Les cellules souches pluripotentes induites, comme les cellules souches embryonnaires humaines peuvent se différencient en presque n’importe quelle cellule dans le corps et donc très prometteuses dans le domaine de la médecine régénérative.
Cellules souches embryonnaires humaines, ou les CSEh, est obtenus à partir de pré-implantatoire des embryons, tandis que complètement différenciées des cellules somatiques sont utilisés pour générer des cellules souches pluripotentes induites, qui sont aussi appelés CISP.
Dans cette vidéo, vous allez en savoir plus sur les principes de base derrière générant CISP, un protocole étape par étape pour induire la pluripotence des cellules différenciées, et parmi les nombreuses applications en aval et les modifications du présent protocole.
Commençons par examiner les principes qui sous-tendent la génération de CISP de types de cellules somatiques.
Les cellules différenciées, comme les cellules de la peau ou des neurones, sont ceux dont le sort est décidé. Ils sont engagés à exécuter une fonction particulière. En revanche, les cellules souches pluripotentes sont ceux dont le sort est indéci, et ils peuvent se différencier en n’importe quel type de cellule.
Procédé consistant à modifier l’identité d’une cellule différenciée déjà à un État pluripotent est appelé reprogrammation cellulaire. Cela implique de changer le modèle d’expression de gène dans la cellule, car le nombre et les types de protéines produites par un jeu de cellule, un rôle majeur dans la définition de l’identité de la cellule.
Une des façons pour induire une reprogrammation cellulaire est en induisant l’expression de certains facteurs de transcription. Facteurs de transcription sont des protéines qui se lient à des séquences régulatrices dans un gène. Certaines de ces séquences sont appelés « promoteurs » et donc promouvoir la transcription d’un gène. Quelques facteurs de transcription peuvent influencer l’expression de nombreux gènes, qui a un impact énorme sur l’identité de la cellule.
Les quatre facteurs de transcription classique qui sont sont avérées pour induire la pluripotence sont Oct4, Sox2, cMyc et Klf4. Ces facteurs sont également appelés facteurs de Yamanaka, après le chercheur qui a découvert les effets de reprogrammation.
Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour induire l’expression de ces facteurs de transcription. Méthode la plus commune et efficace est l’utilisation d’un virus modifié pour fournir la transcription de gènes du facteur dans le noyau, où ils seront intégreront dans le génome.
Dans cette méthode, les gènes codant les quatre facteurs de Yamanaka sont individuellement emballés dans différents rétrovirus et ajoutés à différencier les cellules. Lorsque les cellules sont exposées à virus à jour, une petite fraction des cellules différenciées sont infectés toutes les quatre transcription factor porteurs de virus. Ils commencent à la dédifférenciation jusqu'à ce que les grands bouquets sphériques de cellules souches pluripotentes sont forment. La formation de cluster aide CISP pour créer un micro-environnement qui ressemble au in vivo des cellules souches et donc de les aider à maintenir leur pluripotence.
Étant donné que vous comprenez maintenant les principes de base derrière la génération de la CISP, Let ' s go grâce à un protocole général pour induire la pluripotence dans les fibroblastes embryonnaires de souris, ou MEFs, en utilisant un système de transduction virale.
Avant de commencer cette procédure, remarque que les virus peuvent infecter les cellules de votre corps, donc la suite aux directives de sécurité est très important.
Pour commencer le processus de transfection, le milieu de culture est supprimé d’une plaque contenant une forte densité de MEFs et les cellules sont lavées avec une solution tampon. Ensuite, une solution contenant une enzyme dégradant les protéines, comme la trypsine, est ajoutée pour soulever les cellules du fond du plat. Milieu de culture est ensuite ajouté à la plaque, et les cellules individuelles sont transférées dans un tube à centrifuger.
Après centrifugation, le culot est remises en suspension dans le milieu de culture. Ensuite, les cellules sont comptées et la concentration est ajustée afin qu’un nombre optimal de cellules peut être infecté par le virus le lendemain. Incuber les cellules pendant la nuit.
Après que les cellules sont sont installés dans leur nouveau plat, vieux médias est remplacé par les supports neufs, et machinés virus contenant les facteurs de transcription désiré sont ajoutés à la plaque. Les cellules sont ensuite incubées avec les virus pendant un temps suffisant permettre l’infection aura lieu. Après incubation, le support contenant le virus libres est supprimé et remplacé par les cellules souches embryonnaires frais moyen.
2 à 3 semaines après transformation, les cellules doivent être cultivées à 37 ° c dans un incubateur, et les milieux de culture doit être remplacé tous les jours.
Après ce laps de temps, iPSC colonies qui ressemblent à des colonies de cellules souches embryonnaires doivent devenir assez grands pour être ramassés. Les colonies peuvent être transférées à un plat frais contenant le support avec des facteurs de croissance et a permis de grandir encore. Afin de confirmer la pluripotence, une partie de la population cellulaire est colorée avec des marqueurs de pluripotence.
Maintenant que vous avez vu comment générer CISP de cellules différenciées, regardons quelques applications en aval et les modifications de cette méthode très utile.
Une caractéristique importante du CISP est qu’ils peuvent servir à générer presque n’importe quelle cellule dans le corps. Cet exemple illustre la génération des cellules du muscle cardiaque, appelé cardiomyocytes, de CISP. Pour ce faire, le CISP est transférés aux plaques non adhérents qui leur permettent de corps embryoïdes forme, qui sont des agrégats de cellules souches pluripotentes. Les corps embryoïdes sont cultivées en moyens spécialisé contenant du sérum et de l’acide ascorbique, qui améliore la différenciation cardiaque. Différenciation réussie peut être facilement observable lorsque certaines cellules commencent à battre.
Puisque le CISP peut potentiellement se différencier en n’importe quel type de cellule, ils peuvent aussi former un organisme tout entier, comme une souris. Cela peut être fait à l’aide d’un test appelé complémentation tétraploïde. Tout d’abord, un tétraploïde d’embryon, embryon contenant quatre séries de chromosomes, est formé par la fusion de deux cellules d’un embryon précoce ensemble à l’aide d’un champ électrique. L’embryon tétraploïde est autorisé à développer au stade blastocyste. CISP est ensuite injectées dans le stade de blastocyste, qui est ensuite transplantée dans un destinataire féminin pour la gestation. Les cellules tétraploïdes ne sont en mesure de former les structures extra-embryonnaires comme le placenta, donc les animaux issus de cette méthode est entièrement issus de CISP.
Certains chercheurs modifier la procédure reprogrammation pour rendre le processus d’identification des cellules correctement reprogrammés plus efficaces. Par exemple, dans cette expérience MEFs avec la capacité d’exprimer la protéine fluorescente verte sous l’influence du promoteur Oct4 a permis aux chercheurs d’identifier facilement les cellules qui ont acquis la pluripotence.
Vous avez juste regardé les vidéo de JoVE sur la production de cellules souches pluripotentes induites. Cette vidéo a examiné les principes derrière cette procédure et un protocole étape par étape pour générer le CISP de cellules différenciées. Nous avons également examiné comment cette méthode pourrait être appliquée ou modifiée pour des expériences en laboratoire.
La découverte du CISP a eu un impact énorme sur le domaine de la biologie des cellules souches, car il a un énorme potentiel pour le développement de thérapies qui peuvent être employées pour traiter les maladies dégénératives. Si beaucoup de progrès ont été réalisé avec le CISP, l’obstacle qui reste à franchir est le risque associé de cancer. Les procédures actuelles de reprogrammation risquent de se traduire par la croissance des cellules non réglementée qui peut causer le cancer. Par conséquent, davantage de recherche est nécessaire d’utiliser effectivement le CISP cliniquement. Comme toujours, Merci pour regarder !
