We are grateful to Dr. Sachiko Sato and Julie-Christine L&#233;vesque at the Bioimaging Platform of the Centre de recherche du CHU de Qu&#233;bec for their technical assistance. Grants from the Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) RGPIN-2014-05308, The Banting Research Foundation, and The Scottish Rite Charitable Foundation of Canada to M.E.T supported this work.
H.E.H. is recipient of a scholarship from the Lebanese Ministry of Education and Higher Education, and K.B. from the Facult&#233; de m&#233;decine of Universit&#233; Laval.

Note: Toutes les expériences ont été approuvés et réalisés selon les directives du comité d&#39;éthique animale institutionnelle, en conformité avec le Conseil canadien sur les lignes directrices de protection des animaux administré par le Comité de l&#39;Université Laval Animal Care. APP-PS1 souris mâles entre 4 et 21 mois ont été utilisés. Ces animaux ont été logés dans un cycle lumière-obscurité de 12 h à 22-25 ° C avec un accès libre à la nourriture et de l&#39;eau. 1. Méthoxy-X04 Préparation de la solution <ol><li> Préparer une solution à 5 mg / ml de méthoxy-X04 9 en dissolvant méthoxy-X04 dans une solution contenant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO), 45% de propylène - glycol et 45% de phosphate de sodium , une solution saline tamponnée (0,9% de NaCl dans 100 mM de tampon phosphate , pH 7,4). <ol><li> En utilisant une microbalance, peser 5 mg du composé méthoxy-X04. Sous une hotte, dissoudre le méthoxy-X04 dans le DMSO et mélanger jusqu&#39;à l&#39;obtention d&#39;une solution verdâtre clair. ajouter Successivement propylèneglycol et phosphate tampon saline tout en agitant avec chaque addition. </li><li> Agiter la solution à 4 ° C sur un dispositif de rotation O / N. Obtenir une émulsion vert jaunâtre. La solution peut être stockée à 4 ° C pendant jusqu&#39;à deux mois sans dégradation. </li></ol></li></ol> 2. Méthoxy-X04 Solution injectable <ol><li> 24 heures avant la perfusion, les souris pèsent et donner à chaque souris une injection intrapéritonéale de méthoxy-X04 à une dose de 10 mg / kg de poids corporel en utilisant une aiguille 27 G ½. </li></ol> 3. Transcardial Perfusion des souris Injecté <ol><li> Le jour avant la perfusion, de préparer des volumes appropriés de solution saline tamponnée au phosphate (PBS), 3,5% d&#39; acroléine et 4% de paraformaldehyde (PFA) de 13 solutions et de les stocker à 4 ° CO / N. Note: Ces solutions seront utilisées à la fois pour la perfusion et l&#39;immunohistochimie pré-enrobage. Faites attention lorsque vous travaillez avec l&#39;acroléine, comme il est corrosif et toxique à la foisles chercheurs et l&#39;environnement. En outre, étant donné que l&#39;acroléine est corrosif pour le plastique, utilisez toujours la verrerie appropriée pour préparer des solutions d&#39;acroléine. </li><li> Le jour de la perfusion, on filtre le PFA et de l&#39;acroléine à l&#39;aide d&#39;un papier filtre grossier de rétention de particules de 25 um. </li><li> Au cours de la perfusion, en utilisant une pompe péristaltique pour fournir 15 ml de PBS, 75 ml d&#39;acroléine et 150 ml de PFA successivement dans la circulation sanguine de la souris, à un débit de 25 ml / min. Faites attention. Effectuer perfusion strictement à l&#39;intérieur d&#39;une hotte pour éviter les fumées nocives de PFA et de l&#39;acroléine. <ol><li> Pour mettre en place la pompe, insérez une extrémité dans la solution PBS, remplir la tubulure (maintenant environ 15 ml) avec du PBS, et fixer une aiguille ailée de collecte de sang 25 G à l&#39;autre extrémité. En tout temps, veiller à ce que le tube est exempt de bulles d&#39;air. </li><li> Placer le tube directement dans la bouteille d&#39;acroléine après le réglage de la pompe de perfusion avec le tube rempli avec du PBS. </li></ol></li><li> Unesthétiser une souris à la fois avec 90 mg / kg de dose de poids corporel de pentobarbital de sodium injecté par voie intrapéritonéale en utilisant une ½ aiguille 27 G. Évaluer les réponses aux pincements arrière / orteil. Procéder seulement si la souris ne répond pas à ces répulsifs, des stimuli douloureux. </li><li> Fixer la souris en position couchée (couché sur le dos avec le visage vers le haut) en collant les pattes et pattes arrière à la surface de travail et d&#39;exposer soigneusement le cœur sans causer de dommages à d&#39;autres organes. Assurez-vous de travailler rapidement après la perforation de la membrane. <ol><li> Effectuer une incision à travers la peau avec des ciseaux chirurgicaux le long de la ligne médiane thoracique commençant caudale à la cage thoracique et procéder rostrale à la clavicule. </li><li> Faire deux incisions latérales supplémentaires le long de la base de la cage thoracique ventrale. Déplacez doucement et épinglez les deux volets de la peau, en veillant à exposer l&#39;ensemble de la cavité thoracique. </li><li> Tenir le processus xiphoïde avec des pinces émoussées pour exposer la cavité thoracique et stabiliser les ciseaux pointuss. Couper à travers le diaphragme et la cage thoracique, en prenant soin d&#39;éviter de percer les poumons, et continuer l&#39;incision rostrale aux clavicules. Assurez-vous de travailler rapidement après la perforation de la membrane. </li></ol></li><li> déchirer doucement le sac péricardique avec une pince contondants. Tenez le cœur stable avec pince émoussée, couper l&#39;oreillette droite, et commencer la perfusion de PBS. insérer immédiatement l&#39;aiguille de collecte de sang dans le ventricule gauche. </li><li> Perfuser la souris avec du PBS (dans les tubes), suivie d&#39;acroléine pendant 3 min (ce qui correspond à 75 ml), puis passer à PFA pendant 6 min (ce qui correspond à 150 ml). Assurez-vous de mettre en pause le débit de la pompe avant de solution de commutation pour empêcher les bulles d&#39;entrer dans le tube. </li><li> Décapitez la souris et extraire le cerveau fixe et le placer directement dans un flacon en verre contenant 4% PFA pendant au moins 2 heures à 4 ° C. <ol><li> Pour extraire le cerveau, utiliser des ciseaux et des pinces pour couper à travers la peau pour exposer le crâne. Casser soigneusement l&#39;op du crâneen entre les yeux, et ébrécher petits morceaux de celui-ci pour exposer le cerveau sous-jacent. </li><li> Retirez délicatement le cerveau et après correction exposée avec 4% PFA pour 2 h de plus avant de procéder pour vibratome tronçonnage. </li></ol></li></ol> 4. Cerveau Sectionnement L&#39;utilisation d&#39;un Vibratome <ol><li> Laver le cerveau fixe 3 fois avec PBS refroidi. En utilisant une lame de rasoir, retirez le bulbe olfactif (à moins que cette région est sous enquête) et couper le cerveau transversalement dans 2 - 3 pièces d&#39;environ la même hauteur, qui peuvent tous être sectionnés simultanément afin d&#39;accélérer la procédure. </li><li> Coller les morceaux de tissu cérébral verticalement sur la plaque d&#39;échantillon fixé dans le bac. Assurez-vous que la surface lisse de coupe colle fermement à la plaque d&#39;échantillon et ne soit pas délogée pendant la procédure de découpe. Ajouter suffisamment de solution PBS dans le bac jusqu&#39;à la surface du cerveau entier est complètement immergé. Il est important de garder ee morceaux de cerveau et les sections suivantes complètement immergés dans du PBS tout au long de cette étape. </li><li> Placer le plateau dans le vibratome, régler la vitesse de coupe de 0,5 mm / s, la fréquence de sectionnement à 90 Hz, et l&#39;épaisseur de la charge à 50 um, pour un rendement de 50 um d&#39;épaisseur des sections. Puis transférer les sections dans des flacons de verre 20 ml contenant une solution cryoprotectrice (40% PBS, 30% d&#39;éthylène glycol, et 30% de glycérol) à l&#39;aide d&#39;un pinceau fin. Conserver les flacons à -20 ° C jusqu&#39;à utilisation ultérieure. Vous pouvez également conserver les sections dans du PBS pour le dépistage immédiat comme décrit dans les étapes suivantes. </li></ol> 5. L&#39;article Dépistage de la présence de plaques Méthoxy-X04-tachés <ol><li> À l&#39;aide d&#39;un cerveau de souris stéréotaxique atlas 14 sections, sélectionner le cerveau contenant la région d&#39;intérêt, par exemple, l&#39;hippocampe CA1 tel qu&#39;il est utilisé dans le présent exemple. Placez chaque section dans un puits dans une plaque de culture de 24 puits contenant assez de solution cryoprotectricede manière à empêcher les sections de sécher. </li><li> Examinez chaque section successivement, pour éviter le dessèchement des sections, en utilisant la procédure suivante: <ol><li> Ajouter une goutte de PBS à une lame de microscope avec une pipette jetable, et placer la section sur la goutte. </li><li> Examinez la section sous un microscope à fluorescence pour identifier les régions contenant des plaques Aß méthoxy-X04 marqués. Note: méthoxy-X04 peut être facilement visualisé en utilisant une fluorescence ultraviolette (UV) filtre (excitation à 340-380 nm). </li></ol></li><li> Capture d&#39;images de régions d&#39;intérêt (ROI) dans le champ lumineux, ainsi que dans le mode de fluorescence sans bouger la platine du microscope, car chaque image doit montrer la même région dans les deux domaines afin de corréler la présence des plaques directement à la région structurelle de la section de tissu. </li><li> Enregistrez et nommez les images prises en fonction du nombre d&#39;animaux. Notez aussi le nombre de puits dans la plaque et le champ des images taKentucky Par exemple, Ex: 9978A1B; Numéro animale: 9978; Bien numéro: A1; Champ: Bright. Placez la section arrière dans son bien désigné une fois que l&#39;imagerie est terminée. Remarque: En fin de compte, pour chaque section examinée, deux images sont obtenues, l&#39;un dans le champ lumineux et une autre dans le domaine UV. </li><li> Ouvrez les deux images de la même ROI (un dans le champ lumineux et l&#39;autre dans le domaine UV) dans l&#39;image J, et en utilisant le plugin MosaicJ, aligner les bords des deux images et enregistrer l&#39;image alignées et combinées en fonction du nombre de puits, il est venu. </li><li> Enregistrez l&#39;image dans un dossier séparé avec le numéro de l&#39;animal particulier. Combiner les images pour identifier et localiser les plaques dans la section de tissu, et d&#39;avoir une vue complète de l&#39;ensemble de la section dans les deux champs différents (lumineux et UV). </li><li> Après le processus de sélection est terminée, stocker les sections examinées à -20 ° C dans une plaque de culture à 24 puits contenant cryoprotecteur jusqu&#39;à immunocoloration ou le traitement ultérieur est carried out. </li></ol> 6. Pré-enrobage immunocoloration pour IBA1 Remarque: Effectuez l&#39;immunocoloration pour IBA1 sur des sections choisies librement flottantes en plaçant la plaque sur une bascule se déplaçant lentement à température ambiante. <ol><li> Laver soigneusement les sections 3 fois avec environ 1 ml de PBS, chaque lavage durable pendant 10 min. </li><li> Étancher peroxydases endogènes avec 0,3% de peroxyde d&#39;hydrogène dans une solution PBS pendant 10 min. Cette étape empêche une activité de peroxydase non spécifique, ce qui est important pour éviter la coloration de fond. </li><li> Laver le tissu dans du PBS 3 fois pendant 10 minutes chacune. </li><li> Incuber les sections de borohydrure de sodium à 0,1% dans une solution PBS pendant 30 min. Cette étape est importante pour réduire les aldéhydes restants de l&#39;étape de fixation, et il est particulièrement important si l&#39;acroléine est utilisé dans la fixation du tissu. </li><li> Laver le tissu dans du PBS 3 fois pendant 10 minutes à chaque fois et assurez-vous d&#39;enlever toutes les bulles. </li><li> Bloquer les sections pendant 1 h.Différents anticorps peuvent nécessiter des temps et des solutions de blocage. Pour IBA1, préparer le tampon de blocage contenant 10% de sérum bovin fœtal, 3% d&#39;albumine de sérum bovin et 0,01% de Triton X-100 dans 50 mM de solution saline tamponnée au Tris (TBS, pH 7,4). Remarque: L&#39;étape de blocage est d&#39;empêcher la liaison non spécifique de l&#39;anticorps primaire. La faible concentration de Triton X-100 permet une légère perméabilisation des membranes pour une meilleure coloration, et est suffisamment faible pour conserver la plupart des caractéristiques ultrastructurales des tissus sous EM. </li><li> Retirer le tampon de blocage à partir du tissu et laisser incuber dans une solution d&#39;anticorps primaire (anticorps de lapin anti-IBA1, dilué [1: 1000] dans un tampon de blocage) à 4 ° CO / N. </li><li> Laver à TBS 3 fois pendant 10 min à chaque fois. </li><li> Incuber dans un anticorps secondaire (chèvre anti-lapin conjugué à la biotine) [1: 200] dans TBS 0,05 M pendant 90 min. </li><li> Laver à TBS 5 fois pendant 5 min à chaque fois. </li><li> Incuber dans avidine-biotine solution complexe (avidine [1: 100], biotine [1: 100]) dans TBSla solution pendant 1 heure. </li><li> Laver à TBS 5 fois pendant 5 min à chaque fois. </li><li> Révéler la coloration IBA1 avec 0,05% de diaminobenzidine (DAB) et 0,015% de peroxyde d&#39;hydrogène dans du TBS pendant 8 min. Remarque: Le calendrier de développement DAB peut varier d&#39;un protocole à protocole et devrait être déterminé en examinant rapidement les sections colorées sous un microscope optique. Note: Pour IBA1, on devrait être en mesure de visualiser clairement les corps cellulaires et les processus des microglies IBA1 tachés au 20X (voir la figure 2 par exemple représentatif). Soyez prudent en utilisant DAB, car il est un cancérigène connu. </li><li> Évitez de trop développer en surveillant attentivement les sections (comme décrit ci-dessus) au cours de cette étape. Arrêter la réaction par lavage des coupes PB refroidi à 5 fois pendant 5 min à chaque fois. </li></ol> 7. Traitement de microscopie électronique <ol><li> Préparer une solution de tétroxyde d&#39;osmium à 1% dans du PBS dans un flacon en verre. Tétroxyde d&#39;osmium est photosensible; couvrir la gflacon lass de papier d&#39;aluminium pour protéger la solution de la lumière. Soyez prudent en utilisant le tétroxyde d&#39;osmium, car il est un produit chimique très dangereux. Effectuez cela et les étapes suivantes à l&#39;intérieur d&#39;une hotte. </li><li> Retirez le PBS des sections et étaler à plat à l&#39;aide d&#39;un pinceau fin. Effectuez cette étape un puits à la fois pour maintenir les sections de se dessécher. Assurez-vous d&#39;aplatir les sections immédiatement avant d&#39;ajouter tétroxyde d&#39;osmium, comme les plis dans les sections deviendront permanents et de tenter d&#39;aplatir le tissu après l&#39;osmium fixation ne fera que briser les sections. </li><li> Immerger les sections de tétroxyde d&#39;osmium pendant 30 min à température ambiante, en ajoutant une goutte de tétroxyde d&#39;osmium à la fois avec une pipette de transfert, afin d&#39;empêcher les sections de pliage. Couvrir le puits avec du papier d&#39;aluminium pour protéger les sections de la lumière. Remarque: Cette étape fixe les lipides dans les sections. Le tissu apparaît très sombre après l&#39;osmium post-fixation. </li><li> Alors que les sections sont en osmium tetroxyde, préparer la résine de plastique dans un bécher jetable en mélangeant le composant 20 g A, 20 g composant B, 0,6 g composant C, et 0,4 g composante D. Combiner les composants ensemble dans l&#39;ordre ci-dessus et bien mélanger à l&#39;aide d&#39;une pipette de 10 ml sérologiques jusqu&#39;à ce qu&#39;une couleur uniforme soit obtenue. </li><li> Transférer le mélange préparé à des plats en aluminium pesant. Ils recevront les sections de tissu une fois qu&#39;ils ont été déshydratés. </li><li> Déshydrater les sections dans des concentrations croissantes d&#39;éthanol pendant 2 min dans l&#39;ordre suivant: 35%, 35%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100%, 100%. </li><li> Pour éliminer l&#39;éthanol résiduel, immerger les sections dans de l&#39;oxyde de propylène 3 fois pendant 2 min à chaque fois. Retirer les déshydratées-sections de la plaque de culture de 24 puits dans 20 ml des flacons en verre. Toujours utiliser des flacons en verre lorsque l&#39;on travaille avec de l&#39;oxyde de propylène se dissout en plastique, et maintenir la prudence, car il est dangereux. </li><li> Utiliser un embout de pipette en verre courbé ou un pinceau fin pour transférer les sections de soluti d&#39;oxyde de propylènesur dans la résine et laisser O / N pour l&#39;infiltration à la température ambiante. Veillez à ne pas diluer la résine avec de l&#39;oxyde de propylène. </li><li> Incorporer la section avec la résine de poly-chloro-tri-fluoro-éthylène (PCTFE) filmsheets: <ol><li> Placer les boîtes en aluminium pesant contenant les échantillons dans un 50 - four à 60 ° C pendant 10 à 15 minutes avant l&#39;enrobage sur les sections filmsheets PCTFE. </li><li> Lors de l&#39;incorporation des sections, travailler avec une pesée en aluminium plat à la fois. L&#39;utilisation d&#39;un pinceau fin, peindre une fine couche de résine sur la feuille de film d&#39;un PCTFE. </li><li> Déplacer une section de tissu à un moment de la pesée en aluminium plat à la feuille de film de PCTFE. Retirer l&#39;excès de résine à travers le tissu, en faisant attention de ne pas le déranger. </li><li> Après avoir déplacé toutes les sections d&#39;une coupelle de pesage à la feuille de film de PCTFE, placer une seconde feuille de PCTFE sur la première, la création d&#39;un sandwich de tissu et de la résine entre les 2 feuilles. </li></ol></li><li> Polymériser la résine dans un incubateur pendant 3 jours à 55-60 ° C. </li><li> Le matériel est maintenant prêt pour ultramince tronçonnage et l&#39;examen ultrastructural, des techniques spécialisées qui sont souvent effectuées par EM installations de base. Conserver les échantillons entre films PCTFE feuilles en toute sécurité à la température ambiante sans dégradation ultrastructural. Remarque: Les étapes suivantes pour ultramince sectionner et de transmission Examen de microscopie électronique sont expliquées dans un protocole séparé 13. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Ce protocole explique une approche corrélative pour le ciblage noyau dense plaques Aß avec EM. Méthoxv-X04 dans l&#39; injection in vivo permet la sélection rapide des coupes de cerveau qui contiennent des plaques d&#39; Aß à l&#39; intérieur des régions particulières et les couches présentant un intérêt, par exemple CA1 de l&#39; hippocampe, radiatum strates et lacunosum-moleculare. Dans le présent exemple, méthoxy-X04 pré-sélection a été combiné avec pré-enrobage immunocoloration ...

Amyloïde Aß formation de plaque est la principale caractéristique neuropathologique de la maladie d&#39;Alzheimer (MA). Cependant des preuves croissantes suggèrent des rôles importants du système immunitaire dans la progression de la maladie 1,2. En particulier, de nouvelles données provenant d&#39;études précliniques et cliniques établies dysfonctionnement immunitaire en tant que principal moteur et contributeur à la pathologie AD. Avec ces résultats, les cellules immunitaires centrales et périphériques ont émergé comme des cibles thérapeutiques prometteuses pour AD 3. Le protocole suivant combine la lumière et microscopie électronique (EM) pour générer de nouvelles connaissances sur la relation entre Aß dépôt de plaque et les modifications phénotypiques microgliales dans AD. Ce protocole permet l&#39;étiquetage des plaques Aß dans des modèles murins de AD à l&#39; aide de l&#39;injection in vivo du colorant fluorescent méthoxy-X04. Méthoxy-X04 est un dérivé du rouge Congo qui peut facilement traverser la barrière hémato-encéphalique pour entrer dans le parenchyme cérébral et lier des feuilles β-plissés à haute uneffinity. Etant donné que le colorant est fluorescent, il peut être utilisé pour la détection in vivo de Aß dépôt de plaques avec microscopie biphotonique 4. Une fois lié à Aß, méthoxy-X04 ne se dissocie pas ou redistribuer loin des plaques, et il conserve sa fluorescence au fil du temps. Il est généralement administré périphériquement pour permettre l&#39;imagerie non invasive de la dynamique du cerveau 5. La fluorescence reste également suivant l&#39; aldéhyde fixation, permettant des analyses corrélative post-mortem, y compris l&#39; enquête de la mort neuronale dans le voisinage des plaques Aß 6. Ce protocole tire profit des propriétés de méthoxy-X04 pour sélectionner des coupes de cerveau de souris APP SWE / PS1A 246E (APP-PS1; coexpression une double mutation au gène APP Lys670Asn / Met671Leu, et la variante de la préséniline PS1-A264E humaine) 7 qui présentent Aß plaques dans les régions d&#39;intérêt spécifiques (hippocampe CA1, radiatum strates, et lacunosum-moleculare) Avant d&#39;effectuer une pré-enrobage immunocoloration contre le marqueur microglial ionisé molécule adaptatrice liant le calcium 1 (IBA1) pour visualiser les organes et processus avec EM cellules microgliales. Les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de solution méthoxy-X04, 24 heures avant le cerveau fixation par perfusion transcardial. des sections coronales de cerveau sont obtenues en utilisant un vibratome. Les articles contenant le CA1 de l&#39;hippocampe sont examinés sous un microscope à fluorescence pour la présence de plaques Aß en radiatum strates et lacunosum-moleculare. Immunocoloration pour IBA1, tétroxyde d&#39;osmium post-fixation, et plastique enrobage de résine sont ensuite effectuées sur les sections du cerveau sélectionnées. A la fin de ce protocole, les sections peuvent être archivés sans autre dégradation ultrastructural, prêt pour ultramince tronçonnage et l&#39;examen ultrastructural. Fait important, les plaques sont encore fluorescentes après immunocoloration avec des anticorps différents, par exemple IBA1 comme dans le présent protocole. Ils deviennent plus sombres than leur de neuropile environnant suivant tétroxyde d&#39;osmium post-fixation, indépendamment de méthoxy-X04 coloration, ce qui permet d&#39;identifier avec précision les régions d&#39;intérêt, généralement jusqu&#39;à quelques millimètres carrés, à examiner au microscope électronique à transmission. Cette approche corrélative offre un moyen efficace pour identifier les sections spécifiques du cerveau à examiner au niveau ultrastructural. Cela est particulièrement utile lors de l&#39;étude au début de pathologie AD, au sein des régions ou des couches spécifiques du cerveau qui ne peut contenir que quelques plaques de Aß, présents dans seulement une petite fraction des coupes de tissus. Pendant ces temps surtout, il serait inefficace d&#39;utiliser immunocoloration Aß (et double étiquetage pour d&#39;autres marqueurs cellulaires tels que IBA1) sur plusieurs sections du cerveau simplement pour donner une petite fraction contenant des plaques Aß au bon endroit. En outre, l&#39;injection de souris vivantes avec méthoxy-X04 avant le sacrifice et le traitement des tissus ne fait pas compromise la préservation ultrastructural. D&#39; autres méthodes telles que post-mortem coloration au rouge Congo, thioflavine S, thioflavine T ou méthoxy-X04 sur des coupes de tissus fixes nécessitent une différenciation de coloration dans l&#39; éthanol, 8-11 qui provoque un stress osmotique et perturbe l&#39;ultrastructure. Congo - Rouge est également un cancérogène humain connu 12.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1006">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Methoxy-X04</td>
			<td style="width:197px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">4920</td>
			<td style="width:167px;">10 mg substrate per tablet</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene glycol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>W294004&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP231-1</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Chloride NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9625</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris Hydrochloride</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP153500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Acrolein&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110221</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde Granular</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19210</td>
			<td>Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Filter paper</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>09-790-14F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peristaltic Pump with Tubing</td>
			<td>ColeParmer</td>
			<td>cp.78023-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Excel Winged blood Collection Set Needles 25G&#160;</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>367341</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Extrafine Forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11152-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14090-09</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hartman Hemostats</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>13003-10</td>
			<td>Tip shape: curved</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Surgical Scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14004-16</td>
			<td>Tip shape: straight</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Scissors</td>
			<td>ROBOZ surgical store</td>
			<td>5818</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass scintillation vials</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>74515-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibrating Blade Michrotome Leica VT1000 S</td>
			<td>Leica Biosystems&#160;</td>
			<td>14047235612</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Vibratome blades</td>
			<td>Electron microscopy Sciences</td>
			<td>71990</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope Slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">24-well Tissue Culture Plates</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>353047</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylene Glycol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP230-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td>Fisher BioReagents</td>
			<td>BP229-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hydrogen Peroxide, 30%</td>
			<td>J.T.BAKER</td>
			<td>cat: 2186-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium borohydride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>480886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris HCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>BP153-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine Serum (FBS)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F1051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine serum albumin (BSA), fraction V</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>C001H24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti IBA1, Rabbit&#160;</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat Anti-Rabbit IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>111066046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">VECTASTAIN Elite ABC Kit (Standard)</td>
			<td>Vector Labs</td>
			<td>PK-6100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">3.3&#39;-Diaminobenzidine tetra-hydrochloride (DAB)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905-50TAB</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Osmium tetroxide, 4% solution</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>19150</td>
			<td>Caution: toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component A</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44611</td>
			<td>Resin Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44612</td>
			<td>Hardener Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component C</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44613</td>
			<td>Plasticizer Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:523px;">Durcupan&#8482; ACM single component D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>44614</td>
			<td>Accelerator Caution: Toxic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol</td>
			<td>LesAlcoolsdeComerce</td>
			<td>151-01-15N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Propylene oxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>110205</td>
			<td>Caution: corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum weigh dishes</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70048-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ACLAR&#174;&#8211;Fluoropolymer Films</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>50425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oven/Incubator</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative light and electron microscopy to study microglial interactions with &#946;-amyloid plaques

Un protocole détaillé est fourni ici pour identifier les plaques amyloïdes de Aß dans des coupes de cerveau à partir des modèles de souris de la maladie d&#39;Alzheimer avant le pré-enrobage immunocoloration (spécialement pour ionisée adaptateur molécule de liaison du calcium 1 (IBA1), une protéine de liaison du calcium exprimée par la microglie) et le traitement des tissus pour la microscopie électronique (EM). Méthoxy- X04 est un colorant fluorescent qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à des feuilles plissé ß trouvées dans les plaques de Aß noyau dense de manière sélective. L&#39;injection des animaux avec des méthoxy-X04 avant le sacrifice et le cerveau de fixation permet de pré-criblage et le choix des coupes de cerveau contenant plaque dentaire pour un traitement ultérieur avec des manipulations consommatrices de temps. Cela est particulièrement utile lorsque l&#39;on étudie la pathologie AD précoce au sein des régions ou des couches spécifiques du cerveau qui peuvent contenir très peu de plaques, présents dans seulement une petite fraction des sections. traitement post-mortem des coupes de tissus avec le Congo-Rouge, thioflavine S et Thioflavin T (ou même avec méthoxy-X04) peuvent étiqueter des feuilles ß plissés, mais nécessite une vaste clairière avec de l&#39;éthanol pour éliminer l&#39;excès de colorant et ces procédures sont incompatibles avec la préservation ultrastructural. Il serait également inefficace pour effectuer l&#39;étiquetage pour Aß (et d&#39;autres marqueurs cellulaires tels que IBA1) sur toutes les sections du cerveau des régions d&#39;intérêt, seulement pour donner une petite fraction contenant des plaques Aß au bon endroit. Fait important, les plaques Aß sont encore visibles après le traitement des tissus pour EM, permettant une identification précise des zones (généralement jusqu&#39;à quelques millimètres carrés) d&#39;examiner avec le microscope électronique.

Cette section illustre les résultats qui peuvent être obtenus à différentes étapes critiques du protocole. En particulier, les résultats montrent des exemples de coupes de cerveau contenant méthoxy-X04 plaques colorées dans une région spécifique et des couches d&#39;intérêt: le CA1 de l&#39;hippocampe, radiatum strates, et lacunosum-moleculare. Les plaques et de l&#39; organisation régionale / lamellaire de l&#39;hippocampe sont successivement visualisées en utilisant une c...

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Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with &#946;-Amyloid Plaques

Cet article décrit un protocole pour la visualisation de plaques amyloïdes Aß dans les modèles de souris de la maladie d&#39;Alzheimer en utilisant méthoxy-X04, qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à la ß-plissés feuilles trouvées dans noyau dense plaques Aß sélectivement. Il permet la présélection des coupes de tissus contenant la plaque-avant immunocoloration et de traitement pour la microscopie électronique.

Corrélative microscopie optique et électronique pour l&#39;étude microgliales Interactions avec plaques ß-amyloïde

A detailed protocol is provided here to identify amyloid A&#946; plaques in brain sections from Alzheimer&#39;s disease mouse models before pre-embedding ...

correlative-light-electron-microscopy-to-study-microglial

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K vues.  CHU de Québec Research Center.  Cet article décrit un protocole pour la visualisation de plaques amyloïdes Aß dans les modèles de souris de la maladie d'Alzheimer en utilisant méthoxy-X04, qui traverse la barrière hémato-encéphalique et se lie à la ß-plissés feuilles trouvées dans noyau dense plaques Aß sélectivement. Il permet la présélection des coupes de tissus contenant la plaque-avant immunocoloration et de traitement pour la microscopie électronique. 

Vidéo: Correlative Light and Electron Microscopy to Study Microglial Interactions with β-Amyloid Plaques

Focussed Ion Beam Milling and Scanning Electron Microscopy of Brain Tissue

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron microscope (FIB/SEM). The samples are fixed with aldehydes, heavy metal stained using osmium tetroxide and uranyl acetate. They are then dehydrated with alcohol and infiltrated with resin, which is then hardened. Using a light microscope and ultramicrotome with glass knives, a small block containing the region interest close to the surface is made. The block is then placed inside the FIB/SEM, and the ion beam used to roughly mill a vertical face along one side of the block, close to this region. Using backscattered electrons to image the underlying structures, a smaller face is then milled with a finer ion beam and the surface scrutinised more closely to determine the exact area of the face to be imaged and milled. The parameters of the microscope are then set so that the face is repeatedly milled and imaged so that serial images are collected through a volume of the block. The image stack will typically contain isotropic voxels with dimenions as small a 4 nm in each direction. This image quality in any imaging plane enables the user to analyse cell ultrastructure at any viewing angle within the image stack.

This protocol describes how resin embedded brain tissue can be prepared and imaged in the three dimensions in the focussed ion beam, scanning electron microscope.

Ion Beam ciblée de fraisage et de microscopie électronique à balayage du tissu cérébral

This protocol describes how biological samples, like brain tissue, can be imaged in three dimensions using the focussed ion beam/scanning electron ...

Recherche

Neurosciences

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer basic questions on how light information is processed and shared between rapid and circadian behaviors. Drosophila larvae display a stereotypical avoidance behavior when exposed to light. To investigate light dependent behaviors comparably simple light-dark preference tests can be applied. In vertebrates and arthropods the neural pathways involved in sensing and processing visual inputs partially overlap with those processing photic circadian information. The fascinating question of how the light sensing system and the circadian system interact to keep behavioral outputs coordinated remains largely unexplored. Drosophila is an impacting biological model to approach these questions, due to a small number of neurons in the brain and the availability of genetic tools for neuronal manipulation. The presented light-dark preference assay allows the investigation of a range of visual behaviors including circadian control of phototaxis.

Light Preference Assay to Study Innate and Circadian Regulated Photobehavior in Drosophila Larvae

Here we describe a light-dark preference test for Drosophila larva. This assay provides information about innate and circadian regulation of light sensing and processing photobehavior.

Essai de préférence la lumière pour étudier innée et circadien Photobehavior Réglementé<em&gt; Drosophila</em&gt; Les larves

Light acts as environmental signal to control animal behavior at various levels. The Drosophila larval nervous system is used as a unique model to answer ...

Micron-scale Resolution Optical Tomography of Entire Mouse Brains with Confocal Light Sheet Microscopy

Understanding the architecture of mammalian brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience. However, mapping neuronal soma and projections throughout the whole brain is still challenging for imaging and data management technologies. Indeed, macroscopic volumes need to be reconstructed with high resolution and contrast in a reasonable time, producing datasets in the TeraByte range. We recently demonstrated an optical method (confocal light sheet microscopy, CLSM) capable of obtaining micron-scale reconstruction of entire mouse brains labeled with enhanced green fluorescent protein (EGFP). Combining light sheet illumination and confocal detection, CLSM allows deep imaging inside macroscopic cleared specimens with high contrast and speed. Here we describe the complete experimental pipeline to obtain comprehensive and human-readable images of entire mouse brains labeled with fluorescent proteins. The clearing and the mounting procedures are described, together with the steps to perform an optical tomography on its whole volume by acquiring many parallel adjacent stacks. We showed the usage of open-source custom-made software tools enabling stitching of the multiple stacks and multi-resolution data navigation. Finally, we illustrated some example of brain maps: the cerebellum from an L7-GFP transgenic mouse, in which all Purkinje cells are selectively labeled, and the whole brain from a thy1-GFP-M mouse, characterized by a random sparse neuronal labeling.

In this article we describe the full experimental procedure to reconstruct, with high resolution, the fine brain anatomy of fluorescently labeled mouse brains. The described protocol includes sample preparation and clearing, specimen mounting for imaging, data post-processing and multi-scale visualization.

Résolution tomographie optique de cerveaux de souris entières avec Feuille confocale microscopie optique Micron-échelle de

Understanding the architecture of mammalian  brain at single-cell resolution is one of the key issues of neuroscience.  However, mapping neuronal soma and ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Le système olfactif comme un modèle pour étudier des modèles axonale croissance et la morphologie<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the barrier and the brain parenchyma is still an unmet need. To fill this gap, we designed a 2D in cellulo model, the BBB-Minibrain, by combining a polyester porous membrane culture insert human BBB model with a Minibrain formed by a tri-culture of human brain cells (neurons, astrocytes and microglial cells). The BBB-Minibrain allowed us to test the transport of a neuroprotective drug candidate (e.g., Neurovita), through the BBB, to determine the specific targeting of this molecule to neurons and to show that the neuroprotective property of the drug was preserved after the drug had crossed the BBB. We have also demonstrated that BBB-Minibrain constitutes an interesting model to detect the passage of virus particles across the endothelial cells barrier and to monitor the infection of the Minibrain by neuroinvasive virus particles. The BBB-Minibrain is a reliable system, easy to handle for researcher trained in cell culture technology and predictive of the brain cells phenotypes after treatment or insult. The interest of such in cellulo testing would be twofold: introducing derisking steps early in the drug development on the one hand and reducing the use of animal testing on the other hand.

Here we present a protocol describing the setting of an in cellulo BBB (Blood brain barrier)-Minibrain polyester porous membrane culture insert system in order to evaluate the transport of biomolecules or infectious agents across a human BBB and their physiological impact on the neighboring brain cells.

Un modèle d’Interface humaine hémato-encéphalique pour étudier les passages barrière de pathogènes ou de médicaments et de leurs Interactions avec le cerveau

The early screening of nervous system medicines on a pertinent and reliable in cellulo BBB model for their penetration and their interaction with the ...

Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins Using the PRIMO System for Micro-Patterning to Study Cell Responses to Extracellular Matrix Proteins

Cells sense a variety of extracellular cues, including the composition and geometry of the extracellular matrix, which is synthesized and remodeled by the cells themselves. Here, we present the method of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins (LIMAP) using the PRIMO system as a patterning technique to produce micro-patterned extracellular matrix (ECM) substrates using a single or combination of proteins. The method enables printing of ECM patterns in micron resolution with excellent reproducibility. We provide a step-by-step protocol and demonstrate how this can be applied to study the processes of neuronal pathfinding. LIMAP has significant advantages over existing micro-printing methods in terms of the ease of patterning more than one component and the ability to generate a pattern with any geometry or gradient. The protocol can easily be adapted to study the contribution of almost any chemical component towards cell fate and cell behavior. Finally, we discuss common issues that can arise and how these can be avoided.

Our overall aim is to understand how cells sense extracellular cues that lead to directed axonal growth. Here, we describe the methodology of Light-Induced Molecular Adsorption of Proteins, used to produce defined micro-patterns of extracellular matrix components in order to study specific events that govern axon outgrowth and pathfinding.

Adsorption moléculaire induite par la lumière des protéines utilisant le système PRIMO pour la micro-modélisation pour étudier les réponses cellulaires aux protéines de matrice extracellulaires

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Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) for the Study of Dendritic Spines

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In addition, some features of dendritic spines, such as volume of the spine and post-synaptic density (PSD) (representing post-synaptic part of the synapse), presence of presynaptic terminal, and smooth endoplasmic reticulum or atypical form of PSD (e.g., multi-innervated spines), can be observed only with 3D EM. By employing serial block-face scanning electron microscopy (SBEM) it is possible to obtain 3D EM data easier and in a more reproducible manner than when performing traditional serial sectioning. Here we show how to prepare mouse hippocampal samples for SBEM analysis and how this protocol can be combined with immunofluorescence study of dendritic spines. Mild fixation perfusion allows us to perform immunofluorescence studies with light microscopy on one half of the brain, while the other half was prepared for SBEM. This approach reduces the number of animals to be used for the study.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBEM for the Study of Dendritic Spines

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBEM) is applied to image and analyze dendritic spines in the murine hippocampus.

Microscopie électronique à balayage en bloc en série (SBEM) pour l’étude des épines dendritiques

Three-dimensional electron microscopy (3D EM) gives a possibility to analyze morphological parameters of dendritic spines with nanoscale resolution. In ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Cultures primaires d’astrocytes et de microglies de rat et leur utilisation dans l’étude de la sclérose latérale amyotrophique

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy (CARS) Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature vibrations of molecules. However, these vibrational signatures are also characteristic of molecules within anatomical tissue such as the brain, making it increasingly useful and applicable for Neuroscience applications. For example, CARS can measure lipids by specifically exciting chemical bonds within these molecules, allowing for quantification of different aspects of tissue, such as myelin involved in neurotransmission. In addition, compared to other techniques typically used to quantify myelin, CARS can also be set up to be compatible with immunofluorescent techniques, allowing for co-labeling with other markers such as sodium channels or other components of synaptic transmission. Myelination changes are an inherently important mechanism in demyelinating diseases such as multiple sclerosis or other neurological conditions such as Fragile X Syndrome or autism spectrum disorders is an emerging area of research. In conclusion, CARS can be utilized in innovative ways to answer pressing questions in Neuroscience and provide evidence for underlying mechanisms related to many different neurological conditions.

Coherent Anti-Stokes Raman Spectroscopy CARS Application for Imaging Myelination in Brain Slices

Visualizing myelination is an important goal for many researchers studying the nervous system. CARS is a technique that is compatible with immunofluorescence that can natively image lipids within tissue such as the brain illuminating specialized structures such as myelin.

Application cohérente de spectroscopie Raman anti-Stokes (CARS) pour l’imagerie de la myélinisation dans les tranches de cerveau

Coherent anti-Stokes Raman spectroscopy (CARS) is a technique classically employed by chemists and physicists to produce a coherent signal of signature ...

Corrélative microscopie optique et électronique pour l'étude microgliales Interactions avec plaques ß-amyloïde

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