The authors would like to thank the staff of the Syracuse University Department of Physics workshop for their innovative assistance in matters relating to our system design.

1. Nettoyage cellulaire Système Sonifier <ol><li> Nettoyez l&#39;union entre la corne et le convertisseur en utilisant le chloroforme et un tampon de coton. Appliquer une huile légère ou de l&#39;huile minérale pour les fils de la corne et le convertisseur pour éliminer davantage l&#39;accumulation de copeaux métalliques, de rouille ou oxydation. </li><li> Utilisez chloroforme pour éliminer l&#39;huile et d&#39;autres contaminants de l&#39;union après avoir essuyé les discussions avec de l&#39;huile. </li></ol> 2. Remontage la Cellule Sonifier et Configuration du Système <ol><li> Remettez la corne au convertisseur. Pour serrer correctement le système, retirez le convertisseur assemblé et de la corne de l&#39;ensemble de coupe en tirant la corne sur le fond de la tasse (figure 2A). Placer une clé à fente à l&#39;intérieur de l&#39;un des trois petits trous à proximité de la partie supérieure du convertisseur (figure 2B). Ensuite, placez une clé dynamométrique équipé d&#39;un pied de ½ pouce corneille sur la partie de la corne fendue (figure 2B). Serrer en sTANDARD sens horaire jusqu&#39;à ce que le compteur de couple lit 54,23 N. m (figure 2C), le couple recommandé par le fabricant 16. Monter le convertisseur resserré et de la Corne de retour dans la tasse, et monter la corne et le convertisseur à un stand de l&#39;anneau dans une position verticale. Remettez le convertisseur à l&#39;alimentation électrique avant de mettre le système à des fins expérimentales dosage d&#39;impulsion. </li><li> Réglez le système pour le dosage de l&#39;impulsion à l&#39;aide d&#39;ultrasons 1 sec avec 1 sec entre les impulsions. Différents modèles de dosage peuvent être utilisées pour d&#39;autres conditions expérimentales. De nombreuses variables, telles que le volume d&#39;eau et le diamètre de la corne seraient potentiellement exiger des modifications à ce dosage. Utilisation des types mentionnés ci-dessus de l&#39;échantillon cellulaire, le volume et la concentration, et l&#39;observation des données empiriques ont conduit à la formulation de ce schéma posologique. </li><li> Ajuster le système à l&#39;amplitude souhaitée. Dans ce protocole, utiliser 33% et 50% d&#39;amplitude pour empêcher la destruction complète des cellules, ce qui rendrait l&#39;efficacité de sonosensitsateurs difficiles ou impossibles à évaluer. NOTE: Dans cette étude, les amplitudes sont comparées. </li></ol> 3. Évaluer l&#39;intensité du système et Fonction <ol><li> Tenez le lecteur de cavitation à 1,5 cm, ce qui est le niveau de l&#39;échantillon ultrasons. Notez les lectures d&#39;évaluer que le système fonctionne à une intensité attendue. En utilisant les niveaux du système et de l&#39;eau actuels, attendre entre 100-110 W / cm 2 pour 33% d&#39;amplitude et de 115-125 W / cm 2 pour 50% d&#39;amplitude. Notez le relevé des compteurs cavitation de l&#39;affichage du compteur qui représente l&#39;énergie de cavitation en W / cm 2 directement. Prenez ces lectures à la surface de l&#39;eau, et de veiller à l&#39;absence de bulles sont présents à la surface de la sonde mètres. NOTE: Il est important de noter que ces procédures sont effectuées sans le capuchon pour l&#39;accès au dessus de la corne. Ils ne doivent pas être répétées après chaque traitement par ultrasons. Au contraire, ils doivent être réalisées uniquement après le nettoyage, remontage, et la mise en place du système. </li&gt; <li> Placez l&#39;hydrophone dans un flacon d&#39;échantillon contenant 12,5 ml d&#39;eau pour immerger complètement le capteur de l&#39;hydrophone. Suspendre l&#39;hydrophone utilisant le support de l&#39;anneau. </li><li> Fixez l&#39;hydrophone à l&#39;entrée de l&#39;oscilloscope afin d&#39;évaluer les caractéristiques de forme d&#39;onde. Examinez l&#39;oscilloscope pour une onde sinusoïdale clair, comme des vagues aberrantes peuvent modifier la fréquence du système à partir des spécifications du fabricant. Tant le compteur de cavitation et l&#39;oscilloscope donnent une lecture de fréquence, mais seulement l&#39;oscilloscope montrera vagues aberrantes qui sont révélatrices d&#39;un système défectueux ou un montage incorrect. </li></ol> 4. Préparation des cellules et le milieu <ol><li> Préparer le milieu en utilisant 240 ml de modification de Dubecco moyenne (le) de IMDM Iscove et 50 ml de sérum de veau fœtal. Ne décongelez pas de sérum de veau foetal dans un bain d&#39;eau chaude, les hausses rapides de température peuvent conduire à un compromis dans la stabilité du sérum. Moissonneuse 240 ul de gentamicine 50 mg / ml et 5 ml de pénicilline/ Streptomycine 100x dans un flacon de culture standard, et ajouter au milieu. Conserver le milieu à 4 ° C. </li><li> Graine cellules U937 à 4 x 10 ~ 4 cellules / ml dans un ballon de 25 2 cm en utilisant le milieu préparé. Évaluer les cellules de concentration et de viabilité en utilisant un compteur de cellules TC20 exclusion au bleu Trypan et en plaçant 15 à 20 pi de cellules et de 15 à 20 pi de bleu de trypan dans un tube de micro-centrifugeuse et mélanger le contenu. Ul Pipette15-20 de ce mélange dans un échantillonnage lame de TC20, et d&#39;initier les chiffres en plaçant la lame dans le compteur de cellules TC20. </li><li> Incuber les cellules à 37 ° C et 5% de CO 2, et vérifier la viabilité des cellules en utilisant l&#39;exclusion au bleu trypan et le compteur de cellules TC20. Lorsque les cellules sont à une concentration appropriée et / ou ont été traités avec sonosensibilisateurs pour un laps de temps approprié, le transfert de 3 ml de cellules du flacon de culture à 20 ml flacon à scintillation en verre. Dans ce protocole, cultiver des cellules U937 pendant 48 heures, puis traiter avec 0,5, 1,ou MeβCD 5 mM pendant 30 min à épuiser suffisamment le cholestérol des cellules avant la sonication. </li></ol> 5. Cellule Sonication <ol><li> Degas déminéralisée, eau distillée en utilisant un vide et Buchner flacon. Transférer l&#39;eau à la corne de tasse, et de remplir à un niveau de 15 mm sur le dessus de la corne. Le processus de sonication provoque en outre le dégazage de l&#39;eau pour une période de quelques minutes, et peut conduire à des incohérences au cours de l&#39;essai si le système n&#39;a pas été exécutée avant la sonication de l&#39;échantillon. Par conséquent, le système de fonctionner pendant environ 7 minutes avant sonication déguster. </li><li> Attacher le flacon à scintillation contenant les cellules pour le dispositif de maintien. Ensuite, fixez le dispositif de maintien au sommet de la corne de bocal et réglez une élévation de 15 mm à partir du haut de la corne (à la surface de l&#39;eau en utilisant le mécanisme coulissant). </li><li> Les cellules sont typiquement traitées par ultrasons en utilisant une trois impulsions d&#39;ultrasons sec, avec une seconde espacement entre chacune de ces impulsions. Pour çaprotocole, les cellules sonication à 33% et de 50% d&#39;amplitude en utilisant le dosage d&#39;impulsions précité. </li></ol> 6. Évaluation de cellules pour les dommages post-traitement aux ultrasons <ol><li> Évaluer les cellules en suspension pour les dommages et la viabilité à l&#39;aide de bleu trypan et le compteur de cellules TC20. En outre, l&#39;analyse de l&#39;échantillon en utilisant un compteur Z2. Pour Z2 contre-analyse, la pipette une cellule suspension de 100 ul dans 20 ml de solution saline isotonique (200: 1 ratio). Avant l&#39;analyse, rincer l&#39;ouverture de l&#39;analyseur de particules Z2 au moins deux fois en utilisant une solution saline isotonique. Placer l&#39;échantillon Z2 dans le contre-support, et d&#39;élever la plate-forme à l&#39;ouverture avant de lancer chefs d&#39;accusation. </li><li> Acquérir les données des compteurs TC20 et Z2 en utilisant le logiciel fourni par le fabricant. Analyser ces données pour les dommages cellulaires, la viabilité et la création de débris cellulaires de sonication. </li></ol> 7. XTT Test pour déterminer la viabilité cellulaire et l&#39;activité mitochondriale du traité U937 et des cellules THP1 <ol><li> Prior pour les essais de XTT, U937 et THP1 croître les cellules dans les mêmes conditions. Pré-traiter les cellules avec la même gamme de concentration de 30 min pour MeβCD avant sonication. Utilisez les mêmes paramètres d&#39;ultrasons comme avant, sauf que les cellules sont maintenant traitées par ultrasons en utilisant une gamme de 1-3 l&#39;un des impulsions sec espacés l&#39;un sec à part pour développer une gamme de dommages pour le kit XTT à évaluer. Note: Plusieurs de ces mesures sont prises directement à partir du manuel du kit XTT et ne sont répétés pour la commodité des laboratoires intéressés. </li><li> Recueillir les cellules par centrifugation à 200 xg pendant 10 min. Resuspendre le culot cellulaire dans le milieu de culture précédemment décrit. Resuspendre les cellules à 1 x 10 ~ 5 cellules / ml. cellules U937 de semences à 100 pi par puits dans une plaque à 96 puits de microtitrage à fond plat, en trois exemplaires, puis répétez pour THP1 cellules en utilisant une plaque de 96 puits séparé. Inclure les 3 puits témoins contenant 100 ul de milieu de croissance complet comme seul lectures d&#39;absorbance à blanc. Ensuite, incuber les plaques inoculées pour 24 h. </li><li> Dégivrage deux aliquotes du réactif XTT et le réactif d&#39;activation à 37 ° C avant utilisation. Aliquotes agiter doucement jusqu&#39;à ce que des solutions claires sont obtenues. Ajouter 0,1 ml de réactif d&#39;activation à 5,0 ml du réactif XTT, qui forme suffisamment de solution XTT activé pour une essai de 96 puits de plaque de microtitrage. Répétez le processus pour l&#39;autre plaque. </li><li> Ajouter 50 ul de la solution activée par XTT dans chaque puits. Retourner la plaque pour la culture de cellules de l&#39;incubateur CO 2 pendant 2 heures. Secouer doucement la plaque suivant la période d&#39;incubation pour répartir uniformément la couleur orange dans les puits positifs. Mesurer l&#39;absorbance des puits d&#39;essai contenant les cellules et les puits témoins vierges de fond à une longueur d&#39;onde entre la longueur d&#39;onde de 450 à 500 nm en utilisant un lecteur de plaque de microtitrage. </li><li> Soit zéro, le lecteur de plaques de microtitrage en utilisant les puits témoins à blanc ou soustraire la valeur moyenne à partir des résultats spécifiques. Mesurer l&#39;absorbance de tous les puits d&#39;essai dans un nouveau wavelenge entre 630 à 690 nm et soustraire les valeurs à partir des valeurs de 450 à 500 nm obtenus. Remarque: Cette seconde détermination de l&#39;absorbance permet d&#39;éliminer les mesures non spécifiques à partir des résultats de dosage. Le test XTT a été répétée quatre fois pour les deux lignées cellulaires. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

Pour atteindre des résultats optimaux, une attention particulière doit être prise pour positionner soigneusement l&#39;échantillon et nettoyer l&#39;union convertisseur corne. Le placement de l&#39;échantillon dans la corne est important pour l&#39;obtention de la destruction des cellules cohérente, que de changer la distance de la corne va modifier les foyers acoustique, et donc modifier l&#39;énergie de l&#39;échantillon est exposé. L&#39;énergie acoustique dans la corne de coupe peut être mappé en utilisant le compteur de cavitation pour trouver la position de la cavitation maximale. En outre, l&#39;appareil de mesure de la cavitation, en même temps que l&#39;oscilloscope sont essentiels pour déterminer l&#39;intensité du son, les cellules sont exposés à, ainsi que l&#39;homogénéité de la forme d&#39;onde. Par conséquent, ces instruments doivent être utilisés pour détecter des problèmes avec le système, et aider à déterminer ce qui peut être nécessaire dépannage pour corriger une instabilité du système. Comme mentionné précédemment, le système à basse fréquence peut agir en outre pour dégazer l&#39;eau tout au long de l&#39;expérience si pas fonctionner pourplusieurs minutes avant de déguster ultrasons. Cette course initiale doit être effectuée pour obtenir un milieu de sonication relativement dégazé et résultats ainsi cohérents au cours des expériences. En outre, les cellules ne doivent pas être exposés à des ultrasons à ou près de l&#39;amplitude maximale lors de l&#39;évaluation de l&#39;efficacité de sonosensibilisateurs, comme la véritable mesure de la sensibilisation serait difficile à évaluer. En utilisant 33% d&#39;amplitude sur le système de kHz 40 est un cadre idéal, car elle produit des dommages importants, mais fournit sonosensibilisateurs amplement d&#39;espace pour démontrer leur efficacité, comme l&#39;a démontré avec MeβCD contre U937 et les cellules THP1 (figure 7). Ces données confirment également que MeβCD sensibilise plusieurs lignes de leucémie à ultrasons à basse fréquence d&#39;une manière dépendant de la dose. Il ya eu un certain nombre d&#39;expériences effectuées avec une fréquence plus élevée de l&#39;ordre de 0,75 MHz à 8 MHz présentant des signes de bulles de cavitation intramembranaires étant généré par ultrasons 17-19. Cependant, questioNS resterait en ce qui concerne le mécanisme exact de la lyse cellulaire induite par échographie-18. Nous avons montré un lien entre la fluidisation du cytosquelette et une sensibilité accrue sonore utilisant ultrasons à basse fréquence 15, un phénomène démontré par d&#39;autres laboratoires 20, 21. En outre, nous avons constaté que les agents de microfilaments perturbateurs tels que la cytochalasine B potentialisent la sensibilité à ultrasons dans la leucémie multiples des lignes, mais pas hHSCs ou les leucocytes, ce qui suggère que 22 l&#39;inhibition de la polymérisation de l&#39;actine peut être un mécanisme de sonosensitizing un intérêt particulier. Nous avons également observé que la vincristine, un agent de microtubules perturbateurs qui inhibe la polymérisation de la tubuline 23, 24, augmente nettement la sensibilité à ultrasons de différents types de leucémie in vitro, y compris la leucémie myéloïde aiguë, la leucémie myéloïde chronique, et la leucémie lymphoïde aiguë. En revanche, les agents du cytosquelette dirigée qui stabilisent les composants du cytosquelette (paclitaxel und jasplakinolide) semble rendre les cellules résistantes à ultrasons, reflétée par la baisse des taux de lyse cellulaire 22. Pris ensemble, ces données soutiennent l&#39;hypothèse que les composants du cytosquelette fluidification des cellules néoplasiques est en effet un facteur important dans l&#39;augmentation de l&#39;efficacité de la SDT 25. La présente étude démontre également que le cholestérol épuisement peut être un autre procédé permettant de potentialiser encore la sensibilité des cellules néoplasiques à ultrasons, que les cellules U937 MeβCD-traitées sont nettement sensibilisés à ultrasons 40 kHz. Alors que nos protocoles de sonication ont démontré une activité antinéoplasique marquée in vitro, la méthode actuelle est limitée à travailler dans la culture et petite vertébrés modèles qui sont en mesure d&#39;adapter dans les flacons utilisés pour ultrasons. Nous avons montré que le poisson zèbre peut être soumis à une sonication par impulsions en toute sécurité à l&#39;aide des ultrasons à basse fréquence (20 kHz), et en ce que sa tolérance aux agents chimiothérapeutiques est quantitativement comparable àdoses tolérées par les modèles murins, ce qui suggère que 26 porteur d&#39;une tumeur du poisson zèbre peuvent être utilisés dans investigations préliminaires pour évaluer l&#39;activité antinéoplasique in vivo de ces protocoles. Néanmoins, l&#39;administration d&#39;agents chimiothérapeutiques avant sonication de modèles de mammifères a été rapporté dans la gamme MHz 1, et ces protocoles peut probablement être étendue à incorporer ultrasons à basse fréquence, ainsi que le cholestérol de l&#39;ozone et des agents du cytosquelette dirigée. Applications cliniques potentielles de cette forme de traitement spécial et différencié peuvent impliquer extracorporelle sonication de sang dans lequel des agents antinéoplasiques sont administrés par voie intraveineuse (iv) avant le sang étant enlevés pour traitement par ultrasons 25. Cette méthode supprime les barrières sonores potentiels posés par l&#39;anatomie humaine, et peut être un moyen efficace pour endommager explosions leucémiques, ainsi que les métastases de tumeurs solides. Il est également possible que le cholestérol de l&#39;ozone et des agents du cytosquelette dirigée pourraitêtre utilisés dans des protocoles de HIFU qui sont déjà en cours d&#39;examen dans la clinique dans une tentative d&#39;améliorer l&#39;efficacité de cette modalité de traitement. Les méthodes décrites dans la présente étude sont capables d&#39;évaluer la valeur de sonosensibilisateurs potentiels, et l&#39;affinement du système peut améliorer cet utilitaire. Cependant, il ya beaucoup de variables à prendre en considération lors de l&#39;utilisation de tels legs ultrasons, y compris la qualité de l&#39;alimentation, des foyers acoustique, et la variation individuelle entre les convertisseurs. Par conséquent, la recherche future se concentrera sur la visualisation des ondes sonores et de comprendre leur influence sur les résultats. SDT a montré pour améliorer la lyse cellulaire in vitro et peut se révéler cliniquement viable si plus des données in vivo dans des modèles de mammifères sont acquis. Des expériences portant sur d&#39;autres caractéristiques potentiellement exploitables de cellules malignes, ainsi que diverses modalités combinés impliquant plusieurs agents et les ultrasons continuent dans notre laboratoire.

Ultrason se réfère à toute onde de pression sonore oscillant avec une fréquence supérieure à la limite supérieure des capacités auditives de l&#39;homme (~ 20 kHz) 1. Ultrasons à basse fréquence dans la plage de 20 à 60 kHz a été utilisée en laboratoire en tant que moyen de génération d&#39;émulsions, pour la préparation d&#39;échantillons cellulaires extraction d&#39;acide nucléique, pour la rupture des tissus, et pour une variété d&#39;autres essais. L&#39;utilité des ultrasons à basse fréquence a également été étendue à l&#39;environnement industriel pour la soudure, nettoyage divers matériaux, et dans le traitement des matériaux. Disponibles dans le commerce générateurs d&#39;ultrasons viennent dans des fréquences allant de 18 à 60 kHz, et à grande échelle des puissances de 100-1,200 W. Bien que les ultrasons est utilisé depuis longtemps dans le cadre clinique pour l&#39;imagerie diagnostique, elle a été appliquée comme une modalité thérapeutique que récemment. Ultrason ≥1 MHz est capable de perturber toute sécurité calculs urinaires (calculs rénaux) et calculs biliaires (pierres dans ee vésicule biliaire ou du foie) chez les patients à réduire les symptômes 2,3. Cette approche appelée lithotripsie extracorporelle par ondes (LEC) est maintenant largement appliquée dans la clinique (plus d&#39;un million de patients sont traités chaque année avec la LEC aux États-Unis à eux seuls 4), et offre une modalité par laquelle la non-invasive briser calculs avec minimum de dommages collatéraux grâce à l&#39;utilisation de appliqué à l&#39;extérieur, concentré, haute intensité des impulsions acoustiques 2-4. En raison des forces uniques directs de cisaillement, ainsi que des bulles de cavitation générées par ultrasons de haute intensité, ces méthodes ont été examinés dans le traitement du cancer pour le traitement du carcinome de la prostate résistant à la castration et l&#39;adénocarcinome du pancréas dans une approche connue sous le nom de haute intensité ultrasons focalisés (HIFU ) 8/5. D&#39;une manière très similaire à la LEC, HIFU utilise plusieurs faisceaux d&#39;ultrasons et les concentre sur une zone focale sélectionnée pour générer des températures de 60 ° C ou higelle par l&#39;utilisation de l&#39;énergie acoustique, ce qui induit une nécrose de coagulation dans le tissu ciblé 5. Bien que d&#39;autres modalités d&#39;ablation thermique existent actuellement (ablation par radiofréquence et micro-ondes ablation), HIFU offre un net avantage sur ces méthodes en ce qu&#39;elle est la seule modalité hyperthermique non-invasive 5. HIFU a atteint des résultats mitigés dans la clinique et est actuellement disponible uniquement dans les essais cliniques 8-11. Cependant, le succès limité qu&#39;il a atteint, et la très prometteuse dans les données acquises in vivo à partir de modèles de mammifères précliniques ont démontré le potentiel des ultrasons dans le traitement du cancer. Dans un effort pour améliorer HIFU, les chercheurs ont tenté de combiner l&#39;échographie avec des agents antinéoplasiques appropriées pour générer une forme de sonochemotherapy. Thérapie sonodynamique (SDT) est un roman modalité de traitement prometteuse qui a démontré une activité antinéoplasique impressionnante à la fois in vitro et <em&gt; Études in vivo 1. Il a été montré que les ultrasons préférentiellement dommages des cellules malignes basé sur la différence de taille entre ces cellules et celles de 1,5 histologie normale. SDT incorpore des agents spécialisés appelés sonosensibilisateurs pour accroître l&#39;étendue des dommages préférentiel exercée par ultrasons contre les cellules néoplasiques. Alors que les applications thérapeutiques de SDT ont été examinées précédemment, des systèmes à ultrasons utilisés emploient généralement plus élevés ultrasons de fréquence (≥1 MHz), et les effets de la faible fréquence kHz échographie n&#39;a pas encore été pleinement explorées. Les basses fréquences de l&#39;échographie sont souvent plus aptes à la production de cavitation inertielle, un phénomène qui se traduit par la destruction des cellules due à l&#39;effondrement rapide des microbulles, provoquant des dommages physico 12-14. Cette différence dans la génération de la cavitation inertielle entre MHz et bas ultrasons kHz a été attribuée au fait que les fréquences d&#39;ondes inférieures permettent de microbulless plus de temps à se développer par diffusion rectifiée dans le cycle d&#39;expansion de la moitié, en produisant par conséquent effondrements les plus violents au cours de la demi-cycle de compression qui suit 12. Nous avons précédemment montré que les cellules leucémiques monocytaires humaines U937 sont sensibles aux ultrasons à basse fréquence (23,5 kHz), et en ce que cette sensibilité peut être nettement augmenté grâce à l&#39;application d&#39;agents antinéoplasiques qui perturbent le cytosquelette 15. En outre, nous avons démontré que les cellules endommagées sont préférentiellement basés sur la taille, avec des cellules plus grandes présentant une sensibilité supérieure à ultrasons. En outre, les cellules humaines normales souches hématopoïétiques (de hHSCs) et les leucocytes dans des tailles de cellules comparables sont beaucoup plus résistants à une sonication que leurs homologues néoplasiques 15, ce qui indique à titre provisoire que ultrasons à basse fréquence peut être utilisé pour endommager de manière préférentielle les cellules malignes en présence de tissu normal. Pour examiner davantage le pilier unique,proprié- de ultrasons à basse fréquence pour une utilisation thérapeutique potentielle, nous avons développé des procédures de nettoyage et de stabilisation pour augmenter l&#39;efficacité et la fiabilité de l&#39;un de nos systèmes de sonication actuelles, le Branson Modèle SLPE 150 W, 40 kHz cellulaire Disrupter, équipé d&#39;un avertisseur sonore de 20 mm équipé en 7,62 cm tasse. En outre, nous avons été en mesure de déterminer précises énergies échantillon de cavitation, ainsi que des formes d&#39;ondes cohérentes et d&#39;amplitude dans la plage de 40 kHz à l&#39;aide d&#39;un mètre de cavitation et l&#39;oscilloscope avec hydrophone. Par raffinage et systématiser nos protocoles, nous avons été en mesure d&#39;établir une cohérence dans nos sonications expérimentales, ce qui nous permet de comparer quantitativement les sensibilités sonores de cellules néoplasiques et normales de différentes lignées histogénétiques. Notre protocole pour le système de 40 kHz est présenté de façon très détaillée pour que les laboratoires intéressés à être capable de réaliser des expériences comparables, et d&#39;évaluer nos conclusions des effets antinéoplasiques provoquées parultrasons à basse fréquence. En outre, nous examinons les effets de doses dépendantes de méthyl-β-cyclodextrine (MeβCD; Figure 1), un agent de cholestérol appauvrissant, sur l&#39;augmentation de la sensibilité des ultrasons U937 et THP1 cellules leucémiques monocytaires humaines.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Iscove&#39;s Modified Dulbecco&#39;s Medium w/ NaHCO3 &#38; 25mM Hepes&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12440079</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B Solution&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A2942&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin 100x Solution&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>12105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Branson SLPe 40kHz Cell Disruptor with 3&#34; (25mm) Cuphorn</td>
			<td>Branson Ultrasonics</td>
			<td>101-063-726</td>
			<td>sonication device</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brisk Heat SDC Benchtop Digital temperature Controler w/ 1000mL Beaker Heater</td>
			<td>Brisk Heat</td>
			<td>SDCJF1A-GBH1000-1</td>
			<td>heater used for temperature control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Z2 Cell Sizer with AccuComp&#174; Software</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>6605700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Rad TC20 Automated Cell Counter</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gentamicin 50mg/mL</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G1397&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue Solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 50mL &#38; 25mL Vented Culture Flasks</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353082</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lonza L-Glutamine 200mM 0.85% NaCl</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>17-605C&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seal-Rite 1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1615-5510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Accuvette ST 25mL Vials and caps</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>&#160;A35473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AccuJet Pro Auto Pipet&#160;</td>
			<td>BrandTech Scientific</td>
			<td>26330</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>USA Scientific 10mL Disposable Serological Pipets</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tip One 100uL and 1000uL Filter Tips</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>1120-1840, 1126-7810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100uL Micropipette&#160;</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851164</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1000uL Micropipette</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>851168</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioRad Dual Chamber Counting Slides</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>145-0015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forma Scientific Dual chamber water jacketed Incubator</td>
			<td>Forma Scientific</td>
			<td>3131</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tektronix&#160; DPO 2002B Digital Phosphor Oscilloscope</td>
			<td>Tektronix</td>
			<td>DPO2002B</td>
			<td>used to measure the ultrasonic waveform</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PPB MegaSonics Model PB-500 Ultrasonic Energy Meter</td>
			<td>PPB Megasonics</td>
			<td>PB-500&#160;</td>
			<td>used to assess the sound intensity in W/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teledyne RESON TC4013-1 Hydrophone</td>
			<td>Teledyne</td>
			<td>TC4013-1&#160;</td>
			<td>connects to the oscilloscope&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheaton 250mL Flasks</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z364827</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20mL Glass Scintillation Vials&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Z190527</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beckman-Coulter Isotonic Saline Solution&#160;</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td>diluent for Z2 counter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform 99%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C2432</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 Proof Anhydrous&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>459836</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mineral Oil</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XTT Cell Proliferation Assay Kit</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>30-1011K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96-Well Microplate Reader</td>
			<td>Cole-Palmer</td>
			<td>&#160;EW-13055-54</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>U937 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL&#173;1593.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>THP1 Human Monocytic Leukemia Cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-202</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation and quantitative analysis of pulsed low frequency ultrasound to determine the sonic sensitivity of untreated and treated neoplastic cells

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In addition, this method can be used in combination with specialized agents known as sonosensitizers to increase the extent of preferential damage exerted by ultrasound against neoplastic cells, an approach referred to as sonodynamic therapy (SDT). The methodology for generating and applying low frequency ultrasound in a preclinical in vitro setting is presented to demonstrate that reproducible cell destruction can be attained in order to examine and compare the effects of sonication on neoplastic and normal cells. This offers a means by which to reliably sonicate neoplastic cells at a level of consistency required for preclinical therapeutic assessment. In addition, the effects of cholesterol-depleting and cytoskeletal-directed agents on potentiating ultrasonic sensitivity in neoplastic cells are discussed in order to elaborate on mechanisms of action conducive to sonochemotherapeutic approaches.

La stabilité du système est primordiale pour obtenir des résultats reproductibles et fiables. Le couple de serrage approprié de 54,23 N. M obtenue accouplement correct du transducteur et la sonotrode 2, ayant la consistance de la forme d&#39;onde en cours d&#39;évaluation à l&#39;aide d&#39;un oscilloscope et hydrophone (figure 3A). La figure 3B représente des mesures à l&#39;intérieur du flacon d&#39;échantillon, et Figure 3C évalue la stabilité dans la corne de tasse. Comme prévu, l&#39;amplitude a été légèrement réduite en raison d&#39;une énergie étant absorbée par le verre. Cependant, la forme d&#39;onde n&#39;a pas été perturbé ou déformé de panneau soit B ou C, ce qui est nécessaire pour la livraison fiable de l&#39;énergie sonique à l&#39;échantillon. Une forme d&#39;onde qui ne semble pas comme une onde sinusoïdale singulière clair indique un transducteur défectueux ou une mauvaise configuration. Cela est exprimé dans la figure 3D qui montre de multiples vagues aberrantes, une absence évidente d&#39;une onde sinusoïdale, et une fréquence de lecture past attend avec un système qui fonctionne correctement. Le compteur de cavitation utilisé pour mesurer l&#39;énergie de cavitation généré (Figure 4) a constaté l&#39;intensité sonore d&#39;être 100-110 W / cm 2 à 33% d&#39;amplitude, et de 125-130 W / cm 2 à 50% d&#39;amplitude. Une fois que le système 40 kHz a été étalonné de manière appropriée et assemblé dans sa totalité (figure 5), la destruction des cellules fiable a été facilement atteint, tel que déterminé par les deux compteurs TC20 et Z2 (figure 6). Comme prévu, plus étendue des dommages aux cellules a été observée dans des populations de cellules traitées aux ultrasons à 50%, plutôt qu&#39;à 33% d&#39;amplitude. Néanmoins, 33% d&#39;amplitude est utile comme point de départ pour détecter les effets potentiels sonore de sensibilisation des agents administrés, car il produit des dommages visibles, mais laisse de la place pour plus de dégâts à détecter lorsque les agents sont appliqués pour évaluer leur potentialisation de la sensibilité à ultrasons. Ceci est démontré dans la figure 7A, où laeffets dépendants de la dose de MeβCD sur potentialiser la sensibilité à ultrasons de cellules U937 sont présentés. Bien que les cellules traitées MeβCD non-traitées aux ultrasons ont été très semblables à la viabilité de cellules non traité aux ultrasons, non traités, la viabilité a diminué de façon marquée au bout de trois impulsions d&#39;une seconde ultrasons 40 kHz a été appliquée. En outre, la diminution de la viabilité après sonication semble avoir été dose-dépendants, comme mM MeβCD 5 produit la plus forte baisse du nombre de cellules, suivie par 1 mM, puis 0,5 mM MeβCD. Des effets similaires sur la viabilité des cellules et l&#39;activité mitochondriale ont été observés dans les cellules U937 et THP1 qui ont été traitées avec des concentrations variables de MeβCD avant sonication, comme évalué avec le kit XTT (figure 7B). Bien que les cellules THP1 semblent être légèrement plus résistantes que les cellules U937 sonique, les deux lignes de leucémie humaine sont endommagées d&#39;une manière dépendant de la dose. Des concentrations plus élevées de MeβCD et plusieurs impulsions d&#39;ultrasons produced la plus basse de réduction de XTT, un dérivé d&#39;orange brillamment colorée soluble à la fois pour les cellules U937 et THP1, correspondant à diminuer la viabilité des cellules et l&#39;activité mitochondriale. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig1.jpg" /> Figure 1. Structure moléculaire du méthyl β-cyclodextrine. (A) la structure complète de méthyl-β-cyclodextrine (MeβCD). (B) est un polymère MeβCD de sept unités récurrentes avec un groupe R soit H ou CH 3. Formule moléculaire: C 56 H 98 O 35. Poids moléculaire = 1331,36. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig2.jpg" /> Figure 2. radiculaire correctement le système à ultrasons de 40 kHz. (A) La corne et le convertisseur sont retirés de la pri tasseou radiculaire. (B) la position de la clé de fente et une clé dynamométrique à leurs positions respectives. (C) Appliquer 54,23 N. M de couple dans le sens des aiguilles d&#39;une montre avant de rebrancher la corne et le convertisseur à la tasse. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig3.jpg" /> Figure 3. L&#39;utilisation d&#39;un oscilloscope pour caractériser la forme d&#39;onde du système à ultrasons. (A) Un oscilloscope avec hydrophone peut être utilisé pour évaluer la cohérence amplitude et la forme d&#39;onde. (B) Un enregistrement avec la Coupe directement au-dessus de la corne à 1,5 cm et fixé à 33% d&#39;amplitude. (C) La forme d&#39;onde en photo ici est d&#39;une lecture acquise lors de l&#39;hydrophone est placé dans le 20 ml flacon à scintillation en verre. Le flacon est positionné à 1,5 cm au-dessus de la corne et de nouveau fixé à 33% d&#39;amplitude. (D) Un oscilloscope o capture d&#39;écransystème fa avec des fréquences aberrantes comme on pourrait s&#39;y attendre avec un système défectueux ou le couplage abusif de l&#39;union de convertisseur de corne. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig4.jpg" /> Figure 4. Utilisation d&#39;un appareil de mesure de la cavitation pour caractériser l&#39;intensité du son du système à ultrasons. Le compteur de cavitation vu ici est utilisé pour représenter l&#39;énergie de cavitation en W / cm 2. Ceci est un instrument très important pour évaluer l&#39;uniformité de l&#39;énergie par rapport à l&#39;échantillon. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig5.jpg" /> Figure 5. Les principales composantes du système à ultrasons de 40 kHz. Le système à ultrasons est représenté avec la corne de tasse ( <strong&gt; A), un appareil de chauffage (B), le convertisseur (C), et un mécanisme de positionnement de l&#39;échantillon (D). Cette conception permet un positionnement facile de l&#39;échantillon (E) ci-dessus la corne (F). <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig6.jpg" /> Figure 6. Les effets de différents niveaux d&#39;amplitude sur la lyse par ultrasons de cellules U937 en utilisant les compteurs TC20 et Z2. Les cellules ont été soniquées avec le désintégrateur 40 kHz cellulaire à 33% d&#39;amplitude (100 à 110 W / cm 2) ou 50% d&#39;amplitude (125 à 130 W / cm 2) en utilisant trois impulsions de 1 s d&#39;ultrasons, avec une distance de seconde entre chaque de ces impulsions. (A) montre l&#39;effet de sonication sur des cellules U937 Une copie d&#39;écran à partir du logiciel de compteur Z2. (B) Les données du compteur TC20 ont été compilées dans un graphique pour démontrer la reproductibilité du résultats. Ces données comprennent le nombre de cellules totales et en direct, ainsi que le bleu trypan évalué la viabilité cellulaire. Bars reflètent l&#39;erreur standard de la moyenne (SEM) pour 4 populations de cellules indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53060/53060fig7.jpg" /> Figure 7. Effets de méthyl β-cyclodextrine sur la potentialisation de la sensibilité à ultrasons de cellules U937 et THP1. (A) cellules U937 ont été traitées avec une concentration variant de MeβCD pendant 30 minutes avant d&#39;être soumis à une sonication avec 40 kHz ultrasons (105 W / cm 2 ) en utilisant trois impulsions de 1 s 1 s espacée de l&#39;autre. Les populations de cellules ont été regroupés en ≥12 um et ≥17 um. (B) des cellules U937 ou THP1 ont de nouveau été traités avec concent variablerations de MeβCD pendant 30 minutes avant d&#39;être soumis à une sonication avec le système de 40 kHz en utilisant des impulsions d&#39;une 3/1 sec 1 sec ultrasons espacés à part. La viabilité cellulaire et l&#39;activité mitochondriale ont été évalués avec le kit XTT. 100 ul de cellules ont été ensemencées par puits dans une plaque à 96 puits de microtitrage à fond plat. La plaque a été incubée pendant 24 heures avant l&#39;addition de solution XTT. Les cellules ont été ensuite incubées pendant 2 h de plus avant de la longueur d&#39;onde a été lu. Bars reflètent SEM pour 4 populations de cellules indépendantes. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53060/53060fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells at JoVE.c

Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells.

Génération et analyse quantitative des pulsé basse fréquence échographie pour déterminer la sensibilité de Sonic traité et non traité cellules néoplasiques

Low frequency ultrasound in the 20 to 60 kHz range is a novel physical modality by which to induce selective cell lysis and death in neoplastic cells. In ...

generation-quantitative-analysis-pulsed-low-frequency-ultrasound-to

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K vues.  Syracuse University. Selective damage of human leukemia cells can be achieved through a novel approach of applying low frequency ultrasound both with and without chemotherapeutic pretreatment of leukemic and normal hematopoietic cells. 

Vidéo: Generation and Quantitative Analysis of Pulsed Low Frequency Ultrasound to Determine the Sonic Sensitivity of Untreated and Treated Neoplastic Cells

Quantitative Analysis of Chromatin Proteomes in Disease

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due to the high percentage of binucleated cells,1 the predominantly heterochromatic state of the DNA, and the non-dividing nature of the cardiomyocyte which renders adult nuclei in a permanent state of interphase.2 Transcriptional regulation during development and disease have been well studied in this organ,3-5 but what remains relatively unexplored is the role played by the nuclear proteins responsible for DNA packaging and expression, and how these proteins control changes in transcriptional programs that occur during disease.6 In the developed world, heart disease is the number one cause of mortality for both men and women.7 Insight on how nuclear proteins cooperate to regulate the progression of this disease is critical for advancing the current treatment options.
Mass spectrometry is the ideal tool for addressing these questions as it allows for an unbiased annotation of the nuclear proteome and relative quantification for how the abundance of these proteins changes with disease. While there have been several proteomic studies for mammalian nuclear protein complexes,8-13 until recently14 there has been only one study examining the cardiac nuclear proteome, and it considered the entire nucleus, rather than exploring the proteome at the level of nuclear sub compartments.15 In large part, this shortage of work is due to the difficulty of isolating cardiac nuclei. Cardiac nuclei occur within a rigid and dense actin-myosin apparatus to which they are connected via multiple extensions from the endoplasmic reticulum, to the extent that myocyte contraction alters their overall shape.16 Additionally, cardiomyocytes are 40% mitochondria by volume17 which necessitates enrichment of the nucleus apart from the other organelles. Here we describe a protocol for cardiac nuclear enrichment and further fractionation into biologically-relevant compartments. Furthermore, we detail methods for label-free quantitative mass spectrometric dissection of these fractions-techniques amenable to in vivo experimentation in various animal models and organ systems where metabolic labeling is not feasible.

Advances in mass spectrometry have allowed the high throughput analysis of protein expression and modification in a host of tissues. Combined with subcellular fractionation and disease models, quantitative mass spectrometry and bioinformatics can reveal new properties in biological systems. The method described herein analyzes chromatin-associated proteins in the setting of heart disease and is readily applicable to other in vivo models of human disease.

Analyse quantitative des Protéomes chromatine dans la maladie

In the nucleus reside the proteomes whose functions are most intimately linked with gene regulation. Adult mammalian cardiomyocyte nuclei are unique due ...

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Médecine

Fetal Echocardiography and Pulsed-wave Doppler Ultrasound in a Rabbit Model of Intrauterine Growth Restriction

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ultrasound and fetal echocardiography. Increasingly, these imaging modalities are being employed clinically to examine cardiac function and assess wellbeing in utero, thereby guiding timing of birth decisions. Here, we used a rabbit model of IUGR that allows analysis of cardiac function in a clinically relevant way. Using isoflurane induced anesthesia, IUGR is surgically created at gestational age day 25 by performing a laparotomy, exposing the bicornuate uterus and then ligating 40-50% of uteroplacental vessels supplying each gestational sac in a single uterine horn. The other horn in the rabbit bicornuate uterus serves as internal control fetuses. Then, after recovery at gestational age day 30 (full term), the same rabbit undergoes examination of fetal cardiac function. Anesthesia is induced with ketamine and xylazine intramuscularly, then maintained by a continuous intravenous infusion of ketamine and xylazine to minimize iatrogenic effects on fetal cardiac function. A repeat laparotomy is performed to expose each gestational sac and a microultrasound examination (VisualSonics VEVO 2100) of fetal cardiac function is performed. Placental insufficiency is evident by a raised pulsatility index or an absent or reversed end diastolic flow of the umbilical artery Doppler waveform. The ductus venosus and middle cerebral artery Doppler is then examined. Fetal echocardiography is performed by recording B mode, M mode and flow velocity waveforms in lateral and apical views. Offline calculations determine standard M-mode cardiac variables, tricuspid and mitral annular plane systolic excursion, speckle tracking and strain analysis, modified myocardial performance index and vascular flow velocity waveforms of interest. This small animal model of IUGR therefore affords examination of in utero cardiac function that is consistent with current clinical practice and is therefore useful in a translational research setting.

We describe examination of fetal cardiac function with contemporary functional fetal echocardiography and fetoplacental Doppler ultrasound using the VisualSonics VEVO 2100 microultrasound in a surgically induced model of intrauterine fetal growth restriction in a rabbit.

L&#39;échocardiographie fœtale et Pulsed-ondes ultrasons Doppler dans un modèle de lapin de la restriction de croissance intra-utérine

Fetal intrauterine growth restriction (IUGR) results in abnormal cardiac function that is apparent antenatally due to advances in fetoplacental Doppler ...

Generation and 3-Dimensional Quantitation of Arterial Lesions in Mice Using Optical Projection Tomography

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating important information on the pathogenesis of lesion formation and the action of novel therapies. Use of atherosclerosis-prone mice, surgical methods of lesion induction, and dietary modification has dramatically improved understanding of the mechanisms that contribute to disease development and the potential of new treatments.
Classically, analysis of lesions is performed ex vivo using 2-dimensional histological techniques. This article describes application of optical projection tomography (OPT) to 3-dimensional quantitation of arterial lesions. As this technique is non-destructive, it can be used as an adjunct to standard histological and immunohistochemical analyses.
Neointimal lesions were induced by wire-insertion or ligation of the mouse femoral artery whilst atherosclerotic lesions were generated by administration of an atherogenic diet to apoE-deficient mice.
Lesions were examined using OPT imaging of autofluorescent emission followed by complementary histological and immunohistochemical analysis. OPT clearly distinguished lesions from the underlying vascular wall. Lesion size was calculated in 2-dimensional sections using planimetry, enabling calculation of lesion volume and maximal cross-sectional area. Data generated using OPT were consistent with measurements obtained using histology, confirming the accuracy of the technique and its potential as a complement (rather than alternative) to traditional methods of analysis.
This work demonstrates the potential of OPT for imaging atherosclerotic and neointimal lesions. It provides a rapid, much needed ex vivo technique for the routine 3-dimensional quantification of vascular remodelling.

Ex vivo analysis of arterial lesions from animal models of cardiovascular disease classically relies on histological and immunohistochemical techniques. These provide 2-dimensional measurements in 3-dimensional lesions. This manuscript describes the generation of arterial lesions for quantitative analysis in 3-dimensions using optical projection tomography.

Génération et quantification 3-Dimensional des lésions artérielles chez la souris utilisant la tomographie optique de projection

The generation and analysis of vascular lesions in appropriate animal models is a cornerstone of research into cardiovascular disease, generating ...

Quantitative Analysis and Characterization of Atherosclerotic Lesions in the Murine Aortic Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have been developed to facilitate the study of the molecular and cellular pathophysiology of this disease. In this manuscript we describe specific techniques for the quantification and characterization of atherosclerotic lesions in the murine aortic sinus and ascending aorta. The advantage of this procedure is that it provides an accurate measurement of the cross-sectional area and total volume of the lesion, which can be used to compare atherosclerotic progression across different treatment groups. This is possible through the use of the valve leaflets as an anatomical landmark, together with careful adjustment of the sectioning angle. We also describe basic staining methods that can be used to begin to characterize atherosclerotic progression. These can be further modified to investigate antigens of specific interest to the researcher. The described techniques are generally applicable to a wide variety of existing and newly created dietary and genetically-induced models of atherogenesis.

We describe procedures to quantify and characterize atherosclerotic lesions in mouse models using precision sectioning of the aortic sinus and ascending aorta combined with histochemical and immunohistochemical analysis.

Analyse quantitative et caractérisation des lésions d&#39;athérosclérose dans le murin aortique Sinus

Atherosclerosis is a disease of the large arteries and a major underlying cause of myocardial infarction and stroke. Several different mouse models have ...

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, the role of beta-cell dysfunction in type 2 diabetes has been clearly established 2. Research progress has required methods for the isolation of pancreatic islets. The protocol of the islet isolation presented here shares many common steps with protocols from other groups, with some modifications to improve the yield and quality of isolated islets from both the wild type and diabetic Leprdb (db/db) mice. A live-cell 2-photon imaging method is then presented that can be used to investigate the control of insulin secretion within islets.

Leprdb Mouse Model of Type 2 Diabetes: Pancreatic Islet Isolation and Live-cell 2-Photon Imaging Of Intact Islets

We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Modèle de souris de diabète de type 2: pancréatique isolement des îlots et des cellules vivantes 2-Photon Imaging d&#39;îlots intacts

Type 2 diabetes is a chronic disease affecting 382 million people in 2013, and is expected to rise to 592 million by 2035 1. During the past 2 decades, ...

High-frequency Ultrasound Imaging of Mouse Cervical Lymph Nodes

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal systems. HFUS has the ability to detect structures as small as 30 &#181;m, a property that has been utilized for visualizing superficial lymph nodes in rodents in brightness (B)-mode. Combining power Doppler with B-mode imaging allows for measuring circulatory blood flow within lymph nodes and other organs. While HFUS has been utilized for lymph node imaging in a number of mouse&#160; model systems, a detailed protocol describing HFUS imaging and characterization of the cervical lymph nodes in mice has not been reported. Here, we show that HFUS can be adapted to detect and characterize cervical lymph nodes in mice. Combined B-mode and power Doppler imaging can be used to detect increases in blood flow in immunologically-enlarged cervical nodes. We also describe the use of B-mode imaging to conduct fine needle biopsies of cervical lymph nodes to retrieve lymph tissue for histological&#160; analysis. Finally, software-aided steps are described to calculate changes in lymph node volume and to visualize changes in lymph node morphology following image reconstruction. The ability to visually monitor changes in cervical lymph node biology over time provides a simple and powerful technique for the non-invasive monitoring of cervical lymph node alterations in preclinical mouse models of oral cavity disease.

This protocol describes the application of high-frequency ultrasound (HFUS) for imaging mouse cervical lymph nodes. This technique optimizes visualization and quantification of cervical lymph node morphology, volume and blood flow. Image-guided biopsy of cervical lymph nodes and processing of lymph tissue for histological evaluation is also demonstrated.

Haute fréquence imagerie par ultrasons de souris cervicales ganglions lymphatiques

High-frequency ultrasound (HFUS) is widely employed as a non-invasive method for imaging internal anatomic structures in experimental small animal ...

Integration of Wet and Dry Bench Processes Optimizes Targeted Next-generation Sequencing of Low-quality and Low-quantity Tumor Biopsies

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using bioinformatics pipelines (&#34;dry bench&#34;). Both elements are essential to produce accurate and reliable results, which are particularly critical for clinical laboratories. Targeted NGS technologies have increasingly found favor in oncology applications to help advance precision medicine objectives, yet the methods often involve disconnected and variable wet and dry bench workflows and uncoordinated reagent sets. In this report, we describe a method for sequencing challenging cancer specimens with a 21-gene panel as an example of a comprehensive targeted NGS system. The system integrates functional DNA quantification and qualification, single-tube multiplexed PCR enrichment, and library purification and normalization using analytically-verified, single-source reagents with a standalone bioinformatics suite. As a result, accurate variant calls from low-quality and low-quantity formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) and fine-needle aspiration (FNA) tumor biopsies can be achieved. The method can routinely assess cancer-associated variants from an input of 400 amplifiable DNA copies, and is modular in design to accommodate new gene content. Two different types of analytically-defined controls provide quality assurance and help safeguard call accuracy with clinically-relevant samples. A flexible &#34;tag&#34; PCR step embeds platform-specific adaptors and index codes to allow sample barcoding and compatibility with common benchtop NGS instruments. Importantly, the protocol is streamlined and can produce 24 sequence-ready libraries in a single day. Finally, the approach links wet and dry bench processes by incorporating pre-analytical sample quality control results directly into the variant calling algorithms to improve mutation detection accuracy and differentiate false-negative and indeterminate calls. This targeted NGS method uses advances in both wetware and software to achieve high-depth, multiplexed sequencing and sensitive analysis of heterogeneous cancer samples for diagnostic applications.

An integrated system for targeted next-generation sequencing of oncology specimens is described. This cross-platform system is optimized for low-quality and low-quantity tumor biopsies, accommodates low DNA inputs, includes well-characterized multi-variant controls, and features a novel variant caller that is informed by quantitative pre-analytical quality control measures.

Intégration de Wet and Processes Banc sec Optimise ciblés Séquençage de nouvelle génération de faible qualité et à faible quantité biopsies de tumeurs

All next-generation sequencing (NGS) procedures include assays performed at the laboratory bench (&#34;wet bench&#34;) and data analyses conducted using ...

Injection of Syngeneic Murine Melanoma Cells to Determine Their Metastatic Potential in the Lungs

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis. Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or prevention are lacking. We report a method for the establishment of pulmonary metastases in mice, useful for the study of this phenomenon. Tail vein injection of B57BL/6J mice with B16-BL6 is among the most used models for melanoma metastases. Some of the circulating tumor cells establish themselves in the lungs of the mouse, creating "experimental" metastatic foci. With this model it is possible to measure the relative effects of therapeutic agents on the development of cancer metastasis. The difference in enumerated lung foci between treated and untreated mice indicates the efficacy of metastases neutralization. However, prior to the investigation of a therapeutic agent, it is necessary to determine an optimal number of injected B16-BL6 cells for the quantitative analysis of metastatic foci. Injection of too many cells may result in an overabundance of metastatic foci, impairing proper quantification and overwhelming the effects of anti-cancer therapies, while injection of too few cells will hinder the comparison between treated and controls.

Metastasis plays a profound role in the virulence of cancer, accounting for an estimated 90% of deaths. We report a protocol for a metastatic melanoma model in mice that is useful for determining the efficacy of therapeutic agents against this clinical phenomenon.

L&#39;injection de cellules syngéniques murin de mélanome pour déterminer leur potentiel métastatique dans les Poumons

Approximately 90% of human cancer deaths are linked to metastasis.  Despite the prevalence and relative harm of metastasis, therapeutics for treatment or ...

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing continuous remodeling with the competing activity of osteoblasts, which produce the new bone matrix, and osteoclasts, whose function is to eliminate mineralized bone. [18F]-NaF is a positron emission tomography (PET) radiotracer that enables visualization of bone metabolism. [18F]-NaF is chemically absorbed into hydroxyapatite in the bone matrix by osteoblasts and can thus noninvasively detect osteoblastic activity, which is occult to conventional imaging techniques. Kinetic modeling of dynamic [18F]-NaF-PET data provides detailed quantitative measures of bone metabolism. Conventional semi-quantitative PET data, which utilizes standardized uptake values (SUVs) as a measure of radiotracer activity, is referred to as a static technique due to its snapshot of tracer uptake in time.&#160; Kinetic modeling, however, utilizes dynamic image data where tracer levels are continuously acquired providing tracer uptake temporal resolution. From the kinetic modeling of dynamic data, quantitative values like blood flow and metabolic rate (i.e., potentially informative metrics of tracer dynamics) can be extracted, all with respect to the measured activity in the image data. When combined with dual modality PET-MRI, region-specific kinetic data can be correlated with anatomically registered high-resolution structural and pathologic information afforded by MRI. The goal of this methodological manuscript is to outline detailed techniques for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data. The lumbar facet joint is a common site of degenerative arthritis disease and a common cause for axial low back pain.&#160; Recent studies suggest [18F]-NaF-PET may serve as a useful biomarker of painful facetogenic disease.&#160; The human lumbar facet joint will, therefore, be used as a prototypical region of interest for dynamic [18F]-NaF-PET-MRI analysis in this manuscript.

Quantitative [18F]-Naf-PET-MRI Analysis for the Evaluation of Dynamic Bone Turnover in a Patient with Facetogenic Low Back Pain

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. We present detailed methodologies for performing and analyzing dynamic [18F]-NaF-PET-MRI data in a patient with facetogenic low back pain using the lumbar facet joints as a prototypical region of interest.

Analyse quantitative [18F]-Naf-PET-MRI pour l'évaluation du chiffre d'affaires dynamique d'os dans un patient présentant la douleur lombaire facetogenic

Imaging techniques that reflect dynamic bone turnover may aid in characterizing a wide range of bone pathologies. Bone is a dynamic tissue undergoing ...

Ultrasound Imaging of the Thoracic and Abdominal Aorta in Mice to Determine Aneurysm Dimensions

Contemporary high-resolution ultrasound instruments have sufficient resolution to facilitate the measurement of mouse aortas. These instruments have been widely used to measure aortic dimensions in mouse models of aortic aneurysms. Aortic aneurysms are defined as permanent dilations of the aorta, which occur most frequently in the ascending and abdominal regions. Sequential measurements of aortic dimensions by ultrasound are the principal approach for assessing the development and progression of aortic aneurysms in vivo. Although many reported studies used ultrasound imaging to measure aortic diameters as a primary endpoint, there are confounding factors, such as probe position and cardiac cycle, that may impact the accuracy of data acquisition, analysis, and interpretation. The purpose of this protocol is to provide a practical guide on the use of ultrasound to measure the aortic diameter in a reliable and reproducible manner. This protocol introduces the preparation of mice and instruments, the acquisition of appropriate ultrasound images, and data analysis.

Ultrasound imaging has become a common modality to determine the luminal dimensions of thoracic and abdominal aortic aneurysms in mice. This protocol describes the procedure to acquire reliable and reproducible two-dimensional ultrasound images of the ascending and abdominal aorta in mice.

Échographie de l’aorte thoracique et abdominale chez les souris pour déterminer les Dimensions de l’anévrisme

Contemporary high-resolution ultrasound instruments have sufficient resolution to facilitate the measurement of mouse aortas. These instruments have been ...