Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (KFO 196 &quot;Signaltransduktion bei adaptativen und maladaptiven kardialen Rénovation-Prozessen&quot;, FR 1638 / 1-2) et par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire, une partie des centres de recherche en santé allemand , qui est un BMBF (ministère fédéral allemand de l&#39;Éducation et de la Recherche) initiative).

REMARQUE: Les étapes de base de la procédure d&#39;isolement sont présentées sur la figure 1 Toutes les étapes sont décrites en détail dans le protocole suivant.. Isolement du muscle papillaire, le montage dans la chambre de bain d&#39;organe, l&#39;acquisition et l&#39;analyse est effectuée dans un laps de temps consécutif et obligatoire. Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées en conformité avec la législation allemande sur la protection des animaux et ont été approuvés par le Conseil de l&#39;Université de Heidelberg examen éthique. 1. Préparation du Instrumentation <ol><li> Pour la contractilité mesures utilisent une configuration à plusieurs chambres de bain d&#39;organe. Les composants d&#39;une installation de bain d&#39;organe ex vivo de la contractilité sont présentés sur la figure 2. NOTE: Pour minimiser la quantité de temps entre la préparation du muscle papillaire et le début du protocole expérimental, mis en place l&#39;équipement et préparer des tampons avant de recueillir tissue.This expérimentales provides la plus grande quantité de temps que le tissu reste viable pour mener des expériences. </li><li> Démarrez l&#39;équipement informatique et l&#39;acquisition de données. Allumez bain d&#39;organe thermique (préréglé à 32 ° C) et de permettre aux unités de température préréglée. </li><li> Préparer le matériel d&#39;acquisition. Commencer l&#39;enregistrement des données, comme mentionné dans le manuel du logiciel. </li><li> Vérifier et procéder à l&#39;étalonnage (si nécessaire) sur chaque canal et tous les canaux zéro pour normaliser le signal électrique fourni par le transducteur de force respective (associé à ce canal) à une 2-g force fournie par un poids certifié. </li><li> Ouvrir l&#39;alimentation de gaz (95% d&#39;O 2/5% de CO 2) à des chambres de bain d&#39;organes. De gaz sans interruption toutes les chambres pendant les mesures de protocole entières. </li></ol> 2. Préparation des tampons et des solutions physiologiques <ol><li> Préparer une solution de tampon de Krebs-Henseleit à parvenir à des concentrations finales de 119 mM de NaCl; 25 mM de NaHCO 3; KCl 4,6 mM; Glucose 11mm; 1 mM de Na-pyruvate; 1,5 mM de CaCl 2; 1,64 mM MgSO4; MM KH 1.18 2 PO 4 et ajuster le pH à 7,4 (voir le tableau 1 solution physiologique). </li><li> Préparer une solution tampon de Krebs-Henseleit séparée à utiliser lors de l&#39;isolement comme décrit dans l&#39;étape 2.1 avec supplémentaire monoxime 30 mM 2,3-Butanedione (BDM) et 50 IE héparine / ml. Refroidir à la solution à 4 ° C (voir tableau 1 Préparation de solution). Pour la simulation de l&#39;ischémie, l&#39;ischémie-préparer une solution comme décrit dans le Tableau 1. </li><li> Pour le protocole du Ca 2 + - dépendante de la contractilité, Ca2 + ajouter à la solution de tampon de Krebs-Henseleit à la concentration finale requise. REMARQUE: préparer ces solutions directement avant son utilisation et Gass avec carbogène pour éviter la précipitation du carbonate de calcium. Préchauffer la solution à 32 ° C avant utilisation. </li></ol> 3. Préparation du tube et Dissection gazage vaisselle utilisée au cours de la procédure Excision papillaire <ol><li> Branchez un gaz doucechanter tube (diamètre extérieur de 2-4 mm) pour le raccordement de gaz (100% d&#39;oxygène, carbogène alternativement) avec un expert de travail. </li><li> Créer un anneau fermé du tube de gazage montage à l&#39;intérieur du plat de dissection. Perforer le tube de gazage à plusieurs reprises que un bouillonnement continue est assurée. Ce tube de gazage peut être utilisé plusieurs fois. </li><li> Préparer plat de dissection avec un élastomère de silicone en bas (0,5 cm d&#39;épaisseur), de sorte que les repères peuvent être bloqués dedans. Ce plat peut être utilisé plusieurs fois. </li></ol> 4. Isolement de gauche antérieur muscle papillaire de souris REMARQUE: Avant de commencer l&#39;isolement du muscle papillaire, vérifiez que les conduites de gaz sont clairement des blocages. <ol><li> Préparer la configuration du bain organe tel que mentionné dans la section 3.1 de protocole avant de commencer la préparation des muscles papillaires. Préparer des solutions à tous les jours de l&#39;expérience. </li><li> Sacrifiez la souris (âgé d&#39;environ 8-12 semaines) par dislocation cervicale according de travail d&#39;experts et des directives institutionnelles. </li><li> Fix l&#39;animal en position dorsale en fixant les pattes de devant et postérieurs pattes sur une planche de dissection, ouvrez le latéral du thorax des deux côtés en coupant à travers les côtes avec des ciseaux d&#39;os pointus, puis couper la membrane avec une coupe transversale. Retirer le péricarde. Maintenant, le coeur et l&#39;aorte sont accessibles. </li><li> Fixer le coeur avec le forceps émoussé sur le tronc vasculaire à proximité du cœur et de séparer le cœur rapidement avec des ciseaux dans les poumons et les tissus environnants. </li><li> Transférer le cœur battant d&#39;une boîte de Pétri remplie de solution de préparation refroidie gazés avec l&#39;oxygène (étape 2.2). Laisser le coeur à battre et stimuler les contractions cardiaques doucement par l&#39;intermédiaire de toucher la pointe du cœur avec une pince. </li><li> Dès le cœur est complètement exsangue, le transférer vers le plat de dissection rempli de solution de préparation refroidi (étape 2.2) et gazés avec O 2. De cette étape sur l&#39;utilisation d&#39;un stéréomicroscope. </li><li> Fixer la HEAtempérature ambiante avec une petite aiguille à travers le ventricule droit afin que le cœur est vu de dorsale (ventricule droit est situé sur le côté droit de la vue de l&#39;opérateur). </li><li> L&#39;aide de ciseaux de microchirurgie séparent les deux oreillettes sur le niveau auriculo-ventriculaire, couper le tissu reliant des ventricules et les jeter. Effectuer une coupe à travers la paroi ventriculaire de la valve niveau AV à la pointe du cœur en évitant toute pression mécanique. </li><li> Ouvrez le ventricule et fixer la paroi libre du côté gauche avec une pince, ayant ainsi un regard à la fois de gauche muscles papillaires ventriculaires. </li><li> Légèrement couper le latéral du tissu ventriculaire sur les deux côtés du muscle papillaire antérieur gauche en préservant une partie de la voile valvulaire sur la préparation de muscle papillaire et éviter de toucher ou de l&#39;étirement du muscle papillaire autant que possible. Disséquer le reste tissu de la paroi ventriculaire du muscle papillaire. </li><li> Joindre des fils de soie (7/0, métrique 0,5) sur les deux côtés de la préparation de muscle papillairearation, l&#39;un sur la voile valvulaire et l&#39;autre sur la partie musculaire. Fixer la préparation dans la chambre de bain d&#39;organe rempli de solution de bain d&#39;organe et gazés avec du carbogène, en tant que température de 32 ° C est recommandée. </li></ol> 5. équilibration et la stimulation du muscle papillaire <ol><li> Stimuler la préparation de muscle papillaire avec des impulsions rectangulaires (durée de 2 ms et courant de 100 mA) à la fréquence de stimulation de 1 Hz immédiatement après la fixation dans le bain d&#39;organe. </li><li> Assurer un changement fréquent de la solution de bain d&#39;organe, soit par le changement continu ou par le changement d&#39;emploi fréquents (toutes les 5 min) en fonction de la configuration du type de bain d&#39;organe utilisé. </li><li> Augmentez progressivement la prétention jusqu&#39;à ce qu&#39;une force de contraction maximale dans atteint. Force de contraction maximale est atteinte lorsque l&#39;augmentation de la prétention est pas suivie d&#39;une autre augmentation de la force de la secousse. </li><li> Après 45-60 minutes d&#39;équilibration, démarrer le protocole expérimental. </li></ol> REMARQUE: Le protocole expérimental décrit ci-dessous comprend manœuvres standards pour caractériser la contractilité cardiaque dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Dans la section représentant nous décrivons ces protocoles en détail montrant également des résultats représentatifs (voir également le tableau 2). <ol><li> L&#39;enregistrement et l&#39;analyse des protocoles expérimentaux <ol><li> Pour l&#39;enregistrement, utilisez un logiciel approprié avec une résolution temporelle adéquate (≥ taux d&#39;acquisition de 1 kHz). </li><li> Analyser les paramètres y compris la force de la secousse d&#39;amplitude (hauteur), temps au pic de tension (TTP) et la moitié maximal temps de relaxation (R 50 / TFall, respectivement), comme mentionné dans le programme de logiciel (comme par exemple le graphique 5.5 de ADInstruments, voir la figure 4). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Endoh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+Ca2++signaling+and+Ca2++sensitizers.">Cardiac Ca2+ signaling and Ca2+ sensitizers.</a> Circ J. 12 (12), 1915-1925 (2008).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+signaling+in+cardiac+myocytes.">Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes.</a> Annu Rev Physiol. 70, 23-49 (2008).</li><li>Bers, D., Despa, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Na/K-ATPase&#8212;an+integral+player+in+the+adrenergic+fight-or+flight+response.">Na/K-ATPase&#8212;an integral player in the adrenergic fight-or flight response.</a> Trends Cardiovasc Med. 19, 111-118 (2009).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+excitation&#8211;contraction+coupling.">Cardiac excitation&#8211;contraction coupling.</a> Nature. 415, 198-205 (2002).</li><li>Pieske, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=al.+Ca(2+)-dependent+and+Ca(2+)-independent+regulation+of+contractility+in+isolated+human+myocardium.">al. Ca(2+)-dependent and Ca(2+)-independent regulation of contractility in isolated human myocardium.</a> Basic Res Cardiol. 92, 75-86 (1997).</li><li>Corbin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sildenafilcitrate+does+not+affect+cardiac+contractility+in+human+or+dog+heart.">Sildenafilcitrate does not affect cardiac contractility in human or dog heart.</a> Curr Med ResOpin. 19 (8), 747-752 (2003).</li><li>Romero-Vecchione, E., Vasquez, J., Rosa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+negative+inotropic+effect+of+cocaine+in+rat+ventricle+strip.">Direct negative inotropic effect of cocaine in rat ventricle strip.</a> Acta Cient Venez. 47 (1), 17-23 (1996).</li><li>N&#228;bauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Positive+inotropic+effects+in+isolated+ventricular+myocardium+from+nonfailing+and+terminally+failing+human+hearts.">Positive inotropic effects in isolated ventricular myocardium from nonfailing and terminally failing human hearts.</a> Eur J Clin Invest. 18 (6), 600-606 (1988).</li><li>Gao, W. D., Perez, N. G., Marban, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+and+contractile+activation+in+intact+mouse+cardiac+muscle.">Calcium cycling and contractile activation in intact mouse cardiac muscle.</a> J Physiol. 507, 175-184 (1998).</li><li>Bluhm, W. F., Kranias, E. G., Dillmann, W. H., Meyer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholamban:+a+major+determinant+of+the+cardiac+force-frequency+relationship.">Phospholamban: a major determinant of the cardiac force-frequency relationship.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278 (1), H249-H255 (2000).</li><li>Redel, A., Baumgartner, W., Golenhofen, K., Drenckhahn, D., Golenhofen, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+activity+and+force-frequency+relationship+of+isolated+mouse+papillary+muscle:+effects+of+extracellular+calcium+concentration,+temperature+and+contraction+type.">Mechanical activity and force-frequency relationship of isolated mouse papillary muscle: effects of extracellular calcium concentration, temperature and contraction type.</a> Pflugers Arch. 445 (2), 297-304 (2002).</li><li>Uhl, S., Mathar, I., Vennekens, R., Freichel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adenylyl+cyclase-mediated+effects+contribute+to+increased+Isoprenaline-induced+cardiac+contractility+in+TRPM4+deficient+mice.">Adenylyl cyclase-mediated effects contribute to increased Isoprenaline-induced cardiac contractility in TRPM4 deficient mice.</a> JMCC. 74, 307-317 (2014).</li><li>Allen, D. G., Jewell, B. R., Wood, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+contractility+of+mammalian+myocardium+at+low+rates+of+stimulation.">Studies of the contractility of mammalian myocardium at low rates of stimulation.</a> J Physiol. 254 (1), 1-17 (1976).</li><li>Pieske, B., Maier, L. S., Schmidt-Schweda, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoplasmic+reticulum+Ca2++load+in+human+heart+failure.">Sarcoplasmic reticulum Ca2+ load in human heart failure.</a> Basic Res Cardiol. 97, 163-171 (2002).</li><li>Koch-Weser, J., Blinks, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Influence+of+the+Interval+between+Beats+on+Myocardial+Contractility.">The Influence of the Interval between Beats on Myocardial Contractility.</a> Pharmacol Rev. 15, 601-652 (1963).</li><li>Bocalini, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocardial+remodeling+after+large+infarcts+in+rat+converts+post+rest-potentiation+in+force+decay.">Myocardial remodeling after large infarcts in rat converts post rest-potentiation in force decay.</a> Arq Bras Cardiol. 98 (3), 243-251 (2012).</li><li>Juggi, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ischemia-reperfusion+on+the+post-rest+inotropy+of+isolated+perfused+rat+heart.">Effect of ischemia-reperfusion on the post-rest inotropy of isolated perfused rat heart.</a> J Cell Mol Med. 6 (4), 621-630 (2002).</li><li>Lakatta, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beyond+Bowditch:+the+convergence+of+cardiac+chronotropy+and+inotropy.">Beyond Bowditch: the convergence of cardiac chronotropy and inotropy.</a> Cell Calcium. 35 (6), 629-624 (2004).</li><li>Taylor, D. G., Parilak, L. D., LeWinter, M. M., Knot, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+rat+left+ventricle+force+and+Ca2++-frequency+relationships:+similarities+to+dog+and+human.">Quantification of the rat left ventricle force and Ca2+ -frequency relationships: similarities to dog and human.</a> Cardiovasc Res. 61 (1), 77-86 (2004).</li><li>Schmidt, U., Hajjar, R. J., Gwathmey, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+force-interval+relationship+in+human+myocardium.">The force-interval relationship in human myocardium.</a> J Card Fail. 1 (4), 311-321 (1995).</li><li>Rossman, E. I., Petre, R. E., Chaudhary, K. W., Piacentino, V. 3. r. d., Janssen, P. M., Gaughan, J. P., Houser, S. R., Margulies, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abnormal+frequency-dependentresponses+represent+the+pathophysiologic+signature+of+contractile+failure+inhuman+myocardium.">Abnormal frequency-dependentresponses represent the pathophysiologic signature of contractile failure inhuman myocardium.</a> JMCC. 36 (1), 33-42 (2004).</li><li>Moran, A. E., Forouzanfar, M. H., Roth, G. A., Mensah, G. A., Ezzati, M., Murray, C. J., Naghavi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+trends+in+ischemic+heart+disease+mortality+in+21+world+regions,+1980+to+2010:+the+Global+Burden+of+Disease+2010+stud.">Temporal trends in ischemic heart disease mortality in 21 world regions, 1980 to 2010: the Global Burden of Disease 2010 stud.</a> Circulation. 129 (14), 1483-1492 (1980).</li><li>Lee, J. A., Allen, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+intracellular+free+calcium+concentration+during+long+exposures+to+simulated+ischemia+in+isolated+mammalian+ventricular+muscle.">Changes in intracellular free calcium concentration during long exposures to simulated ischemia in isolated mammalian ventricular muscle.</a> Circ Res. 71 (1), 58-69 (1992).</li></ol>

Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrentes.

Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode pour enquêter sur la contractilité du muscle papillaire murin in vitro qui peut être utilisée pour répondre à plusieurs questions scientifiques liées à la physiologie du cœur et de la pathologie chez la souris ainsi que pour soutenir l&#39;analyse des lignées transgéniques et la découverte de nouvelles approches pharmaceutiques pour traiter les dysfonctionnements cardiaques. Nous illustrons l&#39;utilisation de cette méthode pour évaluer les proprié...

L&#39;enquête de protéines comme les canaux ioniques référence leur rôle pour la contractilité cardiaque est essentiel de découvrir différents mécanismes pathologiques et d&#39;établir de nouvelles stratégies thérapeutiques pour les maladies cardiaques telles que l&#39;ischémie et de l&#39;insuffisance cardiaque. La fonction contractile des cardiomyocytes de mammifères est connue pour être modulée par divers canaux ioniques, les transporteurs et d&#39;autres protéines. Potentiel d&#39;action activation de sarcolemmique de type L dépendant de la tension évoquée canaux Ca2 + conduit à influx de Ca 2+ de l&#39;espace extracellulaire et par la suite à Ca 2+ induite par Ca 2+ de presse (CICR) 1, ce qui déclenche la contraction cellulaire 2. Ca 2+ -signaling joue un rôle central dans la contractilité cardiaque et l&#39;adaptation au stress physiologique ou pathologique. Catécholamines activent les récepteurs ß-adrénergiques cardiaques, stimulant ainsi l&#39;adénylcyclase (AC) qui synthétise l&#39;AMPc. Étant activé, protein kinase A (PKA) phosphoryle différentes protéines associées intracellulaires et membranaires comme de type L canaux Ca 2+, phospholamban et récepteurs de la ryanodine résultant dans la modification de Ca 2 + transitoires et la contractilité cardiaque 1,3,4. cAMP est dégradée par la phosphodiesterase (PDE). L&#39;activation des récepteurs couplés à Gs autres que les ß-adrénergiques conduit également à l&#39;accumulation de AMPc. La technique des mesures de contractilité dans des bandes isolées musculaires ventriculaires est bien établie pour les grandes espèces de mammifères 5-8. Sur la base de la possibilité de ciblage de gène chez la souris, il est important d&#39;établir des méthodes pour analyser la physiologie cardiaque murin. Cependant, les données existantes sur les propriétés physiologiques des préparations musculaires isolées chez des souris diffèrent en fonction des conditions expérimentales 9-12. Le procédé décrit est utilisé pour analyser la contractilité cardiaque ventriculaire gauche papillaire de pré musculaireparations in vitro. Etude de la contractilité cardiaque est réalisé en l&#39;absence d&#39;influences modifiant la contractilité cardiaque in vivo, comme la pression sanguine, la stimulation neuro-humoral et le stress physique ou métabolique. Le taux de la préparation traitance musculaire battant peut être rigoureusement défini et modifiées arbitrairement. Twitch force peut être analysée dans le contexte des stimuli spécifiques tels que la concentration de calcium, le battement de fréquence ou de la température. En outre, cette méthode peut être utilisée pour étudier les différents composants de la voie de signalisation et de comparer la performance cardiaque de modèles de souris génétiquement modifiées par le contrôle des conditions expérimentales mentionnées ci-dessus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium bicarbonate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5761&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9434&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium pyruvate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P5280&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">223506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td align="right">230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium phosphate monobasic</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P 5655</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2,3-Butanedione monoxime</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>B0753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forskolin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F3917</td>
			<td>Hazard statement H312, solve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-?Isobutyl-?1-?methylxanthine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5879</td>
			<td>Hazard statement H 302, solve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoprenaline hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5627</td>
			<td>Hazard statement H 315-H319-H335</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Heparine 250.000 IE/10ml</td>
			<td>ratiopharm</td>
			<td>PZN 3874685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine dihydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7250</td>
			<td>Hazard statement H 315-H 317-H319- H334-H335</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

contractility measurements on isolated papillary muscles for the investigation of cardiac inotropy in mice

Muscle papillaire isolé de coeurs de souris adultes peut être utilisée pour étudier la contractilité cardiaque au cours des différentes physiologiques / conditions pathologiques. Les caractéristiques contractiles peuvent être évaluées indépendamment des influences externes telles que le tonus vasculaire ou le statut neurohumoral. Il représente une approche scientifique entre des mesures de cellules individuelles avec les myocytes cardiaques isolés et dans les études in vivo comme l&#39;échocardiographie. Ainsi, des préparations de muscle papillaire servent comme un excellent modèle pour l&#39;étude de la physiologie cardiaque / physiopathologie et peut être utilisé pour des enquêtes comme la modulation par des agents pharmacologiques ou l&#39;exploration des modèles animaux transgéniques. Ici, nous décrivons un procédé pour isoler le muscle papillaire antérieur gauche de souris pour étudier la contractilité cardiaque dans une installation de bain d&#39;organe. Contrairement à la préparation d&#39;une bande de muscle isolé de la paroi ventriculaire, le muscle papillaire peut être préparé in toto sans endommager le tissu musculairee sévèrement. La configuration du bain d&#39;organe se compose de plusieurs chambres de bain d&#39;organe électrodes-équipée, gazés et à température contrôlée. Le muscle papillaire isolé est fixé dans la chambre de bain d&#39;organe et stimulé électriquement. La force de contraction évoquée est enregistrée en utilisant un transducteur et des paramètres tels que la pression se contracter amplitude de la force et de contraction cinétique sont analysés. Différents protocoles expérimentaux peuvent être réalisées pour étudier le calcium et dépendant de la fréquence ainsi que la contractilité courbes dose-réponse des agents contractiles tels que les catecholamines ou d&#39;autres produits pharmaceutiques. En outre, des conditions pathologiques comme l&#39;ischémie aiguë peuvent être simulées.

Le protocole de ce manuscrit pour les mesures de contractilité murins isolés de préparations de muscle papillaire est accordé sur les conditions optimales pour obtenir des résultats expérimentaux reproductibles dans des conditions physiologiques. Pour définir les conditions expérimentales optimales nous avons effectué des expériences pilotes variant la température du bain d&#39;organe et de la concentration de calcium extracellulaire (voir aussi 12). Le protocole décrit ici a été réalisée avec...

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Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Murine ventriculaire gauche muscle papillaire peut être utilisée pour étudier la contractilité cardiaque in vitro. Cet article décrit en détail l&#39;isolement et des protocoles expérimentaux pour étudier les caractéristiques contractiles cardiaques.

Mesures de contractilité des muscles papillaires isolés sur pour l&#39;Investigation des inotropie cardiaque chez la souris

Papillary muscle isolated from adult mouse hearts can be used to study cardiac contractility during different physiological/pathological conditions. The ...

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Research

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Biology

14.9K vues.  Universität Heidelberg.  Murine ventriculaire gauche muscle papillaire peut être utilisée pour étudier la contractilité cardiaque in vitro. Cet article décrit en détail l'isolement et des protocoles expérimentaux pour étudier les caractéristiques contractiles cardiaques. 

Vidéo: Contractility Measurements on Isolated Papillary Muscles for the Investigation of Cardiac Inotropy in Mice

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

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Biologie

Bioengineering Human Microvascular Networks in Immunodeficient Mice

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks in vivo. In this regard, the search for experimental models to build blood vessel networks in vivo is of utmost importance 1. The feasibility of bioengineering microvascular networks in vivo was first shown using human tissue-derived mature endothelial cells (ECs) 2-4; however, such autologous endothelial cells present problems for wide clinical use, because they are difficult to obtain in sufficient quantities and require harvesting from existing vasculature. These limitations have instigated the search for other sources of ECs. The identification of endothelial colony-forming cells (ECFCs) in blood presented an opportunity to non-invasively obtain ECs 5-7. We and other authors have shown that adult and cord blood-derived ECFCs have the capacity to form functional vascular networks in vivo 7-11. Importantly, these studies have also shown that to obtain stable and durable vascular networks, ECFCs require co-implantation with perivascular cells. The assay we describe here illustrates this concept: we show how human cord blood-derived ECFCs can be combined with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs) as a single cell suspension in a collagen/fibronectin/fibrinogen gel to form a functional human vascular network within 7 days after implantation into an immunodeficient mouse. The presence of human ECFC-lined lumens containing host erythrocytes can be seen throughout the implants indicating not only the formation (de novo) of a vascular network, but also the development of functional anastomoses with the host circulatory system. This murine model of bioengineered human vascular network is ideally suited for studies on the cellular and molecular mechanisms of human vascular network formation and for the development of strategies to vascularize engineered tissues.

Here, we describe a methodology to deliver human cord blood-derived endothelial colony-forming cells (ECFCs) and bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), embedded in a collagen/fibronectin gel, subcutaneously into immunodeficient mice. This cell/gel combination generates a human vascular network that connects with the mouse vasculature.

Bioingénierie de l&#39;homme Réseaux microvasculaires chez des souris immunodéficientes

The future of tissue engineering and cell-based therapies for tissue regeneration will likely rely on our ability to generate functional vascular networks ...

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

The isolated microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of factors that control vessel diameter, and thus, perfusion resistance1-5. This is a classic experimental preparation that was, in large measure, initially described by Uchida et al.15 several decades ago. This initial description provided the basis for the techniques that was extensively modified and enhanced, primarily in the laboratory of Dr. Brian Duling at the University of Virginia6-8, and we present a current approach in the following pages. This preparation will specifically refer to the gracilis arteriole in a rat as the microvessel of choice, but the basic preparation can readily be applied to vessels isolated from nearly any other tissue or organ across species9-13. Mechanical (i.e., dimensional) changes in the isolated microvessels can easily be evaluated in response to a broad array of physiological (e.g., hypoxia, intravascular pressure, or shear) or pharmacological challenges, and can provide insight into mechanistic elements comprising integrated responses in an intact, although ex vivo, tissue. The significance of this method is that it allows for facile manipulation of the influences on the integrated regulation of microvessel diameter, while also allowing for the control of many of the contributions from other sources, including intravascular pressure (myogenic), autonomic innervation, hemodynamic (e.g., shear stress), endothelial dependent or independent stimuli, hormonal, and parenchymal influences, to provide a partial list. Under appropriate experimental conditions and with appropriate goals, this can serve as an advantage over in vivo or in situ tissue/organ preparations, which do not readily allow for the facile control of broader systemic variables. 
The major limitation of this preparation is essentially the consequence of its strengths. By definition, the behavior of these vessels is being studied under conditions where many of the most significant contributors to the regulation of vascular resistance have been removed, including neural, humoral, metabolic, etc. As such, the investigator is cautioned to avoid over-interpretation and extrapolation of the data that are collected utilizing this preparation. The other significant area of concern with regard to this preparation is that it can be very easy to damage cellular components such as the endothelial lining or the vascular smooth muscle, such that variable source of error can be introduced. It is strongly recommended that the individual investigator utilize appropriate measurements to ensure the quality of the preparation, both at the initiation of the experiment and periodically throughout the course of a protocol.

The ex vivo Isolated Skeletal Microvessel Preparation for Investigation of Vascular Reactivity

An ex vivo preparation is described for isolation of the largest gracilis muscle resistance arterioles for interrogation of both vascular responses to vasoactive stimuli and the assessment of basic structural properties via passive wall mechanics.

La Ex vivo Préparation isolé microvaisseaux squelettique pour les enquêtes de la réactivité vasculaire

The isolated  microvessel preparation is an ex vivo preparation that allows for examination of the different contributions of  factors that control vessel ...

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, fatigability, and recovery after fatigue can be obtained to assess specific aspects of the excitation-contraction coupling (ECC) process such as excitability, contractile machinery and Ca2+ handling ability. This method removes the nerve and blood supply and focuses on the isolated skeletal muscle itself. We routinely use this method to identify genetic components that alter the contractile property of skeletal muscle though modulating Ca2+ signaling pathways. Here, we describe a newly identified skeletal muscle phenotype, i.e., mechanic alternans, as an example of the various and rich information that can be obtained using the in vitro muscle contractility assay. Combination of this assay with single cell assays, genetic approaches and biochemistry assays can provide important insights into the mechanisms of ECC in skeletal muscle.

Ex Vivo Assessment of Contractility, Fatigability and Alternans in Isolated Skeletal Muscles

We describe a method to directly measure muscle force, muscle power, contractile kinetics and fatigability of isolated skeletal muscles in an in vitro system using field stimulation. Valuable information on Ca2+ handling properties and contractile machinery of the muscle can be obtained using different stimulating protocols.

Évaluation ex vivo de la contractilité, fatigabilité et isolées du Alternans muscles squelettiques

 
Described here is a method to measure contractility of isolated skeletal muscles. Parameters such as muscle force, muscle power, contractile kinetics, ...

Intravital Microscopy of the Microcirculation in the Mouse Cremaster Muscle for the Analysis of Peripheral Stem Cell Migration

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to nonmarrow tissue have not been completely clarified. We describe here the technique of intravital microscopy applied to the mouse cremaster microcirculation for analysis of peripheral bone marrow stem cell migration in vivo. Intravital microscopy of the M. cremaster has been previously introduced in the field of inflammatory research for direct observation of leucocyte interaction with the vascular endothelium. Since sufficient peripheral stem and progenitor cell migration includes similar initial steps of rolling along and firm adhesion at the endothelial lining it is conceivable to apply the M. cremaster model for the observation and quantification of the interaction of intravasculary administered stem cells with the endothelium. As various chemical components can be selectively applied to the target tissue by simple superfusion techniques, it is possible to establish essential microenvironmental preconditions, for initial stem cell recruitment to take place in a living organism outside the bone marrow.

Intravital microscopy of the mouse M. cremaster microcirculation offers a unique and well-standardized in vivo model for the analysis of peripheral bone marrow stem cell migration.

Microscopie intravitale de la microcirculation dans le muscle de souris Cremaster pour l&#39;analyse des souches périphériques migration cellulaire

In the era of intravascular cell application protocols in the context of regenerative cell therapy, the underlying mechanisms of stem cell migration to ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

La perfusé Technique du rein de souris isolé

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Analysis of the Gap Junction-dependent Transfer of miRNA with 3D-FRAP Microscopy

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents in the treatment of several diseases. The development of new, innovative strategies for miRNA/siRNA therapy is based on an extensive knowledge of the underlying mechanisms. Recent data suggest that small RNAs are exchanged between cells in a gap junction-dependent manner, thereby inducing gene regulatory effects in the recipient cell. Molecular biological techniques and flow cytometric analysis are commonly used to study the intercellular exchange of miRNA. However, these methods do not provide high temporal resolution, which is necessary when studying the gap junctional flux of molecules. Therefore, to investigate the impact of miRNA/siRNA as intercellular signaling molecules, novel tools are needed that will allow for the analysis of these small RNAs at the cellular level. The present protocol describes the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) microscopy to elucidating the gap junction-dependent exchange of miRNA molecules between cardiac cells. Importantly, this straightforward and non-invasive live-cell imaging approach allows for the visualization and quantification of the gap junctional shuttling of fluorescently labeled small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution. The data obtained by 3D-FRAP confirm a novel pathway of intercellular gene regulation, where small RNAs act as signaling molecules within the intercellular network.

Here, we describe the application of three-dimensional fluorescence recovery after photobleaching (3D-FRAP) for the analysis of the gap junction-dependent shuttling of miRNA. In contrast to commonly applied methods, 3D-FRAP allows for the quantification of the intercellular transfer of small RNAs in real time, with high spatio-temporal resolution.

Analyse du Gap Junction-dependent Transfert de miARN avec microscopie 3D-FRAP

Small antisense RNAs, like miRNA and siRNA, play an important role in cellular physiology and pathology and, moreover, can be used as therapeutic agents ...

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. In vivo cardiac-specific gene delivery is commonly achieved by either systemic or local delivery. Systemic injection via tail vein is easy and efficient in manipulating cardiac gene expression by using recombinant adeno-associated virus 9 (AAV9). However, this method requires a relatively high amount of vector for efficient transduction, and may result in nontarget organ gene transduction. Here, we describe a simple, efficient, and time-saving method of intramyocardial injection for in vivo cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia (without ventilation), the pectoral major and minor muscles were bluntly dissected, and the mouse heart was quickly exposed by manual externalization through a small incision at the fourth intercostal space. Subsequently, adenovirus encoding luciferase (Luc) and vitamin D receptor (VDR), or short hairpin RNA (shRNA) targeting VDR, was injected with a Hamilton syringe into the myocardium. Subsequent in vivo imaging demonstrated that luciferase was successfully overexpressed specifically in the heart. Moreover, Western blot analysis confirmed the successful overexpression or silencing of VDR in the mouse heart. Once mastered, this technique can be used for gene manipulation, as well as injection of cells or other materials such as nanogels in the mouse heart.

A Simple and Efficient Method for In Vivo Cardiac-specific Gene Manipulation by Intramyocardial Injection in Mice

Here we present a protocol for cardiac-specific gene manipulation in mice. Under anesthesia, the mouse hearts were externalized through the fourth intercostal space. Subsequently, adenoviruses encoding specific genes were injected with a syringe into the myocardium, followed by protein expression measurement via in vivo imaging and Western blot analysis.

Une méthode Simple et efficace pour la Manipulation de gène spécifique cardiaque In Vivo par intramyocardique Injection chez la souris

Gene manipulation specifically in the heart significantly potentiate the investigation of cardiac disease pathomechanisms and their therapeutic potential. ...

Analyzing the &alpha;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. Despite the development of multiple differentiation protocols, the generation of iPSC cardiomyocytes resembling an adult-like phenotype remains challenging. One major aspect of cardiomyocytes maturation involves the formation of a well-organized sarcomere network to ensure high contraction capacity. Here, we present a super resolution-based approach for semi-quantitative analysis of the &#945;-actinin network in cardiomyocytes. Using photoactivated localization microscopy a comparison of sarcomere length and z-disc thickness of iPSC-derived cardiomyocytes and cardiac cells isolated from neonatal tissue was performed. At the same time, we demonstrate the importance of proper imaging conditions to obtain reliable data. Our results show that this method is suitable to quantitatively monitor the structural maturity of cardiac cells with high spatial resolution, enabling the detection of even subtle changes of sarcomere organization.

Analyzing the &#945;-Actinin Network in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes Using Single Molecule Localization Microscopy

The formation of a proper sarcomere network is important for the maturation of iPSC-derived cardiomyocytes. We present a super resolution-based approach that allows for the quantitative evaluation of the structural maturation of stem cell derived cardiomyocytes, to improve culture conditions promoting cardiac development.

Analyse du réseau α-Actinine dans les cardiomyocytes dérivés de l’iPSC à l’aide d’une microscopie de localisation à molécule unique

The maturation of iPSC-derived cardiomyocytes is a critical issue for their application in regenerative therapy, drug testing and disease modeling. ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissection du sac endolymphatique de souris

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissection du sac endolymphatique de souris

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

Mesures de contractilité des muscles papillaires isolés sur pour l'Investigation des inotropie cardiaque chez la souris

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