Name: culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research
Uploaded: 2016-06-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research at JoVE.com

Les auteurs tiennent à remercier le personnel de Biospherix pour leur aide à apprendre à utiliser le système de culture cellulaire XVIVO clos, en particulier Matt Freeman; le personnel de Miles &amp; Kelley Construction Company, Inc. pour leur travail dans la mise en place de l&#39;infrastructure de laboratoire, en particulier Russ Hughes; le personnel de l&#39;Hôpital pour enfants du département Orange County des installations et des services de soutien pour leur travail dans la coordination de la rénovation de laboratoire, en particulier Adam Lukhard et Devin Hugie; le personnel de l&#39;Hôpital pour enfants du département Orange County des systèmes d&#39;information pour leur aide dans la mise en place de l&#39;infrastructure de gestion des données et l&#39;accès à distance, en particulier Viet Tran; Hôpital du comté d&#39;Orange équipe de direction de l&#39;enfance pour leur soutien de longue date du projet, en particulier le Dr Maria Minon et Brent Dethlefs. Ce travail a été financé par l&#39;Hôpital pour enfants du comté d&#39;Orange et du California Institute for Regenerative Medicine par subvention TR3-05476 à PHS. Tous les auteurs ont contribué également à ce travail.

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	<li>Brick, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Autism+Spectrum+Disorders+Stem+Cell+Resource+at+Children's+Hospital+of+Orange+County:+Implications+for+Disease+Modeling+and+Drug+Discovery.">The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery.</a> Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).</li><li>Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Derivation+of+induced+pluripotent+stem+cells+by+lentiviral+transduction.">Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction.</a> Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).</li><li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+and+HIF1alpha+repress+the+differentiative+effects+of+BMPs+in+high-grade+glioma.">Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma.</a> Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).</li><li>Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxygen+tension+controls+the+expansion+of+human+CNS+precursors+and+the+generation+of+astrocytes+and+oligodendrocytes.">Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes.</a> Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).</li><li>Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+monitoring+of+non-viable+airborne+particles+correlates+with+airborne+colonies+and+represents+an+acceptable+surrogate+for+daily+assessment+of+cell-processing+cleanroom+performance.">Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance.</a> Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).</li><li>Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+stem+cell+therapies+for+neurological+diseases.">The potential of stem cell therapies for neurological diseases.</a> Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell+therapies+for+the+lysosomal+storage+diseases+-+the+quintessential+neurodegenerative+diseases.">Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases.</a> Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).</li><li>Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traditional+human+embryonic+stem+cell+culture.">Traditional human embryonic stem cell culture.</a> Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).</li><li>Stover, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Process-based+expansion+and+neural+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+for+transplantation+and+disease+modeling.">Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling.</a> J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).</li><li>Stover, A. E., Schwartz, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+feeder-free+conditions+in+chemically+defined+medium+with+enzymatic+single-cell+passaging.">Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging.</a> Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).</li><li>Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hypoxia+enhances+the+generation+of+induced+pluripotent+stem+cells.">Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Les cellules cultivées dans les CPF voient aucune modification des concentrations d&#39;oxygène ou de dioxyde de carbone qui se déplacent d&#39;incubateur pour chambre de traitement au microscope la chambre et le dos. Il est essentiel que les conditions dans chacune des chambres sont adaptées à l&#39;incubateur particulier dans lequel les cellules sont maintenues avant que les cellules sont retirées de l&#39;incubateur. L&#39;atmosphère à l&#39;intérieur de l&#39;appareil est continuellement filtré HEPA et peut être adaptée en ce qui concerne les concentrations d&#39;oxygène et de dioxyde de carbone. Les cellules peuvent être cultivées à des concentrations standard pour PSCs ou NNC, 5% et 9%, respectivement; ou des concentrations différentes peuvent être choisies pour différents types de cellules ou pour des expériences spécifiques. Ainsi, l&#39;appareil est alimenté par des sources constantes d&#39;oxygène de qualité médicale, le dioxyde de carbone et de l&#39; azote (figure 4). Tous les trois de ces gaz sont alimentés par des systèmes multiples spécifiques à gaz qui assurent un approvisionnement constant. L&#39;appareil est également alimenté par un mélange de gaz d&#39;étalonnage constitué par10% (± 0,01%), du dioxyde de carbone en oxygène. Les systèmes multiples sont logés à l&#39;extérieur du centre de production de cellules et les gaz sont acheminés dans l&#39;installation à travers le plafond. Le gaz d&#39;étalonnage est logé dans l&#39;établissement. L&#39;appareil est en outre fourni avec un vide, aussi à travers le plafond. L&#39;utilisation d&#39;un système de surveillance électronique et sans fil unités d&#39;envoi, les pressions de sortie de tous les collecteurs sont constamment surveillés. Dans le cas où aucune pression tombe hors de portée, les exploitants d&#39;installations de production de cellules sont automatiquement téléphonaient et notifiées telles que des mesures appropriées peuvent être prises. Les exigences de puissance de l&#39;appareil sont remplies par six dédiés 120 V circuits descendant du plafond et connectés aux générateurs de secours de l&#39;hôpital pour assurer un approvisionnement constant. Le fonctionnement du dispositif est contrôlé par le logiciel sur un ordinateur basé sur PC alimenté par une alimentation de secours. Ces arrangements d&#39;alimentation électrique et de l&#39;informatiqueveiller à ce que le système fonctionne en continu même en cas de défaillance du système d&#39;alimentation public. Le logiciel de commande de l&#39;appareil dispose d&#39; une interface graphique conviviale (figure 1) qui permet le contrôle des concentrations en oxygène et en dioxyde de carbone, ainsi que les pressions de température, d&#39; humidité et de la chambre. Les valeurs de tous ces paramètres sont enregistrés en continu pour fournir un enregistrement en cours d&#39;exécution de tous les paramètres de l&#39;appareil. Ces données sont sauvegardées sur un serveur distant chaque nuit pour protéger leur intégrité. L&#39;ordinateur et le logiciel sont accessibles à distance par les utilisateurs administratifs pour évaluer et / ou modifier tout paramètre. En outre, l&#39;ordinateur et le logiciel sont accessibles à distance, ce qui permet une évaluation interactive des paramètres de l&#39;appareil et le dépannage des utilisateurs locaux. Une alarme unité d&#39;envoi supplémentaire est connecté à l&#39;appareil de telle sorte que les exploitants d&#39;installations de production de cellules sont informés de toute condition hors de portée de l&#39;appareil. L&#39;accès à distance capacités permettent de vous connecter et évaluation des spécificités de la condition hors de portée. L&#39;appareil est réalisé sous la forme d&#39;un système modulaire, aussi bien dans une macro et micro-sens. Les modules de culture de cellules individuelles, telles que des incubateurs et des chambres de traitement, peuvent être adaptés en ce qui concerne leurs dimensions et des exigences, ainsi que dans leur disposition par rapport à l&#39;autre. En outre, la plupart des fonctions de contrôle des modules individuels sont eux-mêmes modulaires tels que les différents contrôleurs de gaz atmosphériques, par exemple, peuvent être facilement remplacés sans interruption importante du système. des chambres de traitement spécialisées, comme une pour la visualisation et la manipulation des cultures de cellules microscopiques, sont facilement adaptés au système. Deux contraste de phase et un microscope de fluorescence sont à l&#39; intérieur du système (figure 6) de sorte que les cellules peuvent être colorées en direct, et les colonies peuvent être disséqués dans les mêmes conditions atmosphériques à l&#39; intérieur de til incubateurs. Acheminement des câbles à travers des oeillets scellés dans les parois latérales de la chambre de traitement permet des équipements tels que des alimentations et des ordinateurs pour être gardés à l&#39; extérieur de l&#39;appareil, le plus souvent sur ​​un chariot (figure 6). Les chambres de traitement dans l&#39;installation de production de cellules ont un modèle de flux d&#39;air différent de GCS classiques. Dans les GCS classiques, le flux d&#39;air circule vers le bas à partir d&#39;un évent d&#39;échappement central et se divise en deux courants séparés qui sont ensuite repris par deux orifices d&#39;entrée différents dans la partie avant et arrière du plancher de l&#39;armoire. En revanche, le PCF a un seul évent dans la partie avant du plafond. L&#39;air circule vers le bas et vers l&#39;arrière de la chambre, où il est ensuite tiré vers le haut dans un conduit d&#39;admission. Bien que le PCF est intrinsèquement très propre, ce modèle de flux d&#39;air unique signifie que les techniciens doivent ajuster légèrement leur technique afin de réduire le risque de contamination. Comme avec un BSC classique, un laboratoire travailleur should éviter de placer leurs mains ouvertes en amont des plaques de culture cellulaire et des bouteilles de médias. Cependant, la direction qui est en amont a été modifié dans le CPF Le laboratoire de l&#39;installation de production de cellule elle-même est assez standard et est équipé d&#39;un -20 ° C congélateur, -80 ° C congélateur, un réfrigérateur C 4 °, une centrifugeuse et un bain d&#39;eau. Le laboratoire dispose également d&#39;un évier avec des commandes de pied pour une utilisation mains-libres pratique. Pour ce laboratoire pour devenir une installation clinique fonctionnelle de production de cellules, cependant, plusieurs modifications supplémentaires doivent encore être apportées. Tout d&#39;abord, l&#39;appareil lui-même doit être mis à niveau pour avoir la capacité de surveiller les composés organiques volatils, les particules et les concentrations de dioxyde de chlore qui est utilisé pour la décontamination. D&#39;autre part, une chambre de traitement contenant une machine FACS peut être logé et connecté au reste de l&#39;appareil par l&#39;intermédiaire d&#39;un module de mémoire tampon. Cela permettra de triage des cellules et la purification de trpopulations de cellules ansplantable dans les conditions environnementales appropriées. Enfin, l&#39;ensemble de l&#39;appareil doit être installé dans un mur souple chambre propre. Ceci fournit une Organisation internationale de normalisation (ISO) classe 8 environnement pour l&#39;appareil 5. La stérilité élevée et la nature contrôlé par ordinateur du PCF en fait un système idéal pour les applications futures avec la thérapie et de bons procédés de fabrication à base de cellules. Le risque de contamination est considérablement atténué, mais plus important encore, les conditions de l&#39;expansion des cellules sont automatiquement enregistrées et archivées par le système informatique. Déviations des concentrations de gaz, la température, l&#39;humidité et tous les événements d&#39;accès dans le système sont rigoureusement documentés. Cela peut grandement aider lors d&#39;enquêtes sur des problèmes de qualité du produit. Cependant, il y a encore des limites. L&#39;utilisation de tout et de tous les réactifs et les fournitures (par exemple, les composants de médias, pipettes, plaques) doit être documenté séparément. Ajouteritionally, il existe une multitude de problèmes potentiels (y compris de nombreuses formes de l&#39;erreur humaine) qui peuvent survenir, qui sont sans aucun rapport avec les variables documentées par le système de surveillance de la CPF. Ainsi, la nécessité d&#39;un personnel hautement qualifié et la documentation manuelle détaillée des tâches reste en place.

Standard stem cell culture techniques suffer from several environmental constraints that place undue stresses on the cells and expose the cells to unacceptable risks of contamination. Among the stresses that cells may endure under standard cell culture conditions are precipitous changes in the levels of carbon dioxide and oxygen concentrations3,4. This occurs when the cells are moved from the incubator to the biosafety cabinet and/or microscope which may not be optimal for the cells. Previous studies have confirmed the advantages of culturing both pluripotent and neural stem cells in hypoxic conditions4,11, and for best results, these conditions need to be continuous. Moreover, risks of cellular contamination are higher as the laboratory environment and personnel impinge upon the cells at almost every step of their culture and manipulation. Traditional clean rooms comprise one effective method to greatly decrease contamination risks but they are expensive, have a large footprint and fail to address stressors related to carbon dioxide and oxygen concentrations. 
A cell production facility that can address both contamination risks and gas concentrations and that can be qualified to meet cGMP criteria9 provides high quality cells for basic science research as well as clinical applications1,6,7. Such a cell production facility consists, at a minimum, of the following components: a process chamber, which acts as a heated workspace for the feeding and manipulation of cell cultures; a laminar flow hood, for the initial sterilization of reagents, tubes, and tools; two buffering airlock chambers in between the hood and the process chamber; two cell culture incubators accessible from the process chamber; a microscope chamber adjacent to the process chamber; and finally, computer software to set and monitor the conditions within these modules. Using this basic infrastructure, a wide variety of tasks can be performed, such as standard feeding and passaging of pluripotent stem cells and multipotent neural stem cells, as well as more specialized methods like Sendai virus-based reprogramming, in vitro migration studies, and differentiation of neural stem cells for electrophysiological characterization.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo System&lt;/i&gt;</td><td>Biospherix</td><td>custom made</td><td></td></tr><tr><td>&lt;i&gt;Xvivo&lt;/i&gt; Software</td><td>Biospherix</td><td>version i.o.2.1.2.1</td><td></td></tr><tr><td>O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>P-M2H-C3-S-U-OXY</td><td></td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Amico</td><td>M2H-C3-D-U-CO2</td><td></td></tr><tr><td>N&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Manifold</td><td>Western Innovator</td><td>CTM75-7-2-2-BM</td><td></td></tr><tr><td>Microscope with DP21 camera and fluorescence</td><td>Olympus Corporation</td><td>CKX41</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12 Glutamax</td><td>Life Technologies</td><td>10565-018</td><td></td></tr><tr><td>StemPro hESC Supplement</td><td>Life Technologies</td><td>A100006-01</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Millipore</td><td>SCR005</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate-Buffered Sodium</td><td>Hyclone</td><td>9236</td><td></td></tr><tr><td>Fibroblast Growth Factor 2</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL233</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Protide</td><td>PP1130</td><td></td></tr><tr><td>Hank&#039;s-based Cell dissociation Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>AFL236</td><td></td></tr><tr><td>Oct-3/4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>AB3209</td><td></td></tr><tr><td>TRA-1-60 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4260</td><td></td></tr><tr><td>SSEA4 Antibody</td><td>Millipore</td><td>MAB4304</td><td></td></tr><tr><td>BIT-9500 Serum Supplement</td><td>Stemcell Technologies</td><td>9500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumable Supplies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 ml Serological pipet</td><td>VWR</td><td>89130-894</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-102</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-104</td><td></td></tr><tr><td>25 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-106</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Serological pipet</td><td>Olympus Plastics</td><td>12-107</td><td></td></tr><tr><td>6-well plate</td><td>Corning</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>12-well plate</td><td>Corning</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>T25 flask</td><td>TPP</td><td>90026</td><td></td></tr><tr><td>T-75 flask</td><td>TPP</td><td>90076</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491130</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491148</td><td></td></tr><tr><td>1,000 pipet tips</td><td>Eppendorf</td><td>22491156</td><td></td></tr><tr><td>Cryovials</td><td>Thermo Scientific</td><td>5000.102</td><td></td></tr><tr><td>70% ethanol</td><td>BDH</td><td>BDH1164-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Sanimaster 4</td><td>Ecolab</td><td>65332960</td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Clorox</td><td>A714239</td><td></td></tr></tbody></table>

culturing human pluripotent and neural stem cells in an enclosed cell culture system for basic and preclinical research

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety cabinets (BSCs) and incubators have long been the standard for culturing and expanding cell lines for basic and preclinical research. However, as the focus of many stem cell laboratories shifts from basic research to clinical translation, additional requirements are needed of the cell culturing system. All processes must be well documented and have exceptional requirements for sterility and reproducibility. In traditional incubators, gas concentrations and temperatures widely fluctuate anytime the cells are removed for feeding, passaging, or other manipulations. Such interruptions contribute to an environment that is not the standard for cGMP and GLP guidelines. These interruptions must be minimized especially when cells are utilized for therapeutic purposes. The motivation to move from the standard BSC and incubator system to a closed system is that such interruptions can be made negligible. Closed systems provide a work space to feed and manipulate cell cultures and maintain them in a controlled environment where temperature and gas concentrations are consistent. This way, pluripotent and multipotent stem cells can be maintained at optimum health from the moment of their derivation all the way to their eventual use in therapy.

Ce manuscrit décrit en détail une installation de production de cellules, et les aspects uniques de la culture de cellules dans un système fermé. La majeure partie de l&#39;installation de production de cellules comprend un, appareil de culture de cellules ci-joint sur ​​mesure qui a un faible encombrement et peut être facilement logé dans un 6 x 7,5 m 2 pièces (Figure 2). A aucun moment, les cellules au sein de l&#39;appareil est exposé à du personnel de laboratoire ou de l&#39;environnement. L&#39;appareil est constitué de plusieurs modules: une chambre de traitement, une hotte à flux laminaire, 2 chambres tampon de sas entre le capot et la chambre de traitement, deux incubateurs de culture de cellules et une chambre de microscope adjacent à la chambre de traitement (figure 3). Le système est commandé par un logiciel permettant à des variables environnementales à être contrôlés et surveillés (figure 1). L&#39;ordinateur exécutant ce logiciel est sur une alimentation de secours. Les gaz sont introduits dans eSystème de courrier par un ensemble de collecteurs pour l&#39; oxygène, l&#39; azote et le dioxyde de carbone (figure 4). Les gaz de l&#39;appareil sont fournis par des systèmes multiples qui ont deux ensembles de réservoirs chacun - un ensemble actif et un ensemble de réserve. Lorsque l&#39;ensemble actif est tiré vers le bas, le collecteur commute automatiquement sur les réservoirs afin de remplacement de réserve fixé et le personnel. La puissance est un système de générateur de secours. Pluripotentes et les cellules souches neurales peuvent être cultivées dans des conditions hypoxiques dans cette installation en utilisant les protocoles précédemment développés 9, avec des complications supplémentaires inhérentes à l&#39;équipement selon l&#39;invention. Les cellules souches pluripotentes peuvent être obtenus en utilisant le virus Sendai, en utilisant des anticorps spécifiques de pluripotence pour identifier les colonies entièrement transfectées, qui sont ensuite isolés et élargis. (Figure 5A et B), A partir de ces CSPi, les cellules et les neurones souches neurales peuvent être obtenus en utilisant SMAD double inhibition, et leur phénotype vérifié usi<html> anticorps NSC-spécifiques ng (Figure 5C et D). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig1.jpg" /> Figure 1. Interface graphique pour l&#39;installation de production de cellules. (A) La représentation graphique de la CPF est l&#39;écran par défaut et correspond au dessin CAO montre la figure 3. Un clic de la souris sur le module tampon 1 (2F sur la figure 1) ouvre son écran de contrôle (B) où O 2 valeurs sont définies pour correspondre à la chambre de traitement (3 à la figure 3). De même, en cliquant sur ​​le processus de chambre ou Incubateur 1 apporte leurs écrans de contrôle respectifs (C et D, respectivement), où les valeurs peuvent être modifiés ou contrôlés selon le cas.<html> rget = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig2.jpg" /> Figure 2. Le mécanisme de production de cellules. (A) Le système tel que vu à partir d&#39; une vue de face à droite. Notez les connexions électriques et de gaz dans le plafond et le panier avec les accessoires de microscope et l&#39;ordinateur à droite. (B) La hotte à flux laminaire avec les portes d&#39;accès aux modules tampons vus à droite. (C) La chambre de traitement avec les deux incubateurs (portes noires) vu à l&#39;arrière. (D) Une vue à travers le côté droit du système montrant le microscope et surveiller les portes des chambres tampons vus dans la distance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig3.jpg" /> Figure 3. Un dessin CAO de l&#39;installation de production de cellules. Tous les éléments entrant dans le dispositif sont d&#39; abord essuyé avec de l&#39; alcool et séché dans la hotte à flux laminaire air (1). Les articles sont ensuite passés à l&#39;atmosphère appropriée dans le module frontal de la mémoire tampon (2F) avant d&#39; être passé dans le module UCPC ou d&#39;un processus de chambre (3). Les cellules sont cultivées dans les deux incubateurs (4, 5). Coloration de cellules vivantes, colonie cueillette, l&#39; évaluation de la morphologie cellulaire générale et une analyse de la migration a lieu dans le module UPC ou Microscope Chambre (6). Enfin, les déchets quitte le système par le biais du module tampon arrière (2R). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> &lt;<html> / P&gt; <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig4.jpg" /> Figure 4. Sources de gaz et d&#39; énergie. (A) Le CO 2 collecteur est une configuration 4 x 4 car il fournit tous les incubateurs du laboratoire. (B) Le 2 O collecteur est une installation et des produits que l&#39;installation de production de cellules 2 x 2. Azote pour le système est généré dans un évaporateur (C, juste en dessous du signal de sortie) fixé à une tubulure d&#39;azote liquide (vers la droite) qui remplit automatiquement cryofreezers ( en bas à gauche). Le collecteur est une configuration 2 x 2 étant alimenté par deux paires de 160 L réservoirs d&#39;azote liquide. CO 2, O 2 et N 2 sont alimentés à partir du plafond à travers robinets d&#39; arrêt (D). vide House est également fourni à cet endroit. Vu juste derrière les shutoffs de gaz d&#39;alimentation sont une paire de câbles d&#39;alimentation qui alimentent le système.f = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig4large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53685/53685fig5.jpg" /> Figure 5. Cellules souches pluripotentes dérivées en hypoxie avec le virus Sendai. (A) SC187-SF4-2I0-E3 CSPi CSPi (nomenclature trouvée dans Stover et al. 9), le contraste de phase 10X. (B) SC88.1-UH1-2I0 CSPi live-tachée de Tra-1-60 AF-594 marqué, dilution 1: 100 dans les médias. Tous les iPSCs ont été transduites dans l&#39;installation de production de cellules dans 5% de O 2 avec le virus Sendai. (C) en contraste de phase de NNC SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSC dérivées, augmenté à 5% O 2 dans les diapositives de chambre. Les cellules ont ensuite été fixées dans du paraformaldéhyde 4% et colorées avec un anticorps primaire anti-nestine humaine et un anticorps secondaire Alex-488. Toutes les barres d&#39;échelle sont à 1001;. M <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53685/53685fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

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Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

This paper describes how to use a custom manufactured, commercially available enclosed cell culture system for basic and preclinical research. Biosafety ...

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JoVE Journal

Developmental Biology

10.2K vues.  Childrens Hospital of Orange County Research Institute. Here is a protocol to grow pluripotent stem cells (PSC) and neural stem cells (NSC) in an enclosed cell culture system that permits maximum sterility and reproducibility, replacing the traditional biosafety cabinet and incubator. This equipment meets clinical good manufacturing practice (cGMP) and clinical good lab practice (cGLP) guidelines.

Vidéo: Culturing Human Pluripotent and Neural Stem Cells in an Enclosed Cell Culture System for Basic and Preclinical Research

A Novel Culture Model for Human Pluripotent Stem Cell Propagation on Gelatin in Placenta-conditioned Media

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of interest. Nevertheless, an ideal humanized ex vivo feeder-free propagation method for hPSCs has not been developed; currently, additional exogenous substrates including basic fibroblast growth factor (bFGF), a master hPSC-sustaining factor, is added to all of culture media and synthetic substrata such as Matrigel or laminin are used in all feeder-free cultures. Recently, our group developed a simple and efficient protocol for the propagation of hPSCs using only conditioned media derived from the human placenta on a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or synthetic substrata specific to hPSCs. This protocol has not been reported previously and might enable researchers to propagate hPSCs efficiently in humanized culture conditions. Additionally, this model obviates hPSC contamination risks by animal products such as viruses or unknown proteins. Furthermore, this system facilitates easy mass production of hPSCs using the gelatin coating, which is simple to handle, dramatically decreases the overall costs of ex vivo hPSC maintenance.

This protocol provides a simple and efficient way to propagate human pluripotent stem cells (hPSCs) using only conditioned media derived from the human placenta in a gelatin-coated dish without additional exogenous supplementation or hPSC-specific synthetic substrata.

A Novel Culture Modèle de cellules souches pluripotentes humaines Propagation de gélatine dans les médias Placenta conditionné

The propagation of human pluripotent stem cells (hPSCs) in conditioned medium derived from human cells in feeder-free culture conditions has been of ...

Recherche

Biologie du développement

Passaging Human Neural Stem Cells

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes as well as to explore many fundamental processes of human neural development and pathology.  This protocol presents a simple method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of standardizing this technique and increasing reproducibility of human stem cell research.  The hNSPCs we use were isolated from cadaveric postnatal brain cortices by the National Human Neural Stem Cell Resource and grown as adherent cultures on flasks coated with fibronectin (Palmer et al., 2001; Schwartz et al., 2003).  We culture our hNSPCs in a DMEM:F12 serum-free media supplemented with EGF, FGF, and PDGF and passage them 1:2 approximately every seven days.  Using these conditions, the majority of the cells in the culture maintain a bipolar morphology and express markers of undifferentiated neural stem cells (such as nestin and sox2).

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro allows to investigate their utility as cell transplants for therapeutic purposes and to explore human neural development. This protocol presents a method of culturing and passaging hNSPCs in hopes of increasing reproducibility of human stem cell research.

Le repiquage des cellules souches humaines

The ability to manipulate human neural stem/precursor cells (hNSPCs) in vitro provides a means to investigate their utility as cell transplants for ...

Biologie

Generation of Neural Stem Cells from Discarded Human Fetal Cortical Tissue

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ultimately give rise to intermediate progenitors and later, the various neuronal and glial cell subtypes that form the cerebral cortex. The capacity to generate and expand human NSCs (so called neurospheres) from discarded normal fetal tissue provides a means with which to directly study the functional aspects of normal human NSC development 1-5. This approach can also be directed toward the generation of NSCs from known neurological disorders, thereby affording the opportunity to identify disease processes that alter progenitor proliferation, migration and differentiation 6-9. We have focused on identifying pathological mechanisms in human Down syndrome NSCs that might contribute to the accelerated Alzheimer's disease phenotype 10,11. Neither in vivo nor in vitro mouse models can replicate the identical repertoire of genes located on human chromosome 21. 
Here we use a simple and reliable method to isolate Down syndrome NSCs from aborted human fetal cortices and grow them in culture. The methodology provides specific aspects of harvesting the tissue, dissection with limited anatomical landmarks, cell sorting, plating and passaging of human NSCs. We also provide some basic protocols for inducing differentiation of human NSCs into more selective cell subtypes.

A simple and reliable method on isolation and culture of neural stem cells from discarded human fetal cortical tissue is described. Cultures derived from known human neurological disorders can be used for characterization of pathological cellular and molecular processes, as well as provide a platform to assess pharmacological efficacy.

Génération de cellules souches neurales à partir de tissus humains mis au rebut corticale fœtale

Neural stem cells (NSCs) reside along the ventricular zone neuroepithelium during the development of the cortical plate. These early progenitors ...

Neurosciences

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l&#39;induction de petites molécules

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular levels and provided cells for use in regenerative applications. Standard approaches for hESC culture using colony type culture to maintain undifferentiated hESCs and embryoid body (EB) and rosette formation for differentiation into different germ layers are inefficient and time-consuming. Presented here is a single-cell culture method using hESCs instead of a colony-type culture. This method allows maintenance of the characteristic features of undifferentiated hESCs, including expression of hESC markers at levels comparable to colony type hESCs. In addition, the protocol presents an efficient method for neural progenitor cell (NPC) generation from single-cell type hESCs that produces NPCs within 1 week. These cells highly express several NPC marker genes and can differentiate into various neural cell types, including dopaminergic neurons and astrocytes. This single-cell culture system for hESCs will be useful in investigating the molecular mechanisms of these processes, studies of certain diseases, and drug discovery screens.

Presented here is a protocol for the generation of a single-cell culture of human embryonic stem cells and their subsequent differentiation into neural progenitor cells. The protocol is simple, robust, scalable, and suitable for drug screening and regenerative medicine applications.

Différenciation neuronale efficace à l'aide de la culture monocellulaire des cellules souches embryonnaires humaines

In vitro differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) has transformed the ability to study human development on both biological and molecular ...

Différenciation induite de cellules souches pluripotentes à l’aide d’un système de culture automatisé

An Automated Culture System for Maintaining and Differentiating Human-Induced Pluripotent Stem Cells

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, including the elucidation of rare disease pathologies, the development of new medicines, and regenerative medicine aiming to restore damaged organs. Despite this, the social implementation of hiPSCs is still limited. This is partly because of the difficulty of reproducing differentiation in culture, even with advanced knowledge and sophisticated technical skills, due to the high sensitivity of iPSCs to minute environmental changes. The application of an automated culture system can solve this issue. Experiments with high reproducibility independent of a researcher's skill can be expected according to a shared procedure across various institutes. Although several automated culture systems that can maintain iPSC cultures and induce differentiation have been developed previously, these systems are heavy, large, and costly because they make use of humanized, multi-articulated robotic arms. To improve on the above issues, we developed a new system using a simple x-y-z axis slide rail system, allowing it to be more compact, lighter, and cheaper. Furthermore, the user can easily modify parameters in the new system to develop new handling tasks. Once a task is established, all the user needs to do is prepare the iPSC, supply the reagents and consumables needed for the desired task in advance, select the task number, and specify the time. We confirmed that the system could maintain iPSCs in an undifferentiated state through several passages without feeder cells and differentiate into various cell types, including cardiomyocytes, hepatocytes, neural progenitors, and keratinocytes. The system will enable highly reproducible experiments across institutions without the need for skilled researchers and will facilitate the social implementation of hiPSCs in a wider range of research fields by diminishing the obstacles for new entries.

Pleins feux sur l’auteur : Automatisation de la culture iPSC pour une meilleure reproductibilité 

Here, we present a protocol for an automated cell culture system. This automated culture system reduces labor and benefits the users, including researchers unfamiliar with handling induced pluripotent stem (iPS) cells, from the maintenance of iPS cells to differentiation into various types of cells.

Système de culture automatisé pour le maintien et la différenciation de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) with infinite self-proliferating ability have been expected to have applications in numerous fields, ...

Alternative Cultures for Human Pluripotent Stem Cell Production, Maintenance, and Genetic Analysis

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and efficient expansion of large amounts of clinical-grade hPSCs are critical issues in hPSC-based therapies. Conventionally, hPSCs are propagated as colonies on both feeder and feeder-free culture systems. However, these methods have several major limitations, including low cell yields and generation of heterogeneously differentiated cells. To improve current hPSC culture methods, we have recently developed a new method, which is based on non-colony type monolayer (NCM) culture of dissociated single cells. Here, we present detailed NCM protocols based on the Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y-27632. We also provide new information regarding NCM culture with different small molecules such as Y-39983 (ROCK I inhibitor), phenylbenzodioxane (ROCK II inhibitor), and thiazovivin (a novel ROCK inhibitor). We further extend our basic protocol to cultivate hPSCs on defined extracellular proteins such as the laminin isoform 521 (LN-521) without the use of ROCK inhibitors. Moreover, based on NCM, we have demonstrated efficient transfection or transduction of plasmid DNAs, lentiviral particles, and oligonucleotide-based microRNAs into hPSCs in order to genetically modify these cells for molecular analyses and drug discovery. The NCM-based methods overcome the major shortcomings of colony-type culture, and thus may be suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs for future clinical therapies, stem cell research, and drug discovery.

Here, we present human pluripotent stem cell (hPSC) culture protocols, based on non-colony type monolayer (NCM) growth of dissociated single cells. This new method, utilizing Rho-associated kinase inhibitors or the laminin isoform 521 (LN-521), is suitable for producing large amounts of homogeneous hPSCs, genetic manipulation, and drug discovery.

Cultures alternatives pour souches pluripotentes humaines production cellulaire, le maintien et l&#39;analyse génétique

Human pluripotent stem cells (hPSCs) hold great promise for regenerative medicine and biopharmaceutical applications. Currently, optimal culture and ...

Cultures de cellules mixtes de cerveau embryonnaire de souris pour étudier l’infection et l’immunité innée

Establishing Mixed Neuronal and Glial Cell Cultures from Embryonic Mouse Brains to Study Infection and Innate Immunity

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of neurons, astrocytes, oligodendrocytes, and microglia. Due to increasing efforts to replace and reduce animal use, a variety of in vitro cell culture systems have been developed to explore innate cell properties, which allow the development of therapeutics for CNS infections and pathologies. Whilst certain research questions can be addressed by human-based cell culture systems, such as (induced) pluripotent stem cells, working with human cells has its own limitations with regard to availability, costs, and ethics. Here, we describe a unique protocol for isolating and culturing cells from embryonic mouse brains. The resulting mixed neural cell cultures mimic several cell populations and interactions found in the brain in vivo. Compared to current equivalent methods, this protocol more closely mimics the characteristics of the brain and also garners more cells, thus allowing for more experimental conditions to be investigated from one pregnant mouse. Further, the protocol is relatively easy and highly reproducible. These cultures have been optimized for use at various scales, including 96-well based high throughput screens, 24-well microscopy analysis, and 6-well cultures for flow cytometry and reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) analysis. This culture method is a powerful tool to investigate infection and immunity within the context of some of the complexity of the CNS with the convenience of in vitro methods.

Pleins feux sur l’auteur : Établir des cultures mixtes de cellules neuronales et gliales à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l’infection et l’immunité innée  

This protocol presents a unique way of generating central nervous system cell cultures from embryonic day 17 mouse brains for neuro(immuno)logy research. This model can be analyzed using various experimental techniques, including RT-qPCR, microscopy, ELISA, and flow cytometry.

Établissement de cultures de cellules neuronales et gliales mixtes à partir de cerveaux de souris embryonnaires pour étudier l’infection et l’immunité innée

Models of the central nervous system (CNS) must recapitulate the complex network of interconnected cells found in vivo. The CNS consists primarily of ...

La culture pluripotentes humaines et cellules souches neurales dans un système de culture cellulaire clos pour la recherche fondamentale et préclinique

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