This work has been financially supported by Grants-in-Aid for Scientific Research from the Ministry of Education, Culture, Sports, Science, and Technology (No. 25248027 to M.S.).

Préparation 1. Echantillon <ol><li> La purification de monomères sensibles à la température <ol><li> Dissoudre 20 g de N -isopropylacrylamide (NIPA) dans 100 ml de toluène. </li><li> Filtrer la solution sous vide pour éliminer la poussière. </li><li> Mélanger le filtrat avec 500 ml d&#39;éther de pétrole. </li><li> Placer le récipient réactionnel dans un bain d&#39;eau glacée. </li><li> Agiter la solution jusqu&#39;à ce que les monomères sont précipités (généralement 30 minutes). </li><li> Filtrer la solution sous aspiration pour obtenir les monomères précipitées. </li><li> Sécher les monomères sous pression réduite (100 Pa) pendant la nuit. </li></ol></li><li> Préparation de la solution de polymère sensible à la température <ol><li> Dégazer 20 mL d&#39;eau déminéralisée pendant 1,0 min en utilisant une pompe à membrane. </li><li> Dissoudre 780,8 mg du PNIA purifié dans 9,5 ml d&#39;eau dégazée et désionisée. </li><li> Placer le récipient réactionnel dans un bain d&#39;eau glacée. </li><li> Bouclier de la réaction dela lumière en recouvrant l&#39;appareil avec du papier d&#39;aluminium. </li><li> Agiter la solution doucement pendant 10 min tout en introduisant un flux modéré de gaz Ar doucement par une pointe de pipette attachée à la bouteille de gaz avec un tube. </li><li> Ajouter 11,9 ul de N, N, N &#39;, N&#39; -tétraméthyléthylènediamine à la solution via une micropipette. </li><li> Agiter la solution pendant 1,0 min, tout en introduisant du gaz Ar, tel que mentionné à l&#39;étape 1.2.5. </li><li> Tout en agitant l&#39;échantillon, on dissout 4,0 mg de persulfate d&#39;ammonium dans 0,5 ml d&#39;eau dégazée et déionisée. </li><li> Mélanger la solution d&#39;échantillon (étape 1.2.7) et une solution de persulfate d&#39;ammonium (étape 1.2.8). </li><li> Agiter la solution pendant 30 s, tout en introduisant du gaz Ar, tel que mentionné à l&#39;étape 1.2.5. </li><li> Couvrir la solution avec du papier d&#39;aluminium et de le conserver au réfrigérateur (4 ° C) pendant la nuit. </li></ol></li><li> Préparation des supports d&#39;échantillons <ol><li> Placer 60 ul de la solution d&#39;échantillon (à partir deétape 1.2.11) dans une glissière de la cavité. </li><li> Couvrir la solution avec un couvercle en verre circulaire. Veillez à ne pas les bulles d&#39;air de piège. </li><li> Retirer l&#39;excès de solution à l&#39;aide d&#39;une micropipette et de laboratoire lingettes. </li><li> Sceller l&#39;échantillon avec de la colle. Laisser sécher la colle à la température ambiante (typiquement 6 h). </li><li> Préparer une autre lame remplie de 0,1% en poids de latex de polystyrène (diamètre de particule de 100 nm) de suspension en suivant les étapes 1.3.1-1.3.4. Cette diapositive est utilisée comme standard. </li></ol></li></ol> 2. Mesure des particules de taille avec un microscope Scattering Dynamic Light <ol><li> Optimisation de l&#39;instrument <ol><li> Placer la lame de suspension de latex de polystyrène (étape 1.3.5) sur la platine du microscope inversé. Le côté du verre de couverture doit faire face vers le bas. </li><li> Placer un amortisseur de faisceau devant le détecteur (une photodiode à avalanche et d&#39;un autocorrélateur). </li><li> Appliquer un faisceau laser (laser à l&#39;état solide, λ = 488 nm, 30 mW, continueonde) à l&#39;échantillon à travers un objectif (10 ×). Une partie de la lumière réfléchie passe par un miroir de lancement du microscope et est observée par une caméra CCD montée à l&#39;orifice latéral du microscope (Figure 1). </li><li> Réglez la hauteur de lentille d&#39;objectif pour régler le point focal à la suspension de l&#39;échantillon en déplaçant la hauteur de lentille de l&#39;objectif de la position basse à élevée. Au cours de cette procédure, l&#39;image réfléchie est focalisée à trois reprises, à la surface du couvercle en verre, à l&#39;interface entre le verre de protection et l&#39;échantillon, et à l&#39;interface entre l&#39;échantillon et le verre de trous glissière. Réglez le point focal entre les deuxième et troisième points. </li><li> Atténuer l&#39;intensité de la lumière diffusée en modifiant la puissance du laser. </li><li> Introduire la lumière diffusée dans le détecteur en supprimant l&#39;amortisseur de faisceau devant le détecteur. Cette unité mesure la corrélation temporelle de l&#39;intensité lumineuse. </li><li> Définir un sténopé (φ = 50 pm) entreen le microscope et le détecteur pour obtenir l&#39;effet confocale. Ajuster la position du trou d&#39;épingle afin de maximiser l&#39;intensité de la lumière au niveau du détecteur. </li><li> Mesurer la fonction de corrélation temporelle de l&#39;intensité de la lumière diffusée pendant 30 secondes en initiant l&#39;opération de corrélateur par l&#39;intermédiaire d&#39;un ordinateur. La fonction de corrélation mesurée est souvent exprimée en g (2) (t) - 1, où t est le temps de corrélation et 4 <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq1.jpg" /> . Ici, I (t) est l&#39;intensité de la lumière diffusée à l&#39;instant t et (•••) T est la moyenne de temps. Le temps de décroissance sera d&#39;environ 0,1 ms. </li><li> Réglez le point focal pour obtenir une large gamme pour l&#39;amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle (g (2) (t = 0) - 1). NOTE: L&#39;amplitude initiale est fortement affectée par la quantité de lumière réfléchie. En déplaçant le point focal de remorquageard l&#39;interface entre le verre de protection et l&#39;échantillon, la quantité de lumière réfléchie augmente. Pour les diffuseurs de lumière forte, comme du latex de polystyrène, dont l&#39;amplitude initiale peut être modifiée entre 0 et 1. Cependant, il est difficile de régler l&#39;amplitude initiale proche de 1 pour les solutions de polymères les plus courants, car l&#39;intensité de la lumière réfléchie est beaucoup plus élevé que celle de la lumière diffusée. </li><li> Appliquer la transformation de Laplace inverse ( en utilisant le programme de régularisation contraint CONTIN 13,14) à la fonction de corrélation temporelle obtenue pour obtenir la fonction de distribution de taille. Dans les cas où l&#39;amplitude initiale est fixée à moins de 0,2, la fonction de distribution du rayon hydrodynamique montrera un pic pointu autour de 100 nm, ce qui est deux fois le rayon réel (voir la discussion pour plus de détails). </li></ol></li><li> Mesure de l&#39; échantillon <ol><li> Réglez la température de l&#39;étape à 25 ° C. </li><li> Placez une diapositive préparée avec poly-PNIA (PNIPA) solution (étape 1.3.4) sur la platine du microscope. </li><li> Mesurer la fonction de corrélation temporelle de l&#39;intensité de la lumière diffusée en suivant les étapes 2.1.4-2.1.8. Si l&#39;amplitude initiale est supérieure à 0,2, ajuster le point focal pour rendre l&#39;amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle inférieure à 0,2 en suivant l&#39;étape 2.1.9. Une petite amplitude initiale simplifie l&#39;analyse. </li><li> Réglez la température de l&#39;étape à 35 ° C et attendre jusqu&#39;à ce que la solution devient trouble. La température de solution critique inférieure (LCST) de solution de PNIPA est de 32 ° C 15. </li><li> Mesurer la fonction de corrélation temporelle par les étapes suivantes 2.1.4-2.1.8. Si possible, régler la position du point focal pour rendre l&#39;amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle inférieure à 0,2. Pour les solutions turbides, leurs amplitudes initiales ont tendance à augmenter, étant donné que l&#39;intensité de la lumière diffusée augmente, tandis que celle de la lumière réfléchie reste constante. </li><li> Appliquer l&#39;inverse de Laplace transformatisur les fonctions de corrélation temporelle obtenue pour obtenir les fonctions de distribution de taille. Notez que la taille est la moitié de la valeur obtenue dans le cas où l&#39;amplitude initiale est inférieur à 0,2. </li></ol></li></ol>

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</ol>

The authors have nothing to disclose.

L&#39;amplitude initiale de la fonction de corrélation temporelle dépend fortement du point focal, comme représenté sur la figure 2 (a). Cela contredit apparemment le fait que la solution soit homogène ( à l&#39; exception de la couche mince à l&#39;interface) 8. Cette variation de l&#39;amplitude initiale est attribuée à une variation de la quantité de lumière réfléchie. Théorie hétérodyne partielle 16 prévoit que l&#39;amplitude initiale, A, l&#39;intensité de la lumière diffusée, je s, et l&#39;intensité de la lumière réfléchie, I r, satisfait l&#39;équation suivante 1 <img alt="équation 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq2.jpg" /> Cette équation montre que la plus grande I r devient plus petit A devient. Par conséquent, A est réduit en réglant la position du foyer à proximité de l&#39;interface. La diffusion apparente D constante A can est obtenue en ajustant la fonction de corrélation temporelle dans le cas des solutions monodisperses: <img alt="l&#39;équation 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq3.jpg" /> où <img alt="l&#39;équation 4" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq4.jpg" /> . Ici, n est l&#39;indice de réfraction du solvant (eau, 1,33), θ est l&#39;angle dispersé (180 °) et λ est la longueur d&#39; onde de la lumière (514,5 nm). Depuis , nous avons appliqué la géométrie de rétrodiffusion, la valeur de q est fixé. Toutefois, ce point est résolu en utilisant des longueurs d&#39;onde différentes de la lumière. S&#39;il vous plaît noter que tout type de source laser à onde continue est disponible pour construire le microscope DLS. Merci au petit volume irradié, le facteur de cohérence 17 est estimée à plus de 0,99 et est négligeable. Pour les solutions polydispersées, la fonction de distribution D A est obtenue par la transformation de Laplace inverse. e hétérodynes partielsEory prédit aussi que D A ne soit pas la même que la diffusion effective D constante. Ces deux constantes de diffusion satisfont à l&#39;équation suivante: <img alt="l&#39;équation 5" src="/files/ftp_upload/54885/54885eq5.jpg" /> La constante de diffusion D est converti en le rayon hydrodynamique R h en utilisant l&#39;équation de Stokes-Einstein 4. Lorsque A = 1, cette relation devient D A = D. Dans ce cas, le processus de conversion de données est le même que celui de la diffusion dynamique de la lumière commune. La ligne rouge montre la figure 2 (b) correspond à ce cas. En revanche, cette relation devient D A D = 0,5 à la limite de A → 0. Par conséquent, la taille est estimée être deux fois plus grande que la taille réelle lorsque A est faible ( en pratique, inférieure à 0,2), comme le montre la ligne bleue de la figure 2 (b) </strong&gt;. Si l&#39; on sait que A est significativement plus faible, l&#39;axe horizontal peut être déplacé, comme représenté sur la figure 2 (c). En principe, nous pouvons convertir D A en D pour toute valeur de A. Dans la pratique, cependant, il est préférable de définir l&#39;amplitude initiale inférieure à 0,2, puisque simple approximation D A ~ 0,5 D est vrai. Les traits saillants de la technique de diffusion de lumière dynamique microscope ont été démontrées en utilisant une solution de PNIPA. La conformation de PNIPA ci - dessous et au- dessus du LCST a été largement étudiée en utilisant un petit angle de diffusion de neutrons 15,18. En revanche, la diffusion de lumière dynamique n&#39;a pas été utilisée pour l&#39;analyse des PNIPA au- dessus de la LCST en raison de sa turbidité 19. Ce problème est résolu par le microscope de diffusion dynamique de la lumière, comme représenté sur les figures 3 (a) et (b). La taille de ces agrégats est plusieurs &amp;# 181; m, qui ne peut être obtenu soit par un petit angle X-ray / diffusion des neutrons ou des techniques de diffusion de la lumière classiques. Les mesures de résolution temporelle à l&#39;aide de ce système donnent des informations sur le processus d&#39;agrégation au cours du changement de température. L&#39;inconvénient du microscope dynamique de dispersion de la lumière est également illustré sur la figure 3. Pour que le résultat ci - dessous de la LCST, la fonction de corrélation temporelle est fortement affectée par la très petite quantité de poussière présente (les lignes noires en figure 3). Par exemple, la fonction de corrélation de temps ne se dégrade pas complètement, même avec des temps de corrélation de l&#39;ordre de 1,0 s. En effet, le volume irradié avec cet appareil (environ 1,0 um) est nettement plus faible que celle irradiée par le dispositif de diffusion de lumière dynamique habituelle (environ 100 pm). Dans le cas où l&#39;intensité de la lumière dispersée est faible, le signal est masqué par le bruit, telle que celle causée par l&#39;artles montants du centre commercial de la poussière dans la solution. Par conséquent, les trois pics représentés sur la figure 3 (b) peuvent ne pas avoir d&#39; importance quantitative , bien que l&#39;ordre général de la taille est significative. A noter qu&#39;un tel disperseur faible peut être mesurée par un appareil classique de diffusion de lumière dynamique. Nous avons démontré que le microscope dynamique de diffusion de la lumière nous permet de mesurer des échantillons à la fois transparents et turbides avec la même configuration. Etant donné que la longueur du trajet optique dans les échantillons est courte, cette technique peut être appliquée à des échantillons de solides absorbant la lumière, tels que des suspensions de nanotubes de carbone 20. En outre, en raison de sa haute résolution spatiale, cette technique peut être appliquée à des cellules biologiques. Pour son application à la biologie, ce procédé peut également être combiné avec d&#39;autres techniques d&#39;imagerie, telles que la fluorescence et l&#39;imagerie Raman. Ainsi, nous pensons que le microscope dynamique de diffusion de la lumière est un outil puissant pour un large éventail de domaines de recherche.

Particle size is one of the most fundamental properties of colloidal and polymer solutions. Numerous techniques are used to measure the particle size. Particle sizes of 1.0 &#181;m or larger can be measured directly using an optical microscope. For smaller particles, alternative techniques, such as laser diffraction, electron microscopy, or atomic force microscopy, are used2,3. Dynamic light scattering is a commonly-used technique for the measurement of particle size distributions in solutions4. The results obtained using this technique are not derived from images of the particles but from the characteristic time of the fluctuations in scattered light intensity. These fluctuations originate from Brownian motion, which is characterized by a diffusion constant. The size distribution is obtained from the distribution of diffusion constants using the Einstein-Stokes equation. Due to its simplicity, dynamic light scattering is widely used for the routine assessment of solutions, such as paints and food colloids.
Pretreatment is required for most of the techniques used for the particle size measurement of solution samples. In the case of electron microscopy and atomic force microscopy, the sample must be analyzed under vacuum conditions. Therefore, it is difficult to observe the samples in their native forms. Furthermore, for laser diffraction and dynamic light scattering, only diluted samples that are free from multiple scattering and light absorption can be measured. To overcome this difficulty, several new techniques have been proposed for the measurement of dynamic light scattering from undiluted, concentrated solutions, such as cross-correlation spectroscopy5,6, low-coherence dynamic light scattering7,8, diffusing-wave spectroscopy9,10, and differential dynamic microscopy11,12.
We have developed a new apparatus called a dynamic light scattering microscope1. This apparatus enables us to measure turbid samples without dilution by means of a confocal optical system in which multiple scattering is eliminated using a pinhole. However, the measurement procedure and data analysis are slightly more complicated than those of commercially-available instruments. This video explains the measurement procedure and data analysis in detail using the analysis of the temperature-responsive polymer, poly(N-isopropylacrylamide), as an example.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;N&lt;/em&gt;-isopropylacrylamide, 98%</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>I0401</td><td></td></tr><tr><td>toluene, 99%</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>201-01876</td><td></td></tr><tr><td>petroleum ether, distillation temperature 30 ~ 60 &amp;deg;C</td><td>Wako Pure Chemical Industries, Ltd.</td><td>169-22565</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;N,N,N&#039;,N&#039;&lt;/em&gt;-tetramethylethylenediamine, 99%</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>ammonium persulfate, 98%</td><td>Sigma</td><td>248614</td><td></td></tr><tr><td>polystyrene latex suspension, 1 wt%</td><td>Duke Scientific Corporation</td><td>3500A</td><td></td></tr><tr><td>argon</td><td>Koike Sanso Kogyo Co., Ltd.</td><td></td><td>purity &gt; 99.999 vol.%</td></tr><tr><td>cavity slide</td><td>Matsunami Glass Ind.,Ltd.</td><td>83-0336</td><td></td></tr><tr><td>inverted microscope</td><td>Nikon Instech Co., Ltd.</td><td>ECLIPSE Ti-U</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Plate</td><td>Tokai Hit CO.,Ltd</td><td>TP-108R-C</td><td></td></tr><tr><td>Solid-state laser</td><td>Coherent</td><td>OBIS 488LX</td><td></td></tr><tr><td>avalanche photodiode</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-High Q.E. Avalanche Photo Diode</td><td></td></tr><tr><td>correlator</td><td>ALV-GmbH</td><td>ALV-5000/EPP</td><td></td></tr></tbody></table>

measurement of particle size distribution in turbid solutions by dynamic light scattering microscopy

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a technique used to measure the size distribution of polymer solutions or colloidal particles. Although this technique is widely used for the assessment of polymer solutions, it is difficult to measure the particle size in concentrated solutions due to the multiple scattering effect or strong light absorption. Therefore, the concentrated solutions should be diluted before measurement. Implementation of the confocal optical component in a dynamic light scattering microscope1 helps to overcome this barrier. Using such a microscopic system, both transparent and turbid systems can be analyzed under the same experimental setup without a dilution. As a representative example, a size distribution measurement of a temperature-responsive polymer solution was performed. The sizes of the polymer chains in an aqueous solution were several tens of nanometers at a temperature below the lower critical solution temperature (LCST). In contrast, the sizes increased to more than 1.0 &#181;m when above the LCST. This result is consistent with the observation that the solution turned turbid above the LCST.

Les fonctions de temps de corrélation de l&#39; intensité de lumière diffusée pour une suspension de latex de polystyrène (rayon des particules: 50 nm) ont été mesurés à différents points de contact, comme représenté sur la figure 2 (a). Ces fonctions de corrélation ont été transformés en les fonctions de distribution du rayon hydrodynamique par la transformation de Laplace inverse (voir figure 2 (b) et (c)). En utilisant la même procédure, les fonctions de corrélation temporelle et les fonctions de distribution du rayon hydrodynamique de la solution PNIPA ont été obtenus à 25 ° C et 35 ° C, respectivement. Figures 3 (a) et (b) montrent les fonctions de corrélation temporelle de l&#39;intensité de la lumière diffusée et les fonctions de distribution de taille correspondantes de la solution de PNIPA ci - dessous (25 ° C) et au- dessus (35 ° C) la LCST. Les fonctions de distribution granulométrique ont été obtenus par la transformation de Laplace inverse suivie par lacorrection de la hétérodyne partielle. Le rayon hydrodynamique moyen inférieur à la LCST est de plusieurs dizaines de nanomètres, ce qui est typique pour des solutions de polymère. En revanche, le rayon hydrodynamique au-dessus de la LCST est d&#39;environ 1,0 pm. Ce résultat est cohérent avec le fait que la solution est trouble au-dessus de la LCST. Les lignes bleues et rouges sur la figure 3 représentent la répartition granulométrique des solutions obtenues PNIPA immédiatement après et 20 minutes après que la solution devienne turbide, respectivement. La figure 3 (b) montre clairement la croissance de l&#39;agrégat. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig1.jpg" /> Figure 1. Schéma du microscope dynamique de diffusion de lumière. Sténopé (PH), diviseur de faisceau (BS), polariseur (Pol), et photodiode à avalanche (APD). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir</a>une version plus grande de cette figure. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig2.jpg" /> Figure 2. Les résultats représentatifs pour une suspension de latex de polystyrène. (A) fonctions temps de corrélation de l&#39;intensité de la lumière diffusée pour la suspension de latex de polystyrène. Le rayon nominal est de 50 nm et la concentration est de 0,1% en poids. Deux ensembles de données ont été obtenues à partir de différents points de diffusion. (B), (c) les fonctions de distribution de taille correspondante de la suspension de latex de polystyrène obtenus par la transformation de Laplace inverse de (a). La ligne rouge correspond à la fonction de corrélation temporelle, dont l&#39;amplitude initiale est d&#39;environ 1,0, et la ligne bleue correspond à celle d&#39;une amplitude initiale qui est d&#39;environ 0,2. L&#39;axe horizontal a été calculé sans (b) et (c) compte tenu de l&#39;effet de hétérodynage partiel (PHD) lorsque A &lt;&lt;<html> ; 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54885/54885fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54885/54885fig3.jpg" /> Figure 3. Les résultats représentatifs pour une solution de PNIPA. (A) les fonctions Temps de corrélation d&#39;intensité de la lumière diffusée pour la solution de PNIPA. (B) des fonctions de distribution de dimensions correspondantes pour la solution de PNIPA obtenue par la transformation de Laplace inverse de (a). L&#39;axe horizontal a été calculée en tenant compte de l&#39;effet de hétérodynage partielle pour chaque ensemble de données. La ligne noire représente les données obtenues à 25 ° C. La ligne rouge représente les données obtenues juste après que la solution devienne turbide (35 ° C). La ligne bleue représente les données obtenues après une mesure de 20 min de la ligne rouge./54885/54885fig3large.jpg &quot;Target =&quot; _ blank &quot;&gt; S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Measurement of Particle Size Distribution in Turbid Solutions by Dynamic Light Scattering Microscopy

Un protocole pour la mesure directe de la distribution des tailles des particules dans des solutions concentrées en utilisant la microscopie de diffusion dynamique de la lumière est présenté.

Mesure de la distribution granulométrique en turbides Solutions par Dynamic Light Scattering Microscopie

A protocol for measuring polydispersity of concentrated polymer solutions using dynamic light scattering is described. Dynamic light scattering is a ...

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14.3K vues.  University of Tokyo.  Un protocole pour la mesure directe de la distribution des tailles des particules dans des solutions concentrées en utilisant la microscopie de diffusion dynamique de la lumière est présenté. 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

Constant procédé d&#39;extrusion-pression contrôlée pour la préparation de vésicules lipidiques de taille nanométrique

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform ...

Recherche

Bio-ingénierie

Dispersion of Nanomaterials in Aqueous Media: Towards Protocol Optimization

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and stability of the suspension. In this study, a systematic step-wise approach is carried out to identify optimal sonication conditions in order to achieve a stable dispersion. This approach has been adopted and shown to be suitable for several nanomaterials (cerium oxide, zinc oxide, and carbon nanotubes) dispersed in deionized (DI) water. However, with any change in either the nanomaterial type or dispersing medium, there needs to be optimization of the basic protocol by adjusting various factors such as sonication time, power, and sonicator type as well as temperature rise during the process. The approach records the dispersion process in detail. This is necessary to identify the time points as well as other above-mentioned conditions during the sonication process in which there may be undesirable changes, such as damage to the particle surface thus affecting surface properties. Our goal is to offer a harmonized approach that can control the quality of the final, produced dispersion. Such a guideline is instrumental in ensuring dispersion quality repeatability in the nanoscience community, particularly in the field of nanotoxicology.

Here, we present a step-wise protocol for the dispersion of nanomaterials in aqueous media with real-time characterization to identify the optimal sonication conditions, intensity, and duration for improved stability and uniformity of nanoparticle dispersions without impacting the sample integrity.

Dispersion des nanomatériaux dans les milieux aqueux : vers l’optimisation des protocoles

The sonication process is commonly used for de-agglomerating and dispersing nanomaterials in aqueous based media, necessary to improve homogeneity and ...

Environnement

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform Poly(N-isopropylacrylamide) Microgels

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this work, we use single particle tracking of fluorescently labeled PNIPAM microgels as a showcase for tuning microgel size by a rapid non-stirred precipitation polymerization procedure. This approach is well suited for prototyping new reaction compositions and conditions or for applications that do not require large amounts of product. Microgel synthesis, particle size and structure determination by dynamic and static light scattering are detailed in the protocol. It is shown that the addition of functional comonomers can have a large influence on the particle nucleation and structure. Single particle tracking by wide-field fluorescence microscopy allows for an investigation of the diffusion of labeled tracer microgels in a concentrated matrix of non-labeled microgels, a system not easily investigated by other methods such as dynamic light scattering.

Controlled Synthesis and Fluorescence Tracking of Highly Uniform PolyN-isopropylacrylamide Microgels

Non-stirred precipitation polymerization provides a rapid, reproducible prototyping approach to the synthesis of stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) microgels of narrow size distribution. In this protocol synthesis, light scattering characterization and single particle fluorescence tracking of these microgels in a wide-field microscopy setup are demonstrated.

Synthèse contrôlée et le suivi Fluorescence de très uniforme Poly (<em&gt; N</em&gt; -isopropylacrylamide) microgels

Stimuli-sensitive poly(N-isopropylacrylamide) (PNIPAM) microgels have various prospective practical applications and uses in fundamental research. In this ...

Chimie

DNA-magnetic Particle Binding Analysis by Dynamic and Electrophoretic Light Scattering

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the evaluation of DNA-magnetic particles binding via dynamic light scattering (DLS) and electrophoretic light scattering (ELS). Analysis by DLS provides valuable information on the physicochemical properties of particles including particle size, polydispersity, and zeta potential. The latter describes the surface charge of the particle which plays major role in electrostatic binding of materials such as DNA. Here, a comparative analysis exploits three chemical modifications of nanoparticles and microparticles and their effects on DNA binding and elution. Chemical modifications by branched polyethylenimine, tetraethyl orthosilicate and (3-aminopropyl)triethoxysilane are investigated. Since DNA exhibits a negative charge, it is expected that zeta potential of particle surface will decrease upon binding of DNA. Forming of clusters should also affect particle size. In order to investigate the efficiency of these particles in isolation and elution of DNA, the particles are mixed with DNA in low pH (~6), high ionic strength and dehydration environment. Particles are washed on magnet and then DNA is eluted by Tris-HCl buffer (pH = 8). DNA copy number is estimated using quantitative polymerase chain reaction (PCR). Zeta potential, particle size, polydispersity and quantitative PCR data are evaluated and compared. DLS is an insightful and supporting method of analysis that adds a new perspective to the process of screening of particles for DNA isolation.

This protocol describes the synthesis of magnetic particles and evaluation of their DNA-binding properties via dynamic and electrophoretic light scattering. This method focuses on monitoring changes in particle size, their polydispersity and zeta potential of particle surface which play major role in binding of materials such as DNA.

ADN-magnétoscopie liaison analyse par diffusion de la lumière dynamique et électrophorèse

Isolation of DNA using magnetic particles is a field of high importance in biotechnology and molecular biology research. This protocol describes the ...

Application of Voltage in Dynamic Light Scattering Particle Size Analysis

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. Modern instrumentation permits measurement of particle size as a function of time and/or temperature, but currently there is no simple method for performing DLS particle size distribution measurements in the presence of applied voltage. The ability to perform such measurements would be useful in the development of electroactive, stimuli-responsive polymers for applications such as sensing, soft robotics, and energy storage. Here, a technique using applied voltage coupled with DLS and a temperature ramp to observe changes in aggregation and particle size in thermoresponsive polymers with and without electroactive monomers is presented. The changes in aggregation behavior observed in these experiments were only possible through the combined application of voltage and temperature control. To obtain these results, a potentiostat was connected to a modified cuvette in order to apply voltage to a solution. Changes in polymer particle size were monitored using DLS in the presence of constant voltage. Simultaneously, current data were produced, which could be compared with particle size data, to understand the relationship between current and particle behavior. The polymer poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAM) served as a test polymer for this technique, as pNIPAM's response to temperature is well-studied. Changes in the lower-critical solution temperature (LCST) aggregation behavior of pNIPAM and poly(N-isopropylacrylamide)-block-poly(ferrocenylmethyl methacrylate), an electrochemically active block-copolymer, in the presence of applied voltage are observed. Understanding the mechanisms behind such changes will be important when trying to achieve reversible polymer structures in the presence of applied voltage.

Here, a protocol to apply voltage to solution during dynamic light scattering particle size measurements with the intent to explore the effect of voltage and temperature changes on polymer aggregation is presented.

Application de la tension dans l'analyse dynamique de la taille des particules de diffusion de la lumière

Dynamic light scattering (DLS) is a common method for characterizing the size distribution of polymers, proteins, and other nano- and microparticles. ...

Assembly and Characterization of Polyelectrolyte Complex Micelles

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful platform for exploring the physics of polyelectrolyte interactions and also offer a promising solution to the pressing problem of delivering therapeutic oligonucleotides in vivo. Developing predictive structure-property relationships for PCMs has proven difficult, in part due to the presence of strong kinetic traps during nanoparticle self-assembly. This article discusses criteria for choosing polymers for PCM construction and provides protocols based on salt annealing that enable assembly of repeatable, low-polydispersity nanoparticles. We also discuss PCM characterization using light scattering, small-angle X-ray scattering, and electron microscopy.

We provide protocols and representative data for designing, assembling, and characterizing polyelectrolyte complex micelles, core-shell nanoparticles formed by polyelectrolytes and hydrophilic charged-uncharged block copolymers.

Assemblage et caractérisation des Micelles complexes polyélectrolytes

Polyelectrolyte complex micelles (PCMs), core-shell nanoparticles formed by self-assembly of charged polymers in aqueous solution, provide a powerful ...

Routine Screening Method for Microparticles in Platelet Transfusions

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood banks. Cells fragment off microparticles (MP) when they are stressed. Blood and blood components may contain cellular fragments from a variety of cells, most notably from activated platelets. When performing their roles as innate immune cells and major players in coagulation and hemostasis, platelets change shape and generate microparticles. With dynamic light scattering (DLS)-based microparticle detection, it is possible to differentiate activated (high microparticle) from non-activated (low microparticle) platelets in transfusions, and optimize the use of this scarce blood product. Previous research suggests that providing non-activated platelets for prophylactic use in hematology-oncology patients could reduce their risk of becoming refractory and improve patient care. The goal of this screening method is to routinely differentiate activated from non-activated platelets. The method described here outlines the steps to be performed for routine platelet inventory management in a hospital blood bank: obtaining a sample from a platelet transfusion, loading the sample into the capillary for DLS measurement, performing the DLS test to identify microparticles, and using the reported microparticle content to identify activated platelets.

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative in hospital blood banks. The goal is to differentiate activated from non-activated platelets to optimize the use of platelets. Providing non-activated platelets to hematology-oncology patients might reduce their high risk to become refractory.

Routine de procédé de criblage de microparticules dans les Transfusions de plaquettes

Platelet inventory management based on screening microparticle content in platelet concentrates is a new quality improvement initiative for hospital blood ...

Médecine

Quantifying Cytoskeleton Dynamics Using Differential Dynamic Microscopy

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal biopolymers may lead to a host of active and adaptable materials. However, engineering such materials with precisely tuned properties requires measuring how the dynamics depend on the network composition and synthesis methods. Quantifying such dynamics is challenged by variations across the time, space, and formulation space of composite networks. The protocol here describes how the Fourier analysis technique, differential dynamic microscopy (DDM), can quantify the dynamics of biopolymer networks and is particularly well suited for studies of cytoskeleton networks. DDM works on time sequences of images acquired using a range of microscopy modalities, including laser-scanning confocal, widefield fluorescence, and brightfield imaging. From such image sequences, one can extract characteristic decorrelation times of density fluctuations across a span of wave vectors. A user-friendly, open-source Python package to perform DDM analysis is also developed. With this package, one can measure the dynamics of labeled cytoskeleton components or of embedded tracer particles, as demonstrated here with data of intermediate filament (vimentin) networks and active actin-microtubule networks. Users with no prior programming or image processing experience will be able to perform DDM using this software package and associated documentation.

Differential dynamic microscopy (DDM) combines features of dynamic light scattering and microscopy. Here, the process of using DDM to characterize reconstituted cytoskeleton networks by quantifying the subdiffusive and caged dynamics of particles in vimentin networks and the ballistic motion of active myosin-driven actin-microtubule composites is presented.

Quantification de la dynamique du cytosquelette à l’aide de la microscopie dynamique différentielle

Cells can crawl, self-heal, and tune their stiffness due to their remarkably dynamic cytoskeleton. As such, reconstituting networks of cytoskeletal ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

Une méthode innovante pour Exosome Quantification et Taille Mesure

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Biologie

Dynamic Light Scattering Analysis for the Determination of the Particle Size of Iron-Carbohydrate Complexes

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally heterogeneous nanoparticle complexes, which exhibit varying sensitivity to the conditions required for the methodologies available to physicochemically characterize these agents. Currently, the critical quality attributes of iron-carbohydrate complexes have not been fully established. Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a fundamental method to determine intact particle size and distribution. However, challenges still remain regarding the standardization of methodologies across laboratories, specific modifications required for individual iron-carbohydrate products, and how the size distribution can be best described. Importantly, the diluent and serial dilutions used must be standardized. The wide variance in approaches for sample preparation and data reporting limit the use of DLS for the comparison of iron-carbohydrate agents. Herein, we detail a robust and easily reproducible protocol to measure the size and size distribution of the iron-carbohydrate complex, iron sucrose, using the Z-average and polydispersity index.

Dynamic light scattering (DLS) has emerged as a suitable assay for evaluating the particle size and distribution of intravenously administered iron-carbohydrate complexes. However, the protocols lack standardization and need to be modified for each iron-carbohydrate complex analyzed. The present protocol describes the application and special considerations for the analysis of iron sucrose.

Analyse dynamique de diffusion de la lumière pour la détermination de la taille des particules de complexes fer-glucides

Intravenously administered iron-carbohydrate nanoparticle complexes are widely used to treat iron deficiency. This class includes several structurally ...

Mesure de la distribution granulométrique en turbides Solutions par Dynamic Light Scattering Microscopie

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