Tunneling+Microscopy+and+Atomic+Force+Microscopy:+Application+to+Biology+and+Technology.">Scanning Tunneling Microscopy and Atomic Force Microscopy: Application to Biology and Technology.</a> Science. 242, 209-216 (1988).</li><li>Gaczynska, M., Osmulski, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+of+biological+complexes:+What+can+we+learn.">AFM of biological complexes: What can we learn.</a> Curr, Opin. Colloid In. 13, 351-367 (2008).</li><li>Goksu, E. I., Vanegas, J. M., Blanchette, C. D., Lin, W. -. C., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM+for+structure+and+dynamics+of+biomembranes.">AFM for structure and dynamics of biomembranes.</a> BBA-Biomembranes. 1788, 254-266 (2009).</li><li>Muller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AFM:+A+Nanotool+in+Membrane+Biology.">AFM: A Nanotool in Membrane Biology.</a> Biochemistry-US. 47, 7986-7998 (2008).</li><li>Redondo-Morata, L., Giannotti, M. I., Sanz, F., Bar&#243;, A. M., Reifenberger, R. G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Atomic Force Microscopy in Liquid: Biological Applications. , (2012).</li><li>Castellana, E. T., Cremer, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid+supported+lipid+bilayers:+From+biophysical+studies+to+sensor+design.">Solid supported lipid bilayers: From biophysical studies to sensor design.</a> Surf. Sci. Rep. 61, 429-444 (2006).</li><li>Frederix, P. L. T. M., Bosshart, P. D., Engel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+Force+Microscopy+of+Biological+Membranes.">Atomic Force Microscopy of Biological Membranes.</a> Biophys. J. 96, 329-338 (2009).</li><li>Mennicke, U., Salditt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Solid-Supported+Lipid+Bilayers+by+Spin-Coating.">Preparation of Solid-Supported Lipid Bilayers by Spin-Coating.</a> Langmuir. 18, 8172-8177 (2002).</li><li>Raviakine, I., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+Supported+Phospholipid+Bilayers+from+Unilamellar+Vesicles+Investigated+by+Atomic+Force+Microscopy.">Formation of Supported Phospholipid Bilayers from Unilamellar Vesicles Investigated by Atomic Force Microscopy.</a> Langmuir. 16, 1806-1815 (2000).</li><li>Chiantia, S., Ries, J., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+AFM+and+Two-Focus+SFCS+Study+of+Raft-Exhibiting+Model+Membranes.+.">Combined AFM and Two-Focus SFCS Study of Raft-Exhibiting Model Membranes. .</a> ChemPhysChem. 7, 2409-2418 (2006).</li><li>Unsay, J., Cosentino, K., Subburaj, Y., Garcia-Saez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiolipin+effects+on+membrane+structure+and+dynamics.">Cardiolipin effects on membrane structure and dynamics.</a> Langmuir. 29, 15878-15887 (2013).</li><li>Dom&#232;nech, &. #. 2. 1. 0. ;., Sanz, F., Montero, M. T., Hern&#225;ndez-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+structural+study+of+the+main+phospholipid+components+comprising+the+mitochondrial+inner+membrane.">Thermodynamic and structural study of the main phospholipid components comprising the mitochondrial inner membrane.</a> BBA-Biomembranes. 1758, 213-221 (2006).</li><li>Dom&#232;nech, &. #. 2. 1. 0. ;., Morros, A., Caba&#241;as, M. E., Teresa Montero, M., Hern&#225;ndez-Borrell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Supported+planar+bilayers+from+hexagonal+phases.">Supported planar bilayers from hexagonal phases.</a> BBA-Biomembranes. 1768, 100-106 (2007).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Chiantia, S., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+line+tension+on+the+lateral+organization+of+lipid+membranes.">Effect of line tension on the lateral organization of lipid membranes.</a> J Biol Chem. 282, 33537-33544 (2007).</li><li>Alessandrini, A., Seeger, H. M., Caramaschi, T., Facci, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Force+Spectroscopy+on+Supported+Lipid+Bilayers:+Effect+of+Temperature+and+Sample+Preparation.">Dynamic Force Spectroscopy on Supported Lipid Bilayers: Effect of Temperature and Sample Preparation.</a> Biophys. J. 103, 38-47 (2012).</li><li>Butt, H. -. J., Franz, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rupture+of+molecular+thin+films+observed+in+atomic+force+microscopy+I.+Theory.">Rupture of molecular thin films observed in atomic force microscopy I. Theory.</a> Physical Review E. 66, 031601 (2002).</li><li>Garcia-Manyes, S., Oncins, G., Sanz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Temperature+on+the+Nanomechanics+of+Lipid+Bilayers+Studied+by+Force+Spectroscopy.">Effect of Temperature on the Nanomechanics of Lipid Bilayers Studied by Force Spectroscopy.</a> Biophys. J. 89, 4261-4274 (2005).</li><li>Chiantia, S., Kahya, N., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Raft+domain+reorganization+driven+by+short-+and+long-chain+ceramide:+a+combined+AFM+and+FCS+study.">Raft domain reorganization driven by short- and long-chain ceramide: a combined AFM and FCS study.</a> Langmuir. 23, 7659-7665 (2007).</li><li>Canale, C., Jacono, M., Diaspro, A., Dante, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Force+spectroscopy+as+a+tool+to+investigate+the+properties+of+supported+lipid+membranes.">Force spectroscopy as a tool to investigate the properties of supported lipid membranes.</a> Microsc. Res. Techniq. 73, 965-972 (2010).</li><li>Garc&#237;a-S&#225;ez, A. J., Chiantia, S., Salgado, J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pore+Formation+by+a+Bax-Derived+Peptide:+Effect+on+the+Line+Tension+of+the+Membrane+Probed+by+AFM.">Pore Formation by a Bax-Derived Peptide: Effect on the Line Tension of the Membrane Probed by AFM.</a> Biophys. J. 93, 103-112 (2007).</li><li>Moreno Flores, S., Toca-Herrera, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+new+future+of+scanning+probe+microscopy:+Combining+atomic+force+microscopy+with+other+surface-sensitive+techniques,+optical+microscopy+and+fluorescence+techniques.">The new future of scanning probe microscopy: Combining atomic force microscopy with other surface-sensitive techniques, optical microscopy and fluorescence techniques.</a> Nanoscale. 1, 40-49 (2009).</li><li>Simons, K., Vaz, W. L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model+Systems,+Lipid+Rafts,+and+Cell+Membranes1.">Model Systems, Lipid Rafts, and Cell Membranes1.</a> Annu. Rev. Bioph. Biom. 33, 269-295 (2004).</li><li>Pike, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rafts+defined:+a+report+on+the+Keystone+symposium+on+lipid+rafts+and+cell+function.">Rafts defined: a report on the Keystone symposium on lipid rafts and cell function.</a> The Journal of Lipid Research. 47, 1597-1598 (2006).</li><li>Kahya, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+Lipid+Mobility+of+Raft-exhibiting+Model+Membranes+by+Fluorescence+Correlation+Spectroscopy.">Probing Lipid Mobility of Raft-exhibiting Model Membranes by Fluorescence Correlation Spectroscopy.</a> J. Biol. Chem. 278, 28109-28115 (2003).</li><li>Akbarzadeh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome:+classification,+preparation+and+applications.">Liposome: classification, preparation and applications.</a> Nanoscale Research Letters. 8, 102 (2013).</li><li>Butt, H. -. J., Jaschke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+thermal+noise+in+atomic+force+microscopy.">Calculation of thermal noise in atomic force microscopy.</a> Nanotechnology. 6, 1-7 (1995).</li><li>Chon, J. W. M., Mulvaney, P., Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

SLBS composés de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été formés sur mica vésicule après adsorption et de la rupture induite par le chlorure de calcium. Cette composition lipidique séparé en L D et L o phases. La phase L o est enrichi en sphingomyéline et cholestérol est moins fluide et / plus visqueux (figure 1A) de la phase de 11 Ld. La séparation de la L o L d à partir de la phase se manifeste en tant que structures circ...

Microscopie à force atomique (AFM) génère une image d&#39;une surface par balayage sur une zone de l&#39;échantillon en utilisant une console avec une pointe très fine 1. Le mouvement de la sonde en porte à faux de la topologie de surface de l&#39;échantillon. AFM a été largement appliquée à des molécules biologiques - y compris les protéines, l&#39;ADN et les membranes, en raison de sa polyvalence dans l&#39;analyse des échantillons fixés dans l&#39;air ou de l&#39;état quasi-native dans un liquide 2-5. Outre sa capacité d&#39;imagerie à haute résolution dans l&#39;ordre du nanomètre, le cantilever AFM agit comme un ressort pour sonder les forces d&#39;interaction (d&#39;adhérence et de répulsion) et les propriétés mécaniques de l&#39;échantillon 5,6. Ceci est connu comme la spectroscopie de force. Dans ce mode, la sonde se rapproche de la première de l&#39;échantillon et exerce une force sur elle, puis est rentré jusqu&#39;à ce qu&#39;il perd le contact avec l&#39;échantillon (figure 1A). Les courbes montrent générés force en fonction de la distance du levier à la fois pour l&#39;applicationle gardon et la rétraction. Plusieurs propriétés, y compris le module d&#39;élasticité pour mesurer la rigidité d&#39;un matériau, et les forces d&#39;adhérence peuvent être obtenues. Bicouches lipidiques supportées sont des membranes modèles biologiques situées sur le dessus d&#39;un support solide - habituellement le mica, le verre borosilicate, silice fondue, ou de silicium 7 oxydé. Ils sont préparés en utilisant différentes techniques comme le dépôt de la vésicule, de méthode et de Langmuir-Blodgett spin-coating 8,9. Imagerie AFM a été utilisée pour suivre la formation de ces bicouches supportées 10, et sonder différentes structures formées par des membranes de différentes compositions 11 à 15. Effectuer la spectroscopie de force sur les résultats bicouches pris en charge dans un pic dans la courbe d&#39;approche. Ce pic indique la force nécessaire pour percer la bicouche, et est appelée force de percée. L&#39;épaisseur de la double couche peut également être mesurée en utilisant la courbe de force 6. La force typique de percée de bicouchescomprise entre 1-50 nN 6. Ces propriétés dépendent de lipide emballage (liquide ou gel de phase) et la structure (longueur de chaîne acyle et le degré d&#39;insaturation) et modifié par des agents de la membrane 16 actif. La théorie derrière la rupture a été expliqué 17 et d&#39;autres paramètres expérimentaux tels que cantilever douceur, rayon de la pointe et de la vitesse d&#39;approche affectent également la force de percée 15,16,18. la spectroscopie de force a été utilisé pour analyser les propriétés des différentes phases lipidiques 11,19, les changements de composition dépendant 12,20, ainsi que des effets d&#39;autres biomolécules, telles que des peptides, sur la stabilité de la membrane 21. Le plat d&#39;orientation de bicouches supportées est avantageux pour combiner AFM avec d&#39;autres méthodes telles que la résonance plasmonique de surface 22 et la microscopie à fluorescence 11,19 pour mieux caractériser la structure et les propriétés des membranes. Ce proto vidéo détailléecol est destiné à préparer bicouches lipidiques supportées en utilisant le dépôt de la vésicule et les analyser avec l&#39;AFM et spectroscopie de force. Bien que les vésicules de différentes tailles peuvent être utilisés pour préparer des bicouches, ce protocole se concentre sur les petites et grandes vésicules unilamellaires. Bicouches pris en charge cette phase séparer en liquide commandé (L o) et désordonnés (L) d phases liquides ont été caractérisées 11,15. La membrane est constituée de di-oléoyl-phosphatidylcholine (DOPC), la sphingomyéline (SM), et du cholestérol (Chol) à 2: 2: 1. Cette composition modèles les radeaux lipidiques, qui sont proposées à se comporter comme des plateformes importantes pour le trafic de protéines et de tri, la signalisation cellulaire et d&#39;autres processus cellulaires 23,24.

<table><tbody><tr><td>1,2-dioleoyl-&lt;em&gt;sn&lt;/em&gt;-glycero-3-phosphocholine</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>850375P</td><td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>860062P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td><td>700000P</td><td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&amp;nbsp;&amp;deg;C. Visit &lt;a href=&quot;http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&amp;amp;view=article&amp;amp;id=1679&amp;amp;Itemid=398&quot;&gt;here&lt;/a&gt; for more information on storage and handling.</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>9265.1</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl), 88%</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogenphosphate (Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), &gt;99%</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogenphosphate (KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;), 99%</td><td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;), molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td>HEPES, molecular biology grade</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>Glass coverslip, 24&amp;nbsp;x&amp;nbsp;60&amp;nbsp;mm, 1&amp;nbsp;mm thickness</td><td>Duran Group</td><td>2355036</td><td></td></tr><tr><td>Punch and Die Set</td><td>Precision Brand Products, Inc</td><td>40105</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive</td><td>Norland Products, Inc.</td><td>NOA 88</td><td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>Mica blocks</td><td>NSC Mica Exports Ltd.</td><td></td><td>These are mica pieces at least 1 sq. inches in area and thickness ranging from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&amp;nbsp; Always handle mica with gloves or tweezers.</td></tr><tr><td>Laboratory Equipment Grease</td><td>Borer Chemie AG</td><td>Glisseal N</td><td></td></tr><tr><td>Liposome Extruder</td><td>Avestin</td><td>LiposoFast-Basic</td><td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td></tr><tr><td>Adhesive Tape</td><td>3M</td><td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td><td></td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Bandelin Sonorex Digitec</td><td>DT-31</td><td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. (&lt;a href=&quot;http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf&quot;&gt;Data sheet&lt;/a&gt;)</td></tr><tr><td>Silicon Nitride AFM Cantilever&amp;nbsp;</td><td>Bruker AFM Probes</td><td>DNP-10</td><td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60&amp;nbsp;nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td></tr><tr><td>AFM</td><td>JPK</td><td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td><td></td></tr></tbody></table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Bicouches lipidiques supportées composées de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) ont été imagées en AFM (Figure 2 AC). En raison de la composition des lipides, SM / Chol-riche et DOPC L o L d riches en phases ont été observés. Le profil de hauteur de l&#39;imagerie AFM peut fournir des informations importantes sur la structure de la membrane. En regardant le profil de hauteur, l&#39;épaisseur de la bicouche peut être mesurée en présence de défauts dans la membrane (figure...

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Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.7K vues.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Vidéo: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Force Spectroscopy of Single Protein Molecules Using an Atomic Force Microscope

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. Atomic force microscopy (AFM) can address this problem by enabling stretching and relaxation of single protein molecules, which gives direct evidence of specific unfolding and refolding characteristics. AFM-based single-molecule force-spectroscopy (AFM-SMFS) provides a means to consistently measure high-energy conformations in proteins that are not possible in traditional bulk (biochemical) measurements. Although numerous papers were published to show principles of AFM-SMFS, it is not easy to conduct SMFS experiments due to a lack of an exhaustively complete protocol. In this study, we briefly illustrate the principles of AFM and extensively detail the protocols, procedures, and data analysis as a guideline to achieve good results from SMFS experiments. We demonstrate representative SMFS results of single protein mechanical unfolding measurements and we provide troubleshooting strategies for some commonly encountered problems.

We describe the detailed procedures and strategies to measure the mechanical properties and mechanical unfolding pathways of single protein molecules using an atomic force microscope. We also show representative results as a reference for selection and justification of good single protein molecule recordings.

Spectroscopie de force unique de molécules de protéines à l’aide d’un Microscope à Force atomique

The determination of the folding process of proteins from their amino acid sequence to their native 3D structure is an important problem in biology. ...

Recherche

Biochimie

Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

Enquête molécule unique adhérence par force atomique Spectroscopie

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

Ingénierie

Sub-nanometer Resolution Imaging with Amplitude-modulation Atomic Force Microscopy in Liquid

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown that when operated in amplitude-modulation (tapping) mode, atomic or molecular-level resolution images can be achieved over a wide range of soft and hard samples in liquid. In these situations, small oscillation amplitudes (SAM-AFM) enhance the resolution by exploiting the solvated liquid at the surface of the sample. Although the technique has been successfully applied across fields as diverse as materials science, biology and biophysics and surface chemistry, obtaining high-resolution images in liquid can still remain challenging for novice users. This is partly due to the large number of variables to control and optimize such as the choice of cantilever, the sample preparation, and the correct manipulation of the imaging parameters. Here, we present a protocol for achieving high-resolution images of hard and soft samples in fluid using SAM-AFM on a commercial instrument. Our goal is to provide a step-by-step practical guide to achieving high-resolution images, including the cleaning and preparation of the apparatus and the sample, the choice of cantilever and optimization of the imaging parameters. For each step, we explain the scientific rationale behind our choices to facilitate the adaptation of the methodology to every user's specific system.

We present a method for achieving sub-nanometer resolution images with amplitude-modulation (tapping mode) atomic force microscopy in liquid. The method is demonstrated on commercial atomic force microscopes. We explain the rationale behind our choices of parameters and suggest strategies for resolution optimization.

Imaging Résolution Sous-nanomètre avec modulation d&#39;amplitude en microscopie à force atomique en liquide

Atomic force microscopy (AFM) has become a well-established technique for nanoscale imaging of samples in air and in liquid. Recent studies have shown ...

Investigating Receptor-ligand Systems of the Cellulosome with AFM-based Single-molecule Force Spectroscopy

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the enzymes onto the noncatalytic scaffold protein is directed by interactions among a family of related receptor-ligand pairs comprising interacting cohesin and dockerin modules. The extremely strong binding between cohesin and dockerin modules results in dissociation constants in the low picomolar to nanomolar range, which may hamper accurate off-rate measurements with conventional bulk methods. Single-molecule force spectroscopy (SMFS) with the atomic force microscope measures the response of individual biomolecules to force, and in contrast to other single-molecule manipulation methods (i.e.&#160;optical tweezers), is optimal for studying high-affinity receptor-ligand interactions because of its ability to probe the high-force regime (&#62;120 pN). Here we present our complete protocol for studying cellulosomal protein assemblies at the single-molecule level. Using a protein topology derived from the native cellulosome, we worked with enzyme-dockerin and carbohydrate binding module-cohesin (CBM-cohesin) fusion proteins, each with an accessible free thiol group at an engineered cysteine residue. We present our site-specific surface immobilization protocol, along with our measurement and data analysis procedure for obtaining detailed binding parameters for the high-affinity complex. We demonstrate how to quantify single subdomain unfolding forces, complex rupture forces, kinetic off-rates, and potential widths of the binding well. The successful application of these methods in characterizing the cohesin-dockerin interaction responsible for assembly of multidomain cellulolytic complexes is further described.

Cellulosomes are multienzyme complexes designed for digesting cellulose. AFM-based SMFS was used to study the mechanical properties and folding configuration of cellulosome-associated protein assemblies. We present a complete workflow for protein immobilization, data acquisition, and data analysis to study the interactions of individual receptor-ligand complexes involved in cellulosome assembly.

Enquêter sur les systèmes récepteur-ligand de la cellulosome avec base-AFM unique molécule Spectroscopie de Force

Cellulosomes are discrete multienzyme complexes used by a subset of anaerobic bacteria and fungi to digest lignocellulosic substrates. Assembly of the ...

Bio-ingénierie

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Préparation de Mica charge bicouches lipidiques pour haute résolution microscopie optique d&#39;imagerie

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers seule molécule microscopie à fluorescence sur Planar pris en charge

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Visualizing Solution Structure at Solid-Liquid Interfaces using Three-Dimensional Fast Force Mapping

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the solution conditions such as ion concentrations, pH, ligands, and trace additives, as well as the underlying crystallography and chemistry. In this context, three-dimensional fast force mapping (3D FFM) has emerged as a promising tool for investigating solution structure at interfaces. This capability is based on atomic force microscopy (AFM) and allows the direct visualization of interfacial regions in three spatial dimensions with sub-nanometer resolution. Here we provide a detailed description of the experimental protocol for acquiring 3D FFM data. The main considerations for optimizing the operating parameters depending on the sample and application are discussed. Moreover, the basic methods for data processing and analysis are discussed, including the transformation of the measured instrument observables into tip-sample force maps that can be linked to the local solution structure. Finally, we shed light on some of the outstanding questions related to 3D FFM data interpretation and how this technique can become a central tool in the repertoire of surface science.

<meta charset="utf8"></head><body>Visualisation de la structure de la solution aux interfaces solide-liquide à l’aide de la cartographie tridimensionnelle des forces rapides

Here, we present a protocol for using three-dimensional fast force mapping - an atomic force microscopy technique - for visualizing solution structure at solid-liquid interfaces with the subnanometer resolution by mapping the tip-sample interactions within the interfacial region.

Visualisation de la structure de la solution aux interfaces solide-liquide à l’aide de la cartographie tridimensionnelle des forces rapides

Amongst the challenges for a variety of research fields are the visualization of solid-liquid interfaces and understanding how they are affected by the ...

Chimie

Atomic Force Microscopy Cantilever-Based Nanoindentation: Mechanical Property Measurements at the Nanoscale in Air and Fluid

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by the probe tip and its contact area with the sample can be quantified, it is possible to determine the nanoscale mechanical properties (e.g., elastic or Young&#39;s modulus) of the surface being probed. A detailed procedure for performing quantitative AFM cantilever-based nanoindentation experiments is provided here, with representative examples of how the technique can be applied to determine the elastic moduli of a wide variety of sample types, ranging from kPa to GPa. These include live mesenchymal stem cells (MSCs) and nuclei in physiological buffer, resin-embedded dehydrated loblolly pine cross-sections, and Bakken shales of varying composition.
Additionally, AFM cantilever-based nanoindentation is used to probe the rupture strength (i.e., breakthrough force) of phospholipid bilayers. Important practical considerations such as method choice and development, probe selection and calibration, region of interest identification, sample heterogeneity, feature size and aspect ratio, tip wear, surface roughness, and data analysis and measurement statistics are discussed to aid proper implementation of the technique. Finally, co-localization of AFM-derived nanomechanical maps with electron microscopy techniques that provide additional information regarding elemental composition is demonstrated.

Quantifying the contact area and force applied by an atomic force microscope (AFM) probe tip to a sample surface enables nanoscale mechanical property determination. Best practices to implement AFM cantilever-based nanoindentation in air or fluid on soft and hard samples to measure elastic modulus or other nanomechanical properties are discussed.

Microscopie à force atomique Nanoindentation basée sur le porte-à-faux: mesures des propriétés mécaniques à l’échelle nanométrique dans l’air et les fluides

An atomic force microscope (AFM) fundamentally measures the interaction between a nanoscale AFM probe tip and the sample surface. If the force applied by ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Microscopie à force atomique imagerie et spectroscopie de force de bicouches lipidiques supportées

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