Name: high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)
Uploaded: 2016-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 38 s
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Les auteurs tiennent à remercier Karsta Luettich et Grégory Vuillaume pour leur examen du manuscrit.

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Tous les auteurs sont des employés de Philip Morris International. Philip Morris International est la seule source de financement et parrain de ce projet.

Les besoins des alternatives à l&#39;expérimentation animale et de nouvelles approches de test à haut débit ont été largement discutés au cours des dernières années. Cela a conduit les scientifiques et les autorités réglementaires pour étudier des méthodes alternatives pour les tests de toxicité standard, en utilisant des dosages cellulaires qui imitent étroitement la physiologie des tissus cibles. Dans cette étude, nous avons démontré l&#39;applicabilité de la combinaison d&#39;un analyseur de cellules en temps réel (RTCA) avec une projection haute teneur (HCS) plate-forme pour évaluer l&#39;impact de l&#39;exposition aux constituants CS simples sur les cellules épithéliales pulmonaires humaines. Cette configuration pourrait être appliquée de façon analogue pour évaluer la cytotoxicité induite par divers autres polluants atmosphériques, les particules en suspension, et des nanoparticules. En outre, les résultats obtenus peuvent être jumelés à ceux de transcriptomique du génome entier et les méthodes de calcul basé sur les réseaux biologiques causales. Comme indiqué précédemment, cette approche nous a permis de corroborer les données sur voie moléculaireperturbation sur CS exposition 5 avec les terminaux HCS, face à ces perturbations de la voie aussi phénotypique. Comme un essai d&#39;organigramme, l&#39; analyse des cellules en temps réel fournit des informations sur la viabilité des cellules dans une résolution de la dose et dépendante du temps, ce qui permet une meilleure prise de décision qui dose et l&#39; exposition point de temps peuvent être favorables pour l&#39; analyse en aval 14. Le principe de l&#39;analyseur de repose sur des variations de l&#39;impédance électrique produite par les cellules où ils se fixent et se propager sur une surface de culture de puits recouvert d&#39;un micro-électrodes en or. L&#39;impédance est convertie en un paramètre sans dimension appelé cellule d&#39;indice, qui peut être utilisé pour contrôler l&#39;adhérence cellulaire, la propagation, la morphologie et la viabilité des cellules en fin de compte. Bien que cette technique ne fournit pas d&#39;informations sur les mécanismes cytotoxiques, sa sensibilité permet de détecter des changements cellulaires morphologiques, même à des doses très faibles au cours de laquelle le HCS est pas informative (données non présentées). Sur la base de précéexpériences UO, nous avons constaté que la méthodologie RTCA est capable de détecter les changements morphologiques à des doses plus faibles par rapport aux points de terminaison HCS. Après la sélection initiale avec la cellule d&#39;analyse en temps réel, une plate-forme de HCS a été utilisé pour gagner plus en profondeur des informations sur le type de cytotoxicité induite par chaque HPHC. Le panneau d&#39;essai HCS permis au profil HPHCs vers leur impact potentiel sur les compartiments cellulaires / organelles, ainsi que pour identifier les personnes suscitant génotoxicité ou stress oxydatif. L&#39;analyse a révélé des profils distincts de sorte que les HPHCs sélectionnés induisent une cytotoxicité dans les cellules NHBE. D&#39;une manière générale, tous les composés, à l&#39;exception Phénol, se sont avérés induire une nécrose aux doses maximales testées. Conformément à un rôle potentiel dans le développement du cancer 1-aminonaphtalène phosphorylation induite de H2AX comme marqueur pour la génotoxicité, mais le panneau de HCS également de l&#39;activité découverte de cette HPHC dans la toxicité mitochondriale lecture (masse accrue et cytochrome C releasoi) et le stress oxydatif (GSH d&#39;épuisement). De même, comme décrit précédemment, le phénol a été identifié pour provoquer un dysfonctionnement mitochondrial, et causer des dommages de l&#39;ADN, ainsi que l&#39;épuisement en GSH. Le chrome (VI), l&#39;un des composés classés comme cancérogènes de groupe I, et crotonaldéhyde ont également été identifiés comme étant à la fois génotoxique, en particulier, le chrome (VI) l&#39;apoptose induite également (activation en cascade de caspase) et crotonaldéhyde provoqué une augmentation de la génération de ROS. Enfin, l&#39;arsenic (V) a été trouvée pour induire la phosphorylation cJun qui est un marqueur d&#39;activation de la voie de la kinase de stress. Dans cette étude, nous avons utilisé des cellules NHBE comme un modèle pour les cellules épithéliales pulmonaires in vitro. L&#39;utilisation de ces cellules dans un cadre de HCS est sans précédent et a permis à l&#39;enquête sur une plus large gamme de terminaux, y compris les marqueurs de génotoxicité et le stress oxydatif. Les deux cellules vivantes et des approches fixes de coloration des cellules ont été décrits au sein de nos protocoles, ce qui démontre la flexibilité de la technique dans son ensemble. En floi, les mêmes protocoles peut être appliquée à un plus large éventail de cibles, qui peut être traitée par l&#39;utilisation d&#39;un colorant ou d&#39;un anticorps fluorescent. Pour la bonne exécution des protocoles de coloration en direct, il est important de respecter le temps d&#39;incubation, comme certains des colorants ont une demi-vie limitée et le signal de fluorescence peut diminuer avant l&#39;acquisition d&#39;image est terminée. Il est également important de considérer que, si un type de cellule différent est utilisé, toutes les conditions de coloration doivent être réévalués, comme la concentration optimale de colorant et le temps d&#39;incubation peuvent être différentes. Dans le présent document, nous avons décrit un scénario où seulement cinq composés où criblées avec la méthodologie de HCS. Compte tenu de la disposition de la plaque décrite précédemment, ils ont reçu une dose de plus de deux différents ensembles de plaques pour un total de 24 plaques (6 essais et 2 points temporels) .Le nombre de plaques pourrait également être augmentée, permettant ainsi la projection simultanée de plusieurs composés ou les investigation de plusieurs noeuds finaux. Avant de le faire, cependant, il faut prendre en considération que certains effets (GSH et ROS) nécessitent l&#39;acquisition immédiate, et en conséquence, le dosage des plaques doit être réalisée de manière décalée pour permettre l&#39;acquisition de la plaque précédente. D&#39;autre part, en utilisant un protocole de coloration cellulaire fixe représente un avantage car les plaques peuvent être empilées, en interrompant le protocole à une étape quelconque après la fixation, pour l&#39;achèvement de la procédure de coloration à un stade ultérieur. Cette approche, par exemple, permettrait à l&#39;opérateur le temps de remplir toutes les plaques de coloration des cellules vivantes sans compromettre la qualité des données. Afin d&#39;optimiser davantage le flux de production en réduisant le nombre de plaques, il serait également possible de multiplexer plusieurs noeuds finaux ensemble. Par exemple dans ce dommages de l&#39;ADN de contexte et le stress Kinase pourraient être étudiés ensemble simplement en utilisant deux anticorps secondaire avec des fluorochromes émettant dans différentes channels. Le développement continu de la plate-forme de HCS, y compris l&#39;ensemencement automatisé des cellules, la dilution composé, le dosage et la coloration, ainsi que l&#39;ajout de nouveaux paramètres vont encore étendre la capacité de la plate-forme de HCS comme un outil de profilage puissant pour HPHCs sur épithéliale et d&#39;autres types de cellules .

l&#39;évaluation des risques toxicologiques a toujours compté sur l&#39;utilisation de modèles animaux qui, bien que fondamentale dans les sciences de la vie, sont aussi liés à des insuffisances telles que traductibilité incompatibles pour les humains et les coûts élevés. En outre, il y a eu un effort de plus en plus de trouver des alternatives à l&#39; expérimentation animale dans l&#39;esprit de «Les 3R» 2 (remplacement, réduction et raffinement). Cet effort a été accéléré au cours des dernières années, non seulement en raison des progrès récents, tels que les techniques à haut débit et approches de biologie systémique, mais aussi à cause de la législation limitant l&#39;utilisation de tests sur les animaux, en particulier dans l&#39;Union européenne. La complexité des voies de signalisation cellulaires régulant la réponse aux agressions toxiques, il est évident que l&#39;utilisation de paramètres toxicologiques simples ne sera pas suffisant pour décrire la base toxicologique de certains composés. Pour cela, le jeu des centaines d&#39;interagir proteins contribuant à un réseau biologique devront également être pris en compte. Pour étudier l&#39;effet des substances toxiques sur ces réseaux, une approche de la toxicologie du système combiné à moyen phénotypiques et des essais de criblage à haut débit est utile de déduire dynamisations et en même temps fournir plus d&#39;informations sur le mécanisme d&#39;action des toxiques individuels. Dans cette étude, nous avons utilisé HCS comme un puissant outil de criblage qui se compose d&#39;un microscope automatisé et d&#39;une application logicielle biologique, qui peut acquérir, traiter et analyser des données d&#39;images dérivées d&#39;analyses cellulaires spécifiques basées sur la fluorescence. Cela permet des changements visuels dans une cellule à quantifier, à une seule cellule ou au niveau subcellulaire, et de nombreux paramètres à analyser simultanément. 3 Par exemple, l&#39; ADN cassures double brin ont été évaluées à l&#39; aide d&#39; une identification à base d&#39; anticorps de l&#39; histone H2AX phosphorylation et espèces réactives de l&#39;oxygène (ROS) ont été quantifiés en utilisant une cellule-permsuperoxyde Eable de colorant sensible. Parce que les cellules épithéliales pulmonaires représentent la première barrière biologique contre les substances toxiques inhalés, y compris la fumée de cigarette, nous avons utilisé les cellules épithéliales bronchiques primaires comme un modèle in vitro pour profiler l&#39;effet de HPHCs publiés par les États-Unis Food and Drug Administration. 4 Ce manuscrit est un suivi -up sur une étude précédente 5 , dans lequel nous avons évalué l&#39;impact biologique d&#39;un sous - ensemble différent de HPHCs. Dans le cadre de notre flux de travail pour évaluer la cytotoxicité in vitro, nous avons d&#39; abord évalué les potentialités d&#39;une sélection de 15 HPHC de, en utilisant une analyse cellulaire en temps réel à base d&#39; impédance système (RTCA) qui nous a permis d&#39;établir la dose-gammes, appropriées pour HCS ultérieure analyse (figure 1). Une évaluation toxicologique HCS a ensuite été menée en utilisant neuf points d&#39;extrémité multi-paramétriques de toxicité cellulaire, chaque suivi à deux points de temps (4 et 24 h). Les marqueurs utilisés sont une indication de la toxicité mitochondriale, des lésions de l&#39; ADN, le stress kinase, les espèces réactives de l&#39; oxygène (ROS), le glutathion (GSH) contenu caspase 3 - 7 activité, le cytochrome C libération et de la perméabilité de la membrane cellulaire, comme décrit dans le tableau 1. Notre approche a permis l&#39;identification et la caractérisation de l&#39;effet des composants de la fumée de cigarette par échantillonnage de la dose et en fonction du temps. En fin de compte, cela a produit un profil toxicologique in vitro pour chaque HPHC. Les approches multi-omique peuvent également être utilisés pour compléter davantage l&#39;analyse de HCS. Ce serait finalement aussi fournir une compréhension plus approfondie des effets sur la signalisation cellulaire et / ou niveau de la transcription.

<table><tbody><tr><td>Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader</td><td>Thermo</td><td>N01-0002B</td><td></td></tr><tr><td>xCelligence RTCA MP</td><td>ACEA</td><td>05331625001</td><td></td></tr><tr><td>Screener (HCS)</td><td>Genedata</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>CASY counter TTC</td><td>Roche</td><td>05 651 719 001</td><td></td></tr><tr><td>e-Plates VIEW 96</td><td>ACEA</td><td>06 472 451 001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Frame 96</td><td>ACEA</td><td>05232392001</td><td></td></tr><tr><td>RTCA Cardio Temperature Tool</td><td>ACEA</td><td>2801171</td><td></td></tr><tr><td>Plate sealer breathseal</td><td>Greiner bio-one</td><td>676051</td><td></td></tr><tr><td>Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE)</td><td>Lonza</td><td>CC-2540</td><td>non-smoking 60-year-old Caucasian male donor&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BEGM BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3170</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>ReagentPack Subculture Reagents kit</td><td>Lonza</td><td>CC-5034</td><td>Warm at 37 &amp;deg;C before use</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin (100x)</td><td>Corning</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>Easy Flask filter cap 75&amp;nbsp;cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;</td><td>Thermo Scientific</td><td>12-565-349</td><td></td></tr><tr><td>96 well assay plate&amp;nbsp; black&amp;nbsp;</td><td>Corning</td><td>3603</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-62249</td><td></td></tr><tr><td>Draq5 (For Far Red Nuclear Staining)</td><td>Biostatus</td><td>DR50200</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7512</td><td></td></tr><tr><td>Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos</td><td>Life technologies</td><td>M-7513</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: Dihydroethidium</td><td>Sigma</td><td>D7008</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: CellROX</td><td>Life technologies</td><td>C10422</td><td></td></tr><tr><td>ROS Dye: MitoSOX</td><td>Life technologies</td><td>M36008</td><td></td></tr><tr><td>GSH Dye: Monochlorobimane</td><td>Sigma</td><td>69899</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>GSH Dye: Monobromobimane</td><td>Life technologies</td><td>M-1378</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: YO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>Y3603</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TO-PRO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3602</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Membrane permeability Dye: TOTO-1&amp;nbsp;</td><td>Life technologies</td><td>T3600</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green</td><td>Life technologies</td><td>C10423</td><td>Irritating&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-Cytochrome C antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-11823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA5-15889</td><td></td></tr><tr><td>Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse)</td><td>Thermo</td><td>MA1-2022</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti-Mouse IgG DyLight 650&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab96878</td><td></td></tr><tr><td>10x permeabilization buffer</td><td>Fisher</td><td>8408400</td><td></td></tr><tr><td>4% Formaldehyde solution</td><td>Sigma</td><td>F1635</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>10x blocking buffer</td><td>Fisher</td><td>8408500</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Phosphate Buffered Saline&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&#039; Balanced Salt solution</td><td>Sigma</td><td>H8264</td><td></td></tr><tr><td>Staurosporine</td><td>Sigma</td><td>S4400</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma</td><td>V0627</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma</td><td>36541</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Anisomycin</td><td>Sigma</td><td>A9789</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Ethacrynic acid</td><td>Sigma</td><td>E4754</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>1-Aminonaphthalene</td><td>Sigma</td><td>34390</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>2-Nitropropane</td><td>Sigma</td><td>130265</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetamide</td><td>Sigma</td><td>695122</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>650501</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A9099</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Arsenic (V)</td><td>Sigma</td><td>A6756</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Benzene</td><td>Sigma</td><td>12540</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Chromium (VI)</td><td>Sigma</td><td>216623</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Crotonaldehyde</td><td>Sigma</td><td>262668</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Methyl ethyl ketone</td><td>Sigma</td><td>34861</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nickel&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>203866</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Nitrobenzene</td><td>Sigma</td><td>48547</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Phenol</td><td>Sigma</td><td>P5566</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Quinoline</td><td>Sigma</td><td>241571</td><td>Toxic</td></tr><tr><td>Toluene</td><td>Sigma</td><td>34866</td><td>Toxic</td></tr></tbody></table>

high content screening analysis to evaluate the toxicological effects of harmful and potentially harmful constituents (hphc)

La fumée de cigarette (CS) est un facteur de risque majeur pour les maladies cardiovasculaires et pulmonaires. Parce que CS est un aérosol complexe contenant plus de 7000 produits chimiques 1 , il est difficile d&#39;évaluer les contributions des différents constituants à sa toxicité globale. Profils toxicologiques des composants individuels ainsi que les mélanges peuvent cependant être établies in vitro, par application d&#39;une haute traversante mettre des outils de dépistage, qui permettent le profilage des constituants nocifs et potentiellement dangereux (HPHCs) de la fumée de tabac, tel que défini par la US Food and Drug administration (FDA). 2 Pour une évaluation initiale, un instrument à base d&#39;impédance a été utilisé pour un temps réel, l&#39;évaluation sans étiquette de la toxicité du composé. L&#39;affichage de l&#39;appareil repose sur l&#39;adhésion cellulaire, de la viabilité et de la morphologie qui fournissent ensemble une vue d&#39;ensemble de l&#39;état de la cellule. Un paramètre sans dimension, nommé index de cellule, est utilisée pour la quantification. Un ensemble de difprotocoles de coloration diffé- a été développé pour une enquête basée sur l&#39;imagerie par fluorescence et une plate-forme de HCS a été utilisé pour gagner plus en profondeur des informations sur le type de cytotoxicité induite par chaque HPHC. Sur les 15 constituants testés, seuls cinq ont été sélectionnés pour une analyse basée sur HCS comme ils ont enregistré une LD calculable 50 (&lt;20 mM). Ceux-ci comprenaient 1-aminonaphtalène, Arsenic (V), le chrome (VI), crotonaldéhyde et Phénol. Sur la base de leurs effets dans le HCS, 1-aminonaphtalène et Phénol pourraient être identifiés pour induire un dysfonctionnement mitochondrial, et, conjointement avec le chrome (VI) comme génotoxique sur la base phosphorylation accrue de l&#39;histone H2AX. Crotonaldéhyde a été identifié comme un inducteur de stress oxydatif et l&#39;arsenic en tant que voie activateur stress kinase. Cette étude démontre qu&#39;une combinaison de technologies à base d&#39; impédance et HCS fournit un outil robuste pour l&#39; évaluation in vitro des constituants CS.

RTCA Du fait que les points d&#39;extrémité HCS ne seront pas informatifs lorsque aucun effet toxique est détectée, ces composés ne présentant pas de diminution de la viabilité des cellules jusqu&#39;à la concentration la plus élevée dans la RCTA ne sont pas testés par HCS (figure 3b, c, d, g, k, l, m , p). Les composés présentant une diminution de la viabilité cellulaire à la seule concentration la plus élevée (figure 3e, o) sont également désélectionné HCS. Enfin, seuls les constituants avec un LD calculable 50 (&lt;20 mM) sont sélectionnés pour une analyse plus approfondie de HCS (Figure 3a, f, h, j, n). HPHCs répondant aux critères ci-dessus sont: 1-aminonaphtalène, Arsenic (V), le chrome (VI), crotonaldéhyde et Phénol. HCS Comme un contrôle de qualité (QC), les contrôles positifs sont fipremière analyse pour assurer que la procédure de coloration est correctement effectuée. Des images représentatives des cellules témoins positives traitées sont montrées sur la figure 6. Les valeurs données sont normalisées par rapport au véhicule tel que décrit précédemment. Aucune courbes dose-réponse sont tracées en seulement trois doses sont testées et ne sont pas tous les trois doses sont considérés comme à chaque point de temps. Les doses de témoin positives sont sélectionnées (sur la base des expériences antérieures, les données non présentées) de telle sorte que des réponses appropriées soient respectées pour chaque critère d&#39;évaluation à la fois 4 h et 24 h. En doses particulières 1 et 2 sont utilisés pour évaluer l&#39;effet à 4 h alors que des doses 2 et 3 sont utilisées pour évaluer l&#39;effet à 24 h. Les plaques sont rejetées si aucune réponse est observée pour les doses de contrôle positif. A noter que pour tous les points d&#39;extrémité, à l&#39;exception du potentiel de membrane mitochondriale et la teneur en GSH, il est prévu une augmentation de l&#39;intensité du signal. Tous les composés, à l&#39;exception de Phénol, induit une phéno nécrotique<html> le type, basé sur l&#39; augmentation de la perméabilité de la membrane cellulaire (figure 7a, f, h, i). 1-aminonaphtalène, chrome (VI), crotonaldéhyde et Phénol ont été identifiés comme étant génotoxiques basée sur l&#39; augmentation de la phosphorylation de l&#39;histone H2AX de (figure 7e, j, n, p). Phénol et 1-aminonaphtalène ont été trouvés pour induire une dysfonction mitochondriale sévère (figure 7b, o) qui, avec 1-aminonaphtalène, a conduit à une libération du cytochrome C a augmenté (Figure 7c). La détection d&#39;une activité accrue de la caspase 3/7 a fourni des preuves de l&#39;événement apoptotique lors de l&#39;exposition au chrome. Le stress oxydatif induction (ROS ou GSH) a également été détecté lors d&#39;un traitement avec le 1-aminonaphtalène, crotonaldéhyde et Phénol (Figure 7d, m, q). Enfin, l&#39; arsenic induit un stress cellulaire tel que démontré par une augmentation de la phosphorylation du facteur de transcription cJun (figure 7g). charge / 53987 / 53987fig1.jpg &quot;/&gt; Figure 1. Composé Tox-Profiler Workflow. A) Schéma du flux de travail suivi dans cette étude. Tout d&#39; abord, une constatation dose-gamme a été réalisée en utilisant la plate - forme RTCA pour sélectionner des doses appropriées pour HCS ultérieure pour caractériser les profils de toxicité spécifiques des composés. B) la conception expérimentale de l&#39;étude. 24 heures après l&#39; ensemencement, les cellules ont été dosés et les valeurs d&#39;impédance surveillés en continu pendant 24 heures suivantes, alors que HCS paramètres ont été étudiés 4 et 24 heures après l&#39; administration. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig2.jpg" /> Figure 2. RTCA Exposition Plate. Plaque maîtresse composé est d&#39; abord générée en effectuant une cinq étapes dilution 1:10 série. Chaque composé,y compris le contrôle du véhicule (dose 0) est ensuite ajouté en triple à la plaque d&#39;exposition et en même temps avec un milieu staurosporine comme témoins. Notez que les doses séquence est maintenue au moment du transfert, doses les plus élevées sont dans la ligne numéro 1 tandis que les contrôles de véhicules sont en numéro de ligne 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig3.jpg" /> Figure 3 représentant RTCA Résultats Viabilité cellulaire. A) 1-aminonaphtalène, b) le 2-nitropropane, c) -acétamide, d) Acétone, e) acrylamide, f) , l&#39; arsenic (V), g) benzène, h) et le chrome (VI) , j) crotonaldéhyde, k) méthyléthylcétone, l) Nickel (II), m) nitrobenzène, n) phénol, le o) -quinoléine, p) Toluène. À 24 h après l&#39;administration, l&#39;aire sous la courbe (AUC) a été calculée pour chaque dose (y compris le contrôle positif et le véhicule) et normalisé dans une plage de 0 à -100% d&#39;activité (axe y), où 0 reflète l&#39;activité de le véhicule et -100 du contrôle positif. Les valeurs ont ensuite été tracées et ajustés à l&#39; aide d&#39; un à quatre paramètres colline équation et, lorsque cela est possible, DL 50 a été calculé. Les concentrations sont exprimées sur une échelle logarithmique (axe x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig4.jpg" /> Figure 4. Schéma Dilution pour les composés contrôle positif pour HCS Assays. A) Ajout de contrôles positifs et cinqcule à la dilution de série plaque. b) de dilution en série des contrôles positifs. c) 200X contrôles positifs doses. de) Dilution des 200x positifs doses de contrôle dans le milieu (1:40) pour générer la plaque de contrôle positif contenant les doses 5x. Notez que chaque dose est diluée en triple afin de refléter la mise en page finale de la plaque d&#39;exposition). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig4large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig5.jpg" /> Figure 5. HCS Exposition Plate. Plaque maîtresse composé est d&#39; abord générée en effectuant une dilution en cinq étapes. Chaque composé, y compris le contrôle du véhicule (dose 0) est ensuite ajouté en triple à la plaque d&#39;exposition en même temps que les témoins positifs. Notez que l&#39;ordre des doses est maintenue au moment du transfert,doses les plus élevées sont en ligne numéro 1 tandis que les contrôles de véhicules sont en numéro de ligne 7. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig5large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 6" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig6.jpg" /> Figure 6. Représentant fluorescents Photos de anticorps- ou Dye-cellules colorées a) Paramètres nucléaires - tinctoriales nucléaire:. Un colorant perméable qui se lie à l&#39; ADN dans les cellules vivantes ou fixes. Cette tache est utilisée pour identifier des cellules individuelles en matière d&#39; étiquetage de la région nucléaire b) Nécrose - perméabilité de la membrane cellulaire colorant:. La détection de l&#39; intégrité de la membrane cellulaire à base de colorant. Le réactif est intrinsèquement imperméable à la membrane cellulaire. Au cours de la nécrose, la membrane devient perméable et le colorant pénètre dans la cellule et se lie à l&#39;ADN produisant une forte fluorescence de. ignal c) Apoptose - Cytochrome C: détection du cytochrome C libération, une caractéristique bien connue de l&#39; apoptose précoce à base d&#39;anticorps. Lors de l&#39; induction de l&#39; apoptose, le cytochrome c est libéré de la mitochondrie et diffuse dans le noyau d) l&#39; ADN de dommages - de pH2AX:.. La détection de la phosphorylation de l&#39; histone H2AX à base d&#39;anticorps, une caractéristique bien connue des cassures double brin de l&#39; ADN e) Stress Kinase - cJun:. la détection à base d&#39;anticorps de la phosphorylation à Ser-73 de cJun, une caractéristique bien connue du stress cellulaire f) du stress oxydatif - DHE: détection de radicaux superoxydes Dye-based. Dihydroethidium se fluoresces bleu dans le cytoplasme tandis que la forme éthidium oxydée réagit en rouge sur l&#39; ADN intercalation g) GSH - mBcl:. Détection de molécules libres GSH Dye-based. mBcl réagit avec GSH àgénérer un produit hautement fluorescent h) Apoptose - Caspase 3/7 activation:. détection de caspase 3/7 activité Dye-based. Le réactif est non fluorescent avec un peptide d&#39;acides aminés quatre qui inhibe la liaison à l&#39;ADN. Lors de l&#39;activation de la caspase-3/7, le peptide est clivé permettre au colorant de se lier à l&#39;ADN et de produire une réponse fluorogène lumineuse. Panneaux Bh montrent des cellules témoins traités positifs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig6large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 7" src="/files/ftp_upload/53987/53987fig7.jpg" /> Figure 7. Résultats représentant HCS. 1-aminonaphtalène (ae), l&#39; arsenic (V) (f et g), de chrome (VI) (hk), crotonaldéhyde (ln) et Phénol (OQ). 4 h (ligne bleue) etsignaux 24 h (ligne orange) ont été calculées pour chaque dose et normalisée à l&#39;activité du véhicule (0%). Les valeurs qui ne sont pas inclus dans la courbe des calculs d&#39;ajustement sont affichées en gris. Les concentrations sont exprimées sur une échelle logarithmique (axe x). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53987/53987fig7large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Essai </td><td> Endpoint # </td><td> critère biologique </td><td> compartiment cellulaire </td><td> fonction de sortie </td></tr><tr><td rowspan="4"> cytotoxicité </td><td> 1 </td><td> Masse mitochondriale 6 </td><td> Cytoplasme </td><td> surface moyenne spot </td></tr><tr><td> 2 </td><td> Le potentiel de la membrane mitochondriale 6 </td><td> Cytoplasme </td><td> intensité moyenne spot </td></tr><tr><td> 3 </td><td> Cytochrome C libération <sup&gt; 7 </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> 4 </td><td> Membrane cellulaire perméabilité 8 </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> DNA Damage </td><td> 5 </td><td> phospho-H2AX 9 </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> stress Kinase </td><td> 6 </td><td> 10 phospho-cJun </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> ROS </td><td> 7 </td><td> ROS 11 </td><td> Noyau </td><td> intensité moyenne </td></tr><tr><td> GSH contenu </td><td> 8 </td><td> GSH 12 </td><td> Cytoplasme </td><td> intensité moyenne spot </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> 9 </td><td> 13 caspase 3 </td><td> Cytoplasme </td><td> intensité moyenne spot </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Liste des HCS assays et les terminaux. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2"></td><td rowspan="2"> Véhicule </td><td colspan="6" rowspan="2"> doses RTCA (uM) </td><td rowspan="2"> LD 50 </td><td colspan="5"> doses HCS </td></tr><tr><td colspan="2"></td><td colspan="4"> La viabilité des cellules sélectionnées (uM) </td><td> 3R4F (nM) </td></tr><tr><td colspan="2"> 1-aminonaphtalène </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 280 uM </td><td> 2000 </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 150 </td><td> 0,27 </td></tr><tr><td colspan="2"> 2-nitropropane </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acétamide </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Acétone </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> acrylamide </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Arsenic (V) </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 160 uM </td><td> 200 </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 25 </td> &lt;td&gt; 0,17 </td></tr><tr><td colspan="2"> Benzène </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Le chrome (VI) </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 20 pm </td><td> 100 </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> dix </td><td> 0,06 </td></tr><tr><td colspan="2"> crotonaldéhyde </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 200 um </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2000 </td></tr><tr><td colspan="2"> Méthyle éthyle cétone </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt;20 mM, </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Nickel </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> nitrobenzène </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Phénol </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> 2.300 uM </td><td> 5000 </td><td> 2000 </td><td> 1000 </td><td> 500 </td><td> 240 </td></tr><tr><td colspan="2"> quinoléine </td><td> EtOH </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td&gt; <td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> Toluène </td><td> Eau </td><td> 20,000 </td><td> 2000 </td><td> 200 </td><td> 20 </td><td> 2 </td><td> 0,2 </td><td> &gt; 20 mM </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tableau 2. Liste des composés HPHC Testé avec LD Relative 50 à 24 h de traitement. Les composés sélectionnés pour l&#39; analyse HCS sont surlignés en orange et les doses testées sont également donnés. La dose 3R4F est équivalente à la quantité de constituant présent dans la fumée d&#39;un bâton de la 3R4F de cigarettes de référence. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Essai </td><td> Composé </td><td> Stock Solution </td><td> Solvant </td&gt; <td colspan="3"> Dose (s) (M) </td></tr><tr><td> Viabilité cellulaire </td><td> staurosporine </td><td> 10 mM, </td><td> DMSO </td><td colspan="3"> 50 </td></tr><tr><td> cytotoxicité </td><td> valinomycine </td><td> 10 mM, </td><td> DMSO </td><td> 50 </td><td> 20 </td><td> 5 </td></tr><tr><td> DNA Damage </td><td> paraquat </td><td> 100 mM </td><td> DMSO </td><td> 500 </td><td> 200 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> stress Kinase </td><td> anisomycine </td><td> 2 mM </td><td> DMSO </td><td> dix </td><td> 4 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> ROS </td><td> roténone </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> GSH contenu </td><td> l&#39;acide éthacrynique </td><td> 200 mM </td><td> DMSO </td><td> 1000 </td><td> 400 </td><td> 100 </td></tr><tr><td> apoptose </td><td> staurosporine </td><td> 40 mM, </td><td> DMSO </td><td> 200 &lt;/ Td&gt; <td> 50 </td><td> 20 </td></tr></tbody></table> Tableau 3. Liste des contrôles positifs et concentrations utilisées pour chaque essai.

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High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents HPHC

The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.

Haut Analyse de dépistage du contenu pour évaluer les effets toxicologiques des composants nocifs et potentiellement dangereux (HPHC)

Cigarette smoke (CS) is a major risk factor for cardiovascular and lung diseases. Because CS is a complex aerosol containing more than 7,000 chemicals1 it ...

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Research

JoVE Journal

Biology

High Content Screening Analysis to Evaluate the Toxicological Effects of Harmful and Potentially Harmful Constituents (HPHC)

12.1K vues.  Philip Morris International R&D. The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds. 

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Human Pluripotent Stem Cell Based Developmental Toxicity Assays for Chemical Safety Screening and Systems Biology Data Generation

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in vitro toxicity testing of potential drugs. To provide a solid scientific basis for such assays, it will be important to gain quantitative information on the time course of development and on the underlying regulatory mechanisms by systems biology approaches. Two assays have therefore been tuned here for these requirements. In the UKK test system, human embryonic stem cells (hESC) (or other pluripotent cells) are left to spontaneously differentiate for 14 days in embryoid bodies, to allow generation of cells of all three germ layers. This system recapitulates key steps of early human embryonic development, and it can predict human-specific early embryonic toxicity/teratogenicity, if cells are exposed to chemicals during differentiation. The UKN1 test system is based on hESC differentiating to a population of neuroectodermal progenitor (NEP) cells for 6 days. This system recapitulates early neural development and predicts early developmental neurotoxicity and epigenetic changes triggered by chemicals. Both systems, in combination with transcriptome microarray studies, are suitable for identifying toxicity biomarkers. Moreover, they may be used in combination to generate input data for systems biology analysis. These test systems have advantages over the traditional toxicological studies requiring large amounts of animals. The test systems may contribute to a reduction of the costs for drug development and chemical safety evaluation. Their combination sheds light especially on compounds that may influence neurodevelopment specifically.

The protocols describe two in vitro developmental toxicity test systems (UKK and UKN1) based on human embryonic stem cells and transcriptome studies. The test systems predict human developmental toxicity hazard, and may contribute to reduce animal studies, costs and the time required for chemical safety testing.

Human cellules souches pluripotentes Basé Toxicité pour le développement dosages pour Chemical dépistage et la biologie des systèmes de sécurité de génération de données

Efficient protocols to differentiate human pluripotent stem cells to various tissues in combination with -omics technologies opened up new horizons for in ...

Recherche

Biologie du développement

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been hindered partly due to a lack of standardized methods and availability of robust, user-friendly technology. In this study, commercially available, division-arrested cell lines were employed to quantitatively screen for endocrine activity of chemicals present in water samples of interest to environmental quality professionals. A single, standardized protocol that included comprehensive quality assurance/quality control (QA/QC) checks was developed for Estrogen and Glucocorticoid Receptor activity (ER and GR, respectively) using a cell-based Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) assay. Samples of treated municipal wastewater effluent and surface water from freshwater systems in California (USA), were extracted using solid phase extraction and analyzed for endocrine activity using the standardized protocol. Background and dose-response for endpoint-specific reference chemicals met QA/QC guidelines deemed necessary for reliable measurement. The bioassay screening response for surface water samples was largely not detectable. In contrast, effluent samples from secondary treatment plants had the highest measurable activity, with estimated bioassay equivalent concentrations (BEQs) up to 392 ng dexamethasone/L for GR and 17 ng 17&#946;-estradiol/L for ER. The bioassay response for a tertiary effluent sample was lower than that measured for secondary effluents, indicating a lower residual of endocrine active chemicals after advanced treatment. This protocol showed that in vitro transactivation bioassays that utilize commercially available, division-arrested cell &#34;kits&#34;, can be adapted to screen for endocrine activity in water.

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

A protocol to screen for endocrine activity in organic extracts of water samples, including treated wastewater effluent and surface (receiving) water, was adapted using commercially available division-arrested ("freeze and thaw") in vitro transactivation bioassays.

Le dépistage de la Endocrine Activité en eau à l&#39;aide disponibles dans le commerce<em&gt; In vitro</em&gt; Transactivation Bioassays

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

Environnement

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the local to federal levels. The continuing evolution of PFAS chemistries presents a challenge to the environmental monitoring, where ongoing development of targeted methods necessarily lags the discovery of new chemical compounds. There is a need, therefore, to have forward-looking methodologies that can detect emerging and unexpected compounds, monitor these species over time, and resolve details of their chemical structure to enable future work in human health. To this end, non-targeted analysis by high-resolution mass spectrometry offers a broad base detection approach that can be combined with almost any sample preparation scheme and provides significant capabilities for compound identification after detection. Herein, we describe a solid-phase extraction (SPE) based sample concentration method tuned for shorter chain and more hydrophilic PFAS chemistries, such as per fluorinated ether acids and sulfonates, and describe analysis of samples prepared in this fashion in both targeted and non-targeted modes. Targeted methods provide superior quantification when reference standards are available but are intrinsically limited to expected compounds when performing analysis. In contrast, a non-targeted approach can identify the presence of unexpected compounds and provide some information about their chemical structure. Information about chemical features can be used to correlate compounds across sample locations and track abundance and occurrence over time.

Here, we present a protocol for the sequential targeted quantification and non-targeted analysis of fluorinated compounds in water by mass spectrometry. This methodology provides quantitative levels of known fluorochemical compounds and identifies unknown chemicals in related samples with semi-quantitative estimates of their abundance.

Identification par- et les espèces chimiques polyfluorés avec un flux de travail combinée spectrométrie de masse à haute résolution ciblée et Non-ciblés-dépistage

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...

High-throughput and Comprehensive Drug Surveillance Using Multisegment Injection-Capillary Electrophoresis-Mass Spectrometry

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug crisis in public health. Conventional urine drug testing based on a two-tier immunoassay screen followed by a gas chromatography-tandem mass spectrometry (GC-MS/MS) or liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) method are expensive and prone to bias while being limited to targeted panels of known drugs of abuse (DoA). Herein, we outline an improved method for drug surveillance that allows for the resolution and detection of an expanded panel of DoA and their metabolites when using multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry (MSI-CE-MS). Multiplexed separations of ten urine samples with a quality control by CE (&lt; 3 min/sample) in conjunction with full-scan data acquisition using a time-of-flight mass spectrometer (TOF-MS) under positive ion mode detection allows for the identification and quantification of DoA above recommended cut-off levels. An excellent resolution of drug isomers and isobars, including background interferences, are achieved when using MSI-CE-MS with an electrokinetic spacer between sample segments, where accurate mass/molecular formula together with the comigration of a matching deuterated internal standard and the detection of one or more bio-transformed metabolites facilitate DoA identification over a wider detection window. Additionally, urine samples can be analyzed directly without enzyme deconjugation for the rapid screening without complicated sample workup. MSI-CE-MS enables the surveillance of a broad spectrum of DoA that is required for the treatment monitoring of high-risk patients, including confirming prescribed drug adherence, revealing illicit drug use/substitution, and evaluating optimal dosage regimes as required for new advances in precision medicine.

Here we describe a high-throughput method for comprehensive drug surveillance that allows for the improved resolution and detection of large panels of drugs of abuse and their metabolites, with quality control based on multisegment injection-capillary electrophoresis-mass spectrometry.

Surveillance des médicaments haut débit et complet à l’aide de la spectrométrie de masse de l’électrophorèse capillaire-Injection Multisegment

New analytical methods are urgently needed to enable high-throughput, yet comprehensive drug screening, given an alarming opioid and prescription drug ...

Chimie

A High-Throughput Screening Approach for Evaluating the Binding Affinity of Environmental Pollutants to Nuclear Receptors

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite their high environmental occurrence, there is very limited information regarding their toxicological effects. It is urgent to develop high-throughput screening (HTS) methods to guide toxicological studies. In this study, a receptor-ligand binding assay using an HTS system was developed to determine the binding potency of environmental pollutants on nuclear receptors. The test is conducted using a microplate reader (i.e., a 96-well plate containing various chemicals) by measuring the fluorescence polarization (FP) of a specific fluorescent probe. This assay consists of four parts: the construction and transformation of recombinant vectors, the expression and purification of the receptor protein (ligand-binding domain), receptor-probe binding, and competitive binding of chemicals with the receptor. The binding potency of two environmental pollutants, perfluorooctanesulfonic acid (PFOS) and triphenyl phosphate (TPHP), with peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPAR&#947;) was determined to illustrate the assay procedure. Finally, the advantages and disadvantages of this method and its potential applications were also discussed.

This protocol describes a high-throughput screening system that uses fluorescence polarization of a specific fluorescent probe binding to a nuclear receptor as a readout for screening environmental pollutants.

Increasing levels of compounds have been detected in the environment, causing widespread pollution and posing risks to human health. However, despite ...

High-Content Screening Assay for the Identification of Antibody-Dependent Cellular Cytotoxicity Modifying Compounds

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells expressing the epidermal growth factor receptor HER2 can be targeted by the anti-HER-2 antibody trastuzumab. Antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) is an important mechanism implicated in the antitumor action of HER-2. Trastuzumab bound to cancer cells can be recognized by the Fc receptors of ADCC effector cells (e.g., natural killer (NK) cells, macrophages, and granulocytes), triggering the cytotoxic activity of these immune cells leading to cancer cell death. We set out to develop an image-based assay for the quantification of ADCC to identify novel ADCC modulator compounds by high-content screening. In the assay, HER2 overexpressing JIMT-1 breast cancer cells are co-cultured with NK-92 cells in the presence of trastuzumab, and target cell death is quantified by automated microscopy and quantitative image analysis. Target cells are distinguished from effector cells based on their EGFP fluorescence. We show how compound libraries can be tested in the assay to identify ADCC modulator drugs. For this purpose, a compound library test plate was set up using randomly selected fine chemicals off the lab shelf. Three microtubule destabilizing compounds (colchicine, vincristine, podophyllotoxin) expected to interfere with NK cell migration and degranulation were also included in the test library. The test screen identified all three positive control compounds as hits proving the suitability of the method to identify ADCC-modifying drugs in a chemical library. With this assay, compound library screens can be performed to identify ADCC-enhancing compounds that could be used as adjuvant therapeutic agents for the treatment of patients receiving anticancer immunotherapies. In addition, the method can also be used to identify any undesirable ADCC-inhibiting side effects of therapeutic drugs taken by cancer patients for different indications.

This protocol presents an automated, image-based high-throughput technique to identify compounds modulating natural killer cell-mediated breast cancer cell killing in the presence of a therapeutic anti-HER-2 antibody.

Essai de criblage à haute teneur pour l’identification de composés modificateurs de la cytotoxicité cellulaire dépendants des anticorps

Immunotherapy with antigen-specific antibodies or immune checkpoint inhibitors has revolutionized the therapy of breast cancer. Breast cancer cells ...

Recherche en cancérologie

Assessment of the Cytotoxic and Immunomodulatory Effects of Substances in Human Precision-cut Lung Slices

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new therapeutics. Additionally, registration of new substances requires appropriate risk assessment with adequate testing systems to avoid the risk of individuals being harmed, for example, in the working environment. Such risk assessments are usually conducted in animal studies. In view of the 3Rs principle and public skepticism against animal experiments, human alternative methods, such as precision-cut lung slices (PCLS), have been evolving. The present paper describes the ex vivo technique of human PCLS to study the immunomodulatory potential of low-molecular-weight substances, such as ammonium hexachloroplatinate (HClPt). Measured endpoints include viability and local respiratory inflammation, marked by altered secretion of cytokines and chemokines. Pro-inflammatory cytokines, tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;), and interleukin 1 alpha (IL-1&#945;) were significantly increased in human PCLS after exposure to a sub-toxic concentration of HClPt. Even though the technique of PCLS has been substantially optimized over the past decades, its applicability for the testing of immunomodulation is still in development. Therefore, the results presented here are preliminary, even though they show the potential of human PCLS as a valuable tool in respiratory research.

In view of the 3Rs principle, respiratory models as alternatives to animal studies are evolving. Especially for risk assessment of respiratory substances, there is a lack of appropriate assays. Here, we describe the use of human precision-cut lung slices for the assessment of airborne substances.

Évaluation de la cytotoxique et effets immunomodulateurs de Substances dans des tranches de poumon humain de coupe de précision

Respiratory diseases in their broad diversity need appropriate model systems to understand the underlying mechanisms and enable development of new ...

Immunologie et infection

Évaluation des changements de comportement cellulaire induits par le MOF par détection électrique cellule-substrat

Electric Cell-Substrate Sensing for Real-Time Evaluation of Metal-Organic Framework Toxicological Profiles

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of MOFs in biomedical and industrial applications has led to concerns regarding their safety. Herein, the profile of a selected MOF, a zeolitic imidazole framework, was evaluated upon exposure to human lung epithelial cells. The platform for evaluation was a real-time technique (i.e., electric cell-substrate impedance sensing [ECIS]). This study identifies and discusses some of the deleterious effects of the selected MOF on the exposed cells. Furthermore, this study demonstrates the benefits of using the real-time method versus other biochemical assays for comprehensive cell evaluations. The study concludes that observed changes in cell behavior could hint at possible toxicity induced upon exposure&#160;to MOFs of different physicochemical characteristics and the dosage of those frameworks being used. By understanding changes in cell behavior, one foresees the ability to improve safe-by-design strategies of MOFs to be used for biomedical applications by specifically tailoring their physicochemical characteristics.

Pleins feux sur l’auteur : Progrès dans l’évaluation de la réponse des cellules épithéliales pulmonaires humaines aux cadres métallo-organiques 

The following study evaluates the toxicological profile of a selected metal-organic framework utilizing electric cell-substrate impedance sensing (ECIS), a real-time, high-throughput screening technique.

Détection électrique cellule-substrat pour l’évaluation en temps réel des profils toxicologiques des structures organométalliques

Metal-organic frameworks (MOFs) are hybrids formed through the coordination of metal ions and organic linkers in organic solvents. The implementation of ...

Haut Analyse de dépistage du contenu pour évaluer les effets toxicologiques des composants nocifs et potentiellement dangereux (HPHC)

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