Name: porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells
Uploaded: 2015-12-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells at JoVE.com

We would like to thank Dr. Hiroshi Miyazaki, Dr. Scott Henderson, Dr. Todd Kitten, Dr. Justin Hutcherson, Dr. Catherine Jauregui, and Collin R. Berry. This work was supported by NIH NIDCR grants R01DE016124, R01DE018039, and R01DE023304 to J.P. Lewis.
Microscopy was performed at the VCU Department of Anatomy and Neurobiology Microscopy Facility, supported, in part, with funding from NIH-NINDS Center core grant (5P30NS047463).

Les protocoles suivants décrivent des procédés de mise en culture et l&#39;étude de l&#39;invasion par les espèces anaérobies, P. gingivalis; Toutefois, ces protocoles peuvent être utilisés pour un certain nombre d&#39;agents pathogènes anaérobies. Bien HUVECs sont utilisés, ce protocole peut être utilisé pour d&#39;autres cellules eucaryotes fois immunitaires et non immunitaires. 1. anaérobie Chambre utilisation et d&#39;entretien Remarque: P. gingivalis est un anaérobie sensibles à des niveaux normaux d&#39;oxygène rencontrées dans l&#39;air ambiant. Un environnement anaérobie contrôlé est essentiel pour la culture de P. gingivalis. <ol><li> Ici, maintenir une atmosphère artificielle désigné comme gaz anaérobie mixte (80% de N 2, 10% de H2, 10% CO 2) dans une chambre anaérobie de vinyle (figure 1A). Utiliser un sas (figure 1B) pour transférer des objets dans l&#39;environnement du laboratoire de la chambre anaérobie. Le sas fonctionne manuellement, twpurge de la glace avec du gaz N 2 avant d&#39;introduire le gaz anaérobie mixte. </li><li> Utilisation d&#39;une colonne d&#39;élimination de sulfure d&#39;hydrogène (Figure 1C) pour l&#39;enlèvement d&#39;entretien de l&#39;hydrogène sulfuré indésirable. Placer un déshumidificateur dans la chambre pour éliminer H 2 O créé par le catalyseur et d&#39;éviter les aérosols qui facilitent la propagation de la contamination. Remarque: Le sulfure d&#39;hydrogène est un sous-produit métabolique naturel de nombreuses bactéries anaérobies et son accumulation est toxique pour les bactéries et peut entraîner des dommages à l&#39;électronique et de diminuer la durée de vie d&#39;un catalyseur. </li><li> Utiliser une boîte de ventilateur pour faire circuler l&#39;atmosphère de la chambre à travers un catalyseur au palladium, ce qui élimine l&#39;oxygène en présence d&#39;hydrogène (figure 1D). Remarque: Une atmosphérique (HEPA) faire recirculer l&#39;air élimine les contaminants d&#39;une taille de 0,22 pm ou plus. </li><li> Culture bactéries anaérobies dans un incubateur à 37 ° qui se trouve à l&#39;intérieur de l&#39;anaérobiechambre. Utilisez des techniques aseptiques standards lorsque vous travaillez à l&#39;intérieur de la chambre anaérobie. </li></ol><img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig1.jpg" /> Figure 1. chambre anaérobie de vinyle et ses composants. (A) une chambre anaérobie de vinyle scellé complètement à partir de l&#39;oxygène atmosphérique fournit espace de travail pour deux personnes à la fois (en 32 x 78 in). Il contient un incubateur réglé à 37 ° C (milieu du dos). (B) un sas est utilisé pour le transfert des objets dans l&#39;environnement de laboratoire à la chambre anaérobie. Sur la photo, un sas automatique commandé par un contrôleur qui peut être programmé pour exécuter automatiquement les procédures de vide et de purge nécessaires pour créer un environnement anaérobie. (C) Un sulfure d&#39;hydrogène colonne d&#39;élimination fournit haute capacité élimination sans entretien des indésirables du sulfure d&#39;hydrogène. (D) Deux boîtes de ventilateur de catalyseur sontplacé dans toute la chambre anaérobie pour faire circuler l&#39;atmosphère de la chambre à travers un catalyseur au palladium, ce qui, en présence d&#39;hydrogène, élimine l&#39;oxygène. La chambre anaérobie est mis en place selon les instructions du fabricant. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 2. Préparation des bactéries anaérobies Remarque: P. gingivalis est aérotolérants et peut être stocké dans des conditions aérobies, mais il ne sera pas croître en présence d&#39;oxygène à des niveaux plus élevés de 6% 17,18. Une chambre anaérobie est nécessaire pour la bonne culture de P. gingivalis et d&#39;autres espèces anaérobies (figure 1). Une bonne formation et d&#39;éducation sur l&#39;utilisation de la chambre anaérobie est nécessaire avant de travailler avec microanaerobes 19. <ol><li> Equilibrer tous les milieux liquides et des plaques à condit anaérobieions pendant au moins 12 heures avant l&#39;expérimentation pour éliminer l&#39;oxygène résiduel. </li><li> Transfert P. gingivalis de -80 ° C congélateur chambre anaérobie, laisser décongeler. </li><li> Streak P. gingivalis sur des plaques de gélose au sang de soja trypticase (TSA II avec du sang de mouton à 5%). Enveloppez plaques en parafilm et conserver à 37 ° C dans un incubateur anaérobie pendant 4-7 jours. </li><li> Inoculer P. gingivalis dans 3 perfusion cardiaque ml du cerveau (BHI) complétées par hémine et ménadione, un milieu liquide non-sélectifs enrichis pour l&#39;isolement et la culture de micro-organismes anaérobies et fastidieux, en utilisant des boucles stériles. Remarque: Pour le stockage à long terme, mélanger les cultures bactériennes préparés BHI avec le glycérol ou DMSO (10-20% concentration finale) et placer dans un congélateur à -80 ° C. </li><li> Préparer une culture de départ de P. gingivalis en faisant une dilution 1:10 et permet aux bactéries de croître jusqu&#39;à la phase mid-log. </li></ol> Note: La densité optique du bacsuspension TÉRIAU est déterminé et la concentration pour chaque souche bactérienne à examiner est ajustée. Pour P. gingivalis une suspension à DO 660 de 0,7 correspond à la phase mi-log et ~ 7 x 10 8 cellules / ml. Les conditions de croissance décrites dans le protocole ci-dessus sont spécifiques de P. gingivalis et peuvent avoir besoin d&#39;être adapté pour d&#39;autres souches bactériennes. 3. cellules endothéliales Culture Remarque: Achat regroupé HUVECs primaires et de la culture en milieu de base contenant des facteurs de croissance endothéliaux vasculaires (VEGF) à 37 ° C dans 5% de CO 2 selon les instructions du fabricant. <ol><li> HUVECs de semences en flacons T-75 à 2,5 x 10 5 cellules / flacon dans 15 ml médias VEGF. Remarque: Vérifiez la viabilité par une dilution 1: 1 avec 4,0% de bleu trypan. Les cellules avec une membrane compromis conservera bleu trypan, les cellules saines avec des membranes intactes apparaîtront blanches lorsqu&#39;elles sont visualisées sous un microscope optique binoculaire. ConT 100 cellules, en sorte que plus de 80% des cellules sont viables 20. </li><li> Remplacez le support tous les 2 jours avec les médias préchauffé VEGF fraîche jusqu&#39;à ce que les cellules atteignent ~ 80% de confluence. </li><li> Laver les cellules une fois avec PBS préchauffé. Libérer les cellules de la fiole T75 par incubation avec 2 ml de trypsine-EDTA (0,25%) pendant 5 min, suivie de neutralisation par une solution de 2 ml de trypsine. </li><li> Recueillir HUVEC en suspension dans un tube conique de 50 ml. Laver toutes les cellules supplémentaires à partir de flacons T-75 avec du PBS et 50 ml de transférer des tubes coniques. </li><li> Centrifuger les cellules à 200 g pendant 10 min. </li><li> Retirer le surnageant, suspendre culot cellulaire dans 10 ml de médias de VEGF préchauffé. </li><li> Déterminer la concentration cellulaire en utilisant un hémocytomètre ou similaire dispositif de comptage cellulaire. </li><li> Calcul du montant de la suspension cellulaire à ajouter à soit plaque de 6 puits (400 000 / puits) ou une plaque de 12 puits avec des lamelles (50 000 / puits). HUVECs sera prêt pour l&#39;expérimentation le lendemain. </li></ol> 4. Essai de survie Invasion / Interaction(Placage) Remarque: Lorsque vous effectuez ce test, préparer deux plaques de cellules endothéliales ensemencées à 400.000 cellules / puits 6 puits. Une plaque sera utilisée pour évaluer bactéries fixées à internalisés et par des cellules hôtes. L&#39;autre plaque représentera pour les bactéries intracellulaires. La plaque de 6 puits permet en triple de deux échantillons à être effectuées en une seule expérience. Pour un aperçu de ce protocole s&#39;il vous plaît se référer à l&#39;analyse de la survie organigramme (Figure 2). <ol><li> Préparer des bactéries anaérobies comme décrit ci-dessus (voir la section 1) jusqu&#39;à ce qu&#39;ils atteignent la croissance mi-log (OD 660 0,5-0,7). </li><li> Bactéries centrifuger à 5000 g pendant 10 min. Remarque: Si la centrifugeuse est en dehors de la chambre anaérobie, porter échantillons bactériens dans un tube de 15 ml hermétiquement fermés, enveloppez le bouchon avec du parafilm pour éviter les fuites d&#39;oxygène. </li><li> Placez granulés P. gingivalis retour dans la chambre, éliminer le surnageant. Laver avec du PBS, les bactéries de granulés de nouveau avant remise en suspension dans VEGF-moidia. Préparer des suspensions pour toutes les souches bactériennes à tester à une DO 660 de 0,7 qui correspond à la phase mi-log (environ 7 x 10 8 cellules / ml). Les bactéries sont maintenant prêts pour l&#39;infection. </li><li> Transfert des plaques à 6 puits contenant des cellules HUVEC à partir de tissu en culture incubateur. Chambre anaérobie Retirez le support et laver trois fois avec PBS anaérobie. Ajouter 2 ml de milieu de VEGF anaérobie dans chaque puits et placer les plaques à 37 ° C dans l&#39;incubateur anaérobie pendant 20 minutes pour équilibrer la température de l&#39;infection. Remarque: les bactéries de plaque sur des plaques d&#39;agar de sang pour assurer ceux utilisés pour l&#39;infection sont homogènes et non contaminés lors de l&#39;infection. </li><li> Infecter les cellules hôtes avec des bactéries à une multiplicité d&#39;infection (MOI: bactéries hôtes) de 100: 1. Remarque: le nombre de cellules HUVEC est déterminé en effectuant un test d&#39;exclusion trypan sur un seul bien avant l&#39;infection. Le nombre de cellules bactériennes est déterminé par la densité optique (par exemple, de 0,5 OD = 5 x 10 8 cellules / ml). Bacterial concentration est ajustée à bon MOI basée sur la concentration HUVECs 21. </li><li> Placer plaques de 6 puits avec des cellules HUVEC infectées en incubateur anaérobie et les bactéries permettent d&#39;interagir avec les cellules hôtes pendant 30 min. </li><li> Préparation de saponine dans du BHI (1,0% p / v) à l&#39;intérieur de la chambre anaérobie et filtrer à travers un filtre de 0,2 um. </li><li> La survie de deux bactéries fixées et intériorisées. <ol><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur, les médias aspirer, laver trois fois avec PBS anaérobie et ajouter 2 ml filtrés 1,0% de saponine (préparé comme décrit dans l&#39;étape 4.8). Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte. </li><li> Racler fond de chaque puits avec un grattoir à cellules. Recueillir le mélange de cellules de chaque puits et faire une dilution de 1: 1 dans du BHI. </li><li> Passez à réaliser des dilutions de l&#39;échantillon. Selon les espèces bactériennes et de la concentration, de régler des dilutions en série. Commencez avec 1: 100 ou 1: 1000 dilutions. </li><li> Plaque 200 ul de la dilution souhaitée sur des plaques de gélose au sang. Wrap til plaques en parafilm et placer dans l&#39;incubateur anaérobie à 37 ° C. </li><li> Après sept jours d&#39;incubation à 37 ° C, retirer les plaques et à compter unités formant colonie (UFC) en utilisant une boîte à lumière de compter manuellement colonies. Remarque: UFC sont énumérés. Pour de plus grandes quantités de UFC, les images peuvent être prises et des logiciels peuvent être utilisés pour faciliter le dénombrement des UFC. </li></ol></li><li> La survie des bactéries internalisées. <ol><li> Retirer les plaques de l&#39;incubateur. Laver trois fois avec du PBS et anaérobie ajouter 2 ml de milieux de VEGF avec additionné d&#39;antibiotiques (300 pg / ml de gentamicine et de 400 ug / ml de métronidazole). </li><li> Incuber pendant 1 heure. Veillez à tester les antibiotiques de sorte qu&#39;ils sont 100% efficace pour tuer la souche bactérienne désirée et assurez-vous qu&#39;ils ne pénètrent pas dans les cellules hôtes 22,23. </li><li> Aspirer le milieu, ajouter 2 mL de 1,0% filtrée saponine. Incuber pendant 15 min pour permettre la lyse de la cellule hôte. </li><li> Racler le fond de chaque well avec racleur de cellules. Recueillir le mélange de cellules de chaque puits et faire dilution 1: 1 dans du BHI. </li><li> Préparer des dilutions en série de l&#39;échantillon (1: 100, 1: 1000). </li><li> Plaque 200 ul de la dilution souhaitée sur des plaques de gélose au sang. Enveloppez plaques en parafilm et placer dans un incubateur anaérobie. </li><li> Après sept jours d&#39;incubation à 37 ° C enlever les plaques et à compter UFC. </li></ol></li></ol><img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53408/53408fig2.jpg" /> Figure 2. Représentation schématique d&#39;un protocole utilisé pour la survie des bactéries anaérobies avec des cellules eucaryotes. Les deux tests pour une survie bactérienne totale et la survie des bactéries intériorisées peuvent être effectuées en même temps. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53408/53408fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> 5. L&#39;internalisation des bactéries dans This HostLLS (microscopie à fluorescence) Remarque: P. gingivalis est marqué avec la 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine, acétoxyméthyl ester (BCECF-AM). BCECF-AM est un colorant de membrane perméable non fluorescent; BCECF sa conversion en fluorescéine sous l&#39;action des esterases intracellulaires de peut indiquer la viabilité cellulaire. P. gingivalis est marqué avec le colorant BCECF-AM et ensuite utilisé pour infecter des cellules eucaryotes. Après l&#39;infection, les cellules sont fixées et marquées au DAPI et TRITC-phalloïdine. La tache de DAPI utilisé pour colorer le noyau de la cellule eucaryote sera également étiqueter noyau de la cellule bactérienne, qui fournit une contre-mesure pour identifier les bactéries non viables qui ne peuvent pas métaboliquement cleave BCECF-AM. Les cellules hôtes sont mises en évidence par la phalloïdine-TRITC, un colorant rouge de l&#39;actine. <ol><li> Lamelles autoclave. Ajouter stérilement lamelles à plaques à 12 puits avant de semer les cellules endothéliales à 5 x 10 4 cellules / puits. (Journée Préparé avant l&#39;expérience) </li><li&gt; Ai préparés sur des cellules endotheliales de 18 mm (# 1.5) d&#39;épaisseur Lamelles circulaires dans des plaques à 12 puits comme décrit ci-dessus. </li><li> Préparer bactéries anaérobies cultivées jusqu&#39;à la phase mid-log (OD 660 = 0,5-0,7) comme décrit dans l&#39;article 1. </li><li> Laver les bactéries anaérobies 2x avec du PBS par centrifugation à 5000 xg et de mise en suspension le culot dans du PBS à 5-7 x 10 8 cellules / ml. </li><li> Ajouter 20 ul de 0,2 mM de BCECF-AM à 2 ml de suspension bactérienne (5-7 x 10 8 cellules / ml) jusqu&#39;à une concentration finale de BCECF-AM de 2 uM. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 30 min dans l&#39;obscurité. </li><li> Des plaques de transfert avec les cellules endothéliales ensemencées sur 18 mm (# 1.5) d&#39;épaisseur des lamelles circulaires de culture de tissu dans la chambre incubateur anaérobie. Laver avec du PBS et l&#39;échange avec les médias de VEGF anaérobie. Remarque: Vérifiez que HUVECs sont en bonne santé sous un microscope optique. HUVEC devrait être ~ 80% de confluence, la morphologie devrait être comparable à des fabricants. </li><li> Centrifuger étiqueté à bactéries5000 xg pendant 10 min pour éliminer le colorant résiduel BCECF-AM. Mettre en suspension dans 2 ml de milieu de VEGF anaérobie. </li><li> Infecter les cellules hôtes avec des bactéries marquées à MOI de 100: 1 (bactéries: accueil). </li><li> Incuber à chambre anaérobie à 37 ° C pendant 30 min. </li><li> Après que les cellules de lavage de l&#39;infection avec PBS trois fois et fixer fraîchement préparée 4,0% de paraformaldehyde pendant 10 min. Remarque: Après que les cellules de fixation, l&#39;expérience peut être menée à l&#39;extérieur de la chambre anaérobie. </li><li> Laver avec lamelles de PBS à trois reprises. </li><li> Ajouter 1 ml de 0,2% de Triton X-100 pendant 10 min. </li><li> Laver avec lamelles de PBS à trois reprises. </li><li> Ajouter 50 ul de TRITC phalloïdine (50 ug / ml) à lamelles pendant 45 minutes. </li><li> Lavez lamelles de trois fois, retirer de la plaque de 12 puits et les placer sur une diapositive avec soft-jeu milieu de montage contenant DAPI. Sceller les côtés avec du vernis à ongles. Remarque: Les lames peuvent être stockées pendant quelques mois dans l&#39;obscurité. Évitez exposition à la lumière pour éviter photo-blanchiment. </li><li> Voir les diapositivesen utilisant un microscope confocal. <ol><li> Ici, utilisez un système 34 de canal spectrale (détecteur de réseau 32-canal et deux détecteurs de PMT de côté, plus un détecteur de lumière transmise) configuré autour d&#39;un AxioObserver (inversé) stand avec un étage XY motorisé. Le système dispose de cinq lasers: diode bleue (405 nm), multi-ligne Argon (458, 488, 514 nm), diode verte (561 nm), rouge HeNe (633 nm) et un laser pulsé 440 nm. Équipé d&#39;un système d&#39;imagerie de vie de fluorescence avec 2 détecteurs de GaAsP hybrides (pour FRET-FLIM). </li><li> Détecter la fluorescence à partir de DAPI et TRITC dans une chaîne à l&#39;aide d&#39;un filtre bi-bande avec des longueurs d&#39;onde d&#39;excitation de 340-380 nm et 540-560 nm, et un filtre d&#39;émission de 435-485 nm et 570-590 nm, respectivement. Détecter la fluorescence de BCECF-AM en utilisant un filtre avec une excitation longueur d&#39;onde de 440-500 nm et un filtre d&#39;émission de 510 à 590 nm. Remarque: Les commandes de BCECF-AM doivent être effectuées sur chaque souche bactérienne à l&#39;étude pour assurer l&#39;étiquetage approprié des bactéries viables. Première valider que nonviabLe bactéries sont DAPI-positif et BCECF négatif. Deuxièmement, veiller à ce que des bactéries vivantes peuvent métaboliser BCECF-AM dans la fluorescéine BCECF. Peut-être besoin d&#39;être testés pour l&#39;étiquetage optimale des concentrations variables de bactéries ou BCECF-AM colorant. </li></ol></li></ol>

Authors have nothing to disclose.

Tous les procédés ci-dessus peuvent être utilisées pour concevoir des dosages spécifiques pour évaluer l&#39;interaction entre les bactéries anaérobies avec des cellules eucaryotes. Cependant, il ya plusieurs considérations à effectuer avec succès les expériences. D&#39;abord, les souches microbiennes à être utilisés dans une étude. Il est essentiel dans la comparaison des deux souches à la fois le test de survie, ainsi que par une analyse par microscopie qu&#39;ils sont à ...

Les bactéries anaérobies colonisent presque toutes les surfaces du corps humain. Bien prédominant dans la flore intestinale des voies génito-urinaires et où les concentrations d&#39;oxygène sont faibles, ils existent également à des niveaux élevés sur la peau, de la bouche, du nez et de la gorge 1. Les bactéries anaérobies sont une cause fréquente d&#39;infections endogènes et sont fréquemment isolés à partir de sites malades. Toutefois, en raison de leur nature fastidieuse, anaérobies peuvent être difficiles à isoler et à la culture. Les études portant sur les bactéries anaérobies doivent être effectuées dans des conditions restreintes. Techniques anaérobie-culture moderne permettent aux chercheurs d&#39;imiter les paramètres anaérobies nécessaires à l&#39;étude de nombreuses souches de laboratoire anaérobie ou même des isolats cliniques 2,3. Des bactéries anaérobies pathogènes ont développé une relation dynamique et co-évolution avec les cellules de l&#39;hôte dans lequel ils résident. La plupart des bactéries anaérobies sont sensibles à la destruction par la réponse immunitaire de l&#39;hôte avant d&#39;atteindre infectiniveaux UO. Cependant, certaines bactéries pathogènes ont développé des mécanismes pour échapper à ou dénaturer la réponse immunitaire de l&#39;hôte. Ils atteindre cet objectif par le biais de mécanismes tels que l&#39;évasion de la reconnaissance immunitaire, neutralisation des médiateurs immunitaires, l&#39;altération de l&#39;immunité à médiation cellulaire, l&#39;invasion des cellules hôtes, et la modification de la signalisation 4 immunitaire. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif impliquées à la fois orale et maladies, extra- est un exemple d&#39;un agent pathogène bactérien très adapté capable de provoquer des changements pathogènes chez l&#39;hôte 7.5. Des poches de la plaque de biofilm courus dans de profondes crevasses formées entre les dents et le tissu muqueux gingival peuvent abriter des bactéries anaérobies qui sont protégés de l&#39;oxygène atmosphérique 8. Ces poches parodontales servir de niche de divers agents pathogènes anaérobies, telles que P. 9 gingivalis. P. gingivalis est un agent pathogène de la distorsion qui est capable de remodelering la communauté microbienne buccale de manière à promouvoir le développement et la progression des maladies parodontales 10. Elle produit un grand nombre de facteurs de virulence qui sont actifs contre un large spectre de protéines de l&#39;hôte et fournit des mécanismes pour l&#39;évasion de 11 défenses de l&#39;hôte. Il est également capable d&#39;envahir épithéliales, endothéliales, fibroblastes et les cellules du ligament parodontal in vitro et in vivo de 12 à 14 15. En envahissant efficacement les cellules de l&#39;hôte, P. gingivalis peut échapper à l&#39;immunité de l&#39;hôte. Invasion efficace de cellules hôtes non seulement permet à la bactérie de se échapper défenses de l&#39;hôte, mais sert également de réservoir pour l&#39;avenir ré-infection ainsi que modifie la cellule hôte. Des études sur les mécanismes moléculaires impliqués dans l&#39;adhésion et l&#39;internalisation de la bactérie par des cellules hôtes sont nécessaires. Recherche dans plusieurs laboratoires se concentre sur la compréhension des événements moléculaires associés à l&#39;internalisation de P. gingivalis par les cellules hôtesainsi que les mécanismes utilisés pour réprimer et détourner la réponse immunitaire et survivre aux mécanismes de défense de l&#39;hôte hostiles. Il existe de nombreux dosages capables d&#39;identifier et de caractériser des agents pathogènes qui sont capables d&#39;envahir les cellules hôtes. Cependant, des études in vitro avec des agents pathogènes anaérobies posent de nombreux problèmes expérimentaux pour le chercheur, principalement parce qu&#39;il est difficile de réaliser des études qui reposent sur ​​des instruments encombrants en l&#39;absence d&#39;oxygène. Cette situation est aggravée par le fait que les cellules eucaryotes besoin d&#39;oxygène pour se développer et doivent donc être préparés séparément dans des incubateurs de culture de tissus. Une façon d&#39;éviter ces obstacles serait d&#39;effectuer les études sous oxygène atmosphérique, mais ce serait faire de la croissance de bactéries anaérobies impossible. Une autre méthode serait d&#39;utiliser des bactéries tuées par la chaleur à infecter et à étudier les interactions de la cellule hôte. Cependant, des différences existent entre les bactéries tuées par la chaleur et viables qui diminuent la pertinence de la interacti hôte-pathogènele 16. Il est central pour étudier les bactéries viables avec l&#39;expression inchangé interagir avec des cellules hôtes; par conséquent, des procédés pour cultiver P. gingivalis dans un cadre anaérobie sont donnés. En outre, deux protocoles rentables simples sont démontrées pour évaluer la capacité de P. gingivalis à être internalisée par les cellules humaines ombilicales veineuses endothéliales (HUVEC). Le premier protocole est basé sur le dosage de protection populaire antibiotique. Bien que le test est simple, les considérations lors de l&#39;utilisation de micro-organismes anaérobies sont donnés. Le deuxième protocole nécessite l&#39;utilisation d&#39;un microscope à fluorescence à balayage visualiser et interagir internalisé P. gingivalis. Chaque test a ses limites et avantages qui seront discutés de fournir au chercheur un aperçu pour l&#39;étude de l&#39;envahissement de bactéries anaérobies. Bien que le manuscrit en cours étudie P. gingivalis et HUVECs, ces protocoles peuvent être utilisés pour de nombreuses autres bactéries anaérobies ainsique pour les autres types de cellules hôtes.

<table><tbody><tr><td>Vinyl Anaerobic Chamber-Type B</td><td>Coy Laboratory Products</td><td></td><td>Model 2000 incubator&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TSA II Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood</td><td>BBL</td><td>221261</td><td></td></tr><tr><td>Human Umbilical Vein Endothelial Cells 10-donor Pool</td><td>LifeLine Technology</td><td>FC-0044</td><td></td></tr><tr><td>VascuLife VEGF Medium Complete Kit</td><td>LifeLine Technology</td><td>LL-0003</td><td></td></tr><tr><td>TrypKit</td><td>LifeLine</td><td>LL-0013</td><td></td></tr><tr><td>Saponin</td><td>Riedel-de Haen</td><td>16109</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin Sulfate Salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G-1264</td><td></td></tr><tr><td>Metronidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-3761</td><td></td></tr><tr><td>BCECF-AM</td><td>LifeTechnologies</td><td>B1150</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Phalloidin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1951</td><td></td></tr><tr><td>18 mm Circular Coverslips</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>72222-01</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield Mounting Medium with DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr></tbody></table>

porphyromonas gingivalis as a model organism for assessing interaction of anaerobic bacteria with host cells

Les bactéries anaérobies sont beaucoup plus nombreux aérobies dans de nombreuses niches humaines telles que l&#39;intestin, de la bouche et le vagin. En outre, les infections anaérobies sont fréquents et souvent d&#39;origine indigène. La capacité de certains agents pathogènes anaérobies à envahir les cellules humaines leur donne des mesures d&#39;adaptation pour échapper à l&#39;immunité innée, ainsi que pour moduler le comportement de la cellule hôte. Cependant, veiller à ce que les bactéries anaérobies sont en direct pendant l&#39;enquête expérimentale des événements peuvent poser des problèmes. Porphyromonas gingivalis, un anaérobie à Gram négatif, est capable d&#39;envahir une variété de cellules non-phagocytaires eucaryotes. Cet article décrit comment réussir à la culture et d&#39;évaluer la capacité de P. gingivalis à envahir les cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine (HUVEC). Deux protocoles ont été développés: de mesurer les bactéries qui peuvent survivre avec succès envahir et à l&#39;intérieur de l&#39;hôte, et l&#39;autre pour visualiser les bactéries qui interagissent avec les cellules hôtes. Ces techniques nécessitent l&#39;utilisation d&#39;un anaechambre pour fournir P. Robic gingivalis avec un milieu anaérobie pour une croissance optimale. Le premier protocole est basé sur le test de protection aux antibiotiques, qui est largement utilisé pour étudier l&#39;invasion des cellules hôtes par des bactéries. Toutefois, l&#39;essai de protection antibiotique est limité; seules les bactéries intracellulaires qui sont cultivables et après un traitement antibiotique de lyse de la cellule hôte sont mesurées. Pour évaluer toutes les bactéries interagissent avec les cellules hôtes, à la fois vivants et morts, nous avons développé un protocole qui utilise la microscopie à fluorescence pour examiner l&#39;interaction hôte-pathogène. Les bactéries sont marquées par fluorescence avec la 2 &#39;, 7&#39;-bis- (2-carboxyéthyl) -5- (et-6) -carboxyfluorescéine acétoxyméthyl ester (BCECF-AM) et utilisé pour infecter des cellules eucaryotes dans des conditions anaérobies. Suite à la fixation avec du paraformaldehyde et perméabilisation avec 0,2% de Triton X-100, les cellules hôtes sont marqués avec DAPI et TRITC phalloïdine pour marquer le cytosquelette de la cellule et du noyau, respectivement. Multiple images prises à différents points focaux (Z-Stack) sont obtenus pour la visualisation spatio-temporelle des bactéries. Les méthodes utilisées dans cette étude peuvent être appliqués à n&#39;importe quel anaérobie cultivable et n&#39;importe quel type de cellule eucaryote.

Protocoles décrits ci-dessus ont été utilisés dans l&#39;étude de l&#39;interaction hôte-pathogène entre P. gingivalis et les cellules endothéliales. P. gingivalis W83 et une p gingivalis V3150 portant une délétion de PG0228 ont été utilisés dans l&#39;étude. Le PG0228 est prédit pour coder pour une protéine susceptible de modifier les niveaux d&#39;ARN et de protéines, qui peuvent en fin de compte affecter l&#39;interaction de P. gingivalis avec les cellules...

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Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type.

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l&#39;évaluation de l&#39;interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

Anaerobic bacteria far outnumber aerobes in many human niches such as the gut, mouth, and vagina. Furthermore, anaerobic infections are common and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells

26.2K vues.  Virginia Commonwealth University. This article presents two protocols: one to measure anaerobic bacteria that can successfully invade and survive within the host, and the other to visualize anaerobic bacteria interacting with host cells. This study can be applied to any cultivable anaerobe and any eukaryotic cell type. 

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Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the gastrointestinal tract, as resident microbiota occurs and prevents colonisation by exogenous bacteria. Indeed, more than 600 species of bacteria are found in the oral cavity, and a single individual may carry around 100 different at any time. Oral bacteria possess the ability to adhere to the various niches in the oral ecosystem, thus becoming integrated within the resident microbial communities, and favouring growth and survival. However, the flow of bacteria into the gut during swallowing has been proposed to disturb the balance of the gut microbiota. In fact, oral administration of P. gingivalis shifted bacterial composition in the ileal microflora. We used a synthetic community as a simplified representation of the natural oral ecosystem, to elucidate the survival and viability of oral bacteria subjected to simulated gastrointestinal transit conditions. Fourteen species were selected, subjected to in vitro salivary, gastric, and intestinal digestion processes, and presented to a multicompartment cell model containing Caco-2 and HT29-MTX cells to simulate the gut mucosal epithelium. This model served to unravel the impact of swallowed bacteria on cells involved in the enterohepatic circulation. Using synthetic communities allows for controllability and reproducibility. Thus, this methodology can be adapted to assess pathogen viability and subsequent inflammation-associated changes, colonization capacity of probiotic mixtures, and ultimately, potential bacterial impact on the presystemic circulation.

Assessing the Viability of a Synthetic Bacterial Consortium on the In Vitro Gut Host-microbe Interface

Gut host-microbe interactions were assessed using a novel approach combining a synthetic oral community, in vitro gastrointestinal digestion, and a model of the small intestine epithelium. We present a method that can be adapted to evaluate cell invasion of pathogens and multi-species biofilms, or even to test probiotic formulations&#39; survivability.

Évaluation de la viabilité d’un Consortium bactérien synthétique sur l’Interface hôte-microbe In Vitro Gut

The interplay between host and microbiota has been long recognized and extensively described. The mouth is similar to other sections of the ...

Recherche

Biochimie

A Mouse Model for Pathogen-induced Chronic Inflammation at Local and Systemic Sites

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including neoplastic, autoimmune, and chronic inflammatory diseases. Emerging evidence implicates pathogen-induced chronic inflammation in the development and progression of chronic diseases with a wide variety of clinical manifestations. Due to the complex and multifactorial etiology of chronic disease, designing experiments for proof of causality and the establishment of mechanistic links is nearly impossible in humans. An advantage of using animal models is that both genetic and environmental factors that may influence the course of a particular disease can be controlled. Thus, designing relevant animal models of infection represents a key step in identifying host and pathogen specific mechanisms that contribute to chronic inflammation.
Here we describe a mouse model of pathogen-induced chronic inflammation at local and systemic sites following infection with the oral pathogen Porphyromonas gingivalis, a bacterium closely associated with human periodontal disease. Oral infection of specific-pathogen free mice induces a local inflammatory response resulting in destruction of tooth supporting alveolar bone, a hallmark of periodontal disease. In an established mouse model of atherosclerosis, infection with P. gingivalis accelerates inflammatory plaque deposition within the aortic sinus and innominate artery, accompanied by activation of the vascular endothelium, an increased immune cell infiltrate, and elevated expression of inflammatory mediators within lesions. We detail methodologies for the assessment of inflammation at local and systemic sites. The use of transgenic mice and defined bacterial mutants makes this model particularly suitable for identifying both host and microbial factors involved in the initiation, progression, and outcome of disease. Additionally, the model can be used to screen for novel therapeutic strategies, including vaccination and pharmacological intervention.

Animal models have proven to be invaluable tools in defining host and pathogen specific mechanisms that contribute to the development of chronic inflammation. Here we describe a mouse model of oral infection with the human pathogen Porphyromonas gingivalis and detail methodologies to assess the progression of inflammation at local and systemic sites.

Un modèle de souris pour l&#39;inflammation chronique induite par pathogène sur les sites locaux et systémiques

Chronic inflammation is a major driver of pathological tissue damage and a unifying characteristic of many chronic diseases in humans including ...

Immunologie et infection

Robust Ligature-Induced Model of Murine Periodontitis for the Evaluation of Oral Neutrophils

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically modified strains, the vast number of analyses that can be performed on harvested soft and hard tissues. However, many of these systems are subject to procedural criticisms. As an alternative, the ligature-induced model of periodontal disease, driven by the localized development and retention of a dysbiotic oral microbiome, can be employed, which is rapidly induced and relatively reliable. Unfortunately, the variants of ligature-induced murine periodontitis protocol are isolated to focal regions of the periodontium and subject to premature avulsion of the installed ligature. This minimizes the amount of tissue available for subsequent analyses and increases the number of animals required for study. This protocol describes the precise manipulations required to place extended molar ligatures with improved retention and usage of a novel rinse technique to recover oral neutrophils in mice with an alternative approach that mitigates the aforementioned technical challenges.

This article presents a protocol for establishing a ligature-induced model of murine periodontitis involving multiple maxillary molars, resulting in larger areas of the involved gingival tissue and bone for subsequent analysis as well as reduced animal usage. A technique to assess oral neutrophils in a manner analogous to human subjects is also described.

Modèle robuste induit par la ligature de la parodontite de Murine pour l'évaluation des neutrophiles oraux

The main advantages of studying the pathophysiology of periodontal disease utilizing murine models are the reduced cost of animals, array of genetically ...

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four women experience bacterial vaginosis, in which a low level of lactobacilli is accompanied by an overgrowth of diverse anaerobic bacteria. This condition has been associated with many health complications, including risks to reproductive and sexual health. While there is growing evidence showing the complex nature of microbial interactions in human vaginal health, the individual roles of these different anaerobic bacteria are not fully understood. This is complicated by the lack of adequate models to study anaerobically grown vaginal bacteria. Mouse models allow us to investigate the biology and virulence of these organisms in vivo. Other mouse models of vaginal bacterial inoculation have previously been described. Here, we describe methods for the inoculation of anaerobically grown bacteria and their viable recovery in conventionally raised C57Bl/6 mice. A new, less stressful procedural method for vaginal inoculation and washing is also described. Inoculation and viable recovery of Gardnerella are outlined in detail, and strategies for additional anaerobes such as Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum are discussed.

The protocol presents a mouse model of vaginal colonization with anaerobically cultured human vaginal bacteria. We focus on Gardnerella vaginalis,&#160;while including suggestions for Prevotella bivia and Fusobacterium nucleatum. This protocol can also be used as a guide for vaginal inoculations and viable recovery of other anaerobically grown bacteria.

Modèles de colonisation vaginale murine par des bactéries de culture anaérobie

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

Organotypic Tissue Model Systems for Investigating Host-Pathogen Interactions In Vitro

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While in-house grown 2D epithelial monolayers lack true representation of the in vivo situation, commercially available tissue models are often overlooked due to their cost and practicality. However, with careful planning, such models provide reproducible platforms for a vast array of different applications. Here, we report the use of epithelial models that can be utilized for a wide variety of experimental purposes to investigate host-pathogen interactions in various ecological niches, such as the oral cavity, skin, and vaginal mucosa. From simple planktonic cells to complex biofilm co-culture, epithelial models are used to assess microbial adherence and invasion, and to evaluate the host response at a transcriptional and/or protein level, with scope for more detailed profiling using different omics approaches. Furthermore, these biological systems can be used as more accurate test beds for evaluating conventional and novel antimicrobial activity in a complex host-pathogen microenvironment in vitro. The protocols described herein document how models are handled upon arrival and prepared in the laboratory for co-culture stimulation with biofilm communities. The methods detail how experimental outputs are achieved from the model systems, including the processing of tissue, the co-culture setup, and data generation. These experiments include host gene expression through single- and multiplex qPCR analyses and inflammatory protein detection using ELISAs. In conclusion, epithelial models provide useful in vitro systems for preclinical investigatory studies into simple or complex host-pathogen interactions.

The present protocol outlines the application of organotypic tissue models for investigating host-pathogen interactions in vitro. Specifically, the model system described uses a multi-layered oral epithelium exposed to microorganisms associated with biofilms (dental plaque) within the context of oral health versus disease.

Systèmes de modèles de tissus organotypiques pour l’étude in vitro des interactions hôte-pathogène

Recapitulating the host-pathogen interface at the epithelial or mucosal barrier in vitro remains a challenging prospect for infection biologists. While ...

Establishing Stable Binary Cultures of Symbiotic Saccharibacteria from the Oral Cavity

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial diversity on earth. Novel approaches are required to culture these uncultured bacteria so that investigators can effectively study their physiology and lifestyle using the powerful tools available in the laboratory. The Candidate Phyla Radiation (CPR) is one of the largest groups of uncultivated bacteria, comprising ~15% of the living diversity on earth. The first isolate of this group was a member of the Saccharibacteria phylum, 'Nanosynbacter lyticus' strain TM7x. TM7x is an unusually small bacterium that lives as a symbiont in direct contact with a bacterial host, Schaalia odontolytica, strain XH001. Taking advantage of the unusually small cell size and its lifestyle as a symbiotic organism, we developed a protocol to rapidly culture Saccharibacteria from dental plaque. This protocol will show how to filter a suspension of dental plaque through a 0.2 &#181;m filter, then concentrate the collected Saccharibacteria cells and infect a culture of host organisms. The resulting coculture can be passaged as any normal bacterial culture and infection is confirmed by PCR. The resulting binary culture can be maintained in the laboratory and used for future experiments. While contamination is a possibility, the binary culture can be purified by either further filtering and reinfection of host, or by plating the binary culture and screening for infected colonies. We hope this protocol can be expanded to other sample types and environments, leading to the cultivation of many more species in the CPR.

We demonstrate a method for isolating difficult-to-grow members of the novel bacterial phylum, Saccharibacteria, by filtering dental plaque and co-culturing with host bacteria.

Établissement de cultures binaires stables de saccharibactéries symbiotiques de la cavité buccale

Many bacterial species cannot be cultured in the laboratory using standard methods, posing a significant barrier to studying the majority of microbial ...

Biologie

Measuring the Migration and Biofilm Formation of Various Bacteria

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their nature would be beneficial in facilitating their characterization. Currently, most studies focus only on one specific characterization method; however, the isolation and identification of microorganisms from the host is a continuous process and usually requires several combinatorial characterization methods. Herein, we describe methods of identifying the microbial biofilm-forming ability, the microbial respiration state, and their chemotaxis behavior. The methods are used to identify five microbes, three of which were isolated from the bone tissue of Sprague-Dawley (SD) rats (Corynebacterium stationis, Staphylococcus cohnii subsp. urealyticus, and Enterococcus faecalis) and two from the American Type Culture Collection (ATCC)-Staphylococcus aureus ATCC 25923&#160;and Enterococcus faecalis V583. The microbes isolated from the SD rat bone tissue include the gram-positive microbes. These microbes have adapted to thrive under stressful and nutrient-limiting environments within the bone matrix. This article aims to provide the readers with the specific know-how of determining the nature and behavior of the isolated microbes within a laboratory setting.

<meta charset="utf8"></head><body>Mesure de la migration et de la formation du biofilm de diverses bactéries

Here, we present a practical method for the isolation and identification of microorganisms within the host. In this way, the physicochemical properties of microorganisms and possible ways of living in the host are clearly described.

Mesure de la migration et de la formation du biofilm de diverses bactéries

As microbes that thrive in the host body primarily have adaptive abilities that facilitate their survival, methods for classifying and identifying their ...

Anti-Infective Efficacy in Cystic Fibrosis with Aggregate Biofilm Models

Cystic Fibrosis Aggregate Biofilm Model to Study Infection-relevant Gene Expression

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not reflect the environmental conditions of the hostile lung niche. Current reductionist testing conditions can lead to the progression of compounds along a preclinical pipeline without evidence of their activity under cystic fibrosis lung niche-appropriate conditions. Several approaches used to study traditional antimicrobials may not be suitable for antibiotic alternatives, including anti-virulence therapeutics like anti-quorum sensing agents and siderophore inhibitors. This protocol documents an aggregate biofilm model of Pseudomonas aeruginosa to compare resistance and infection-relevant gene expression in single-species and multi-species cultures (Staphylococcus aureus and Candida albicans), examining colony-forming unit (CFU) reductions and changes in gene expression, using algD as an exemplar. The model was optimized for small, static volumes of bacterial cultures to allow the study of novel compounds in the discovery phase of the drug development pipeline, where compound quantities may be limited. Single-species P. aeruginosa biofilms were formed in Synthetic Cystic Fibrosis Medium 2 (SCFM2) for 24 h before treatment with meropenem at different concentrations (1, 16, and 256 &#181;g/mL) for a further 24 h. Polymicrobial biofilms were established by growing Staphylococcus aureus and Candida albicans together in SCFM2, then inoculating with P. aeruginosa for an additional 24 h and treating with meropenem. The lack of a direct connection between compound efficacy measures in pre-clinical testing and clinical trial results has cast doubt on the applicability of current laboratory screening tools. This model allows us to understand the impact of relevant factors on P. aeruginosa gene expression, including genes contributing to resistance and virulence, thereby bridging this gap.

This study outlines a framework for developing an aggregate polymicrobial biofilm model and optimizing an RNA extraction protocol to assess Pseudomonas aeruginosa gene expression reflective of the cystic fibrosis lung environment. Applications include evaluating antimicrobial effects and studying antibiotic alternatives under conditions relevant to cystic fibrosis.

Standard pre-clinical testing methods for novel antimicrobial therapeutics used to treat chronic lung infections in people with cystic fibrosis do not ...

Visualization of Internalized Anaerobic Bacteria within Host Endothelial Cells

Source: Wunsch, C. M. et. al., <a href="https://app.jove.com/v/53408">Porphyromonas gingivalis as a Model Organism for Assessing Interaction of Anaerobic Bacteria with Host Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015)
In this video, we demonstrate a procedure to visualize internalized Porphyromonas gingivalis, an anaerobic pathogenic bacterium, within human endothelial cells using confocal microscopy. The bacteria are stained with a fluorescent dye while the host endothelial cell actin cytoskeleton is labeled with a different fluorescent dye. The internalized Porphyromonas gingivalis inside endothelial cells are visualized using confocal microscopy.

Porphyromonas gingivalis comme un organisme modèle pour l'évaluation de l'interaction des bactéries anaérobies avec des cellules hôtes

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