D&#39;abord et avant tout, nous remercions sincèrement les mères qui ont participé à ce projet. Ensuite, nous reconnaissons tout le personnel qui a aidé et facilité la procédure d&#39;échantillonnage, l&#39;anesthésiste, l&#39;infirmière anesthésiste et les infirmières chirurgicales. Le projet n&#39;aurait pas été possible sans le financement de l&#39;Autorité régionale de la santé du Sud-Est de la Norvège et de l&#39;Unité consultative norvégienne sur la santé des femmes, de l&#39;Université d&#39;Oslo et du financement local fourni par l&#39;Hôpital universitaire d&#39;Oslo.

L&#39;étude a été approuvée par les responsables de la protection des données à l&#39;Hôpital universitaire d&#39;Oslo et le Comité régional pour l&#39;éthique de la recherche médicale et de la santé, Southern Norway 2419/2011. Tous les participants ont signé un consentement éclairé par écrit à l&#39;inclusion. 1. Préparations REMARQUE: une chronologie pour les procédures est décrite dans la figure 1 . <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig1.jpg" /> Figure 1 : diagramme décrivant le calendrier et le personnel impliqué dans la procédure d&#39;échantillonnage à 4 navires. Une seule couleur représente une personne. La description détaillée de la méthode est donnée dans le protocole. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55847/55847fig1large.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a> <ol><li> Personnel <ol><lI&gt; Assurez-vous que tout le personnel requis est disponible: un spécialiste de la médecine du foetus hautement qualifié qui effectue les mesures de l&#39;échographie, deux obstétriciens qui effectuent la chirurgie, l&#39;un des obstétriciens et deux infirmières qui collectent les échantillons, un assistant qui manipule les analyses de gaz sanguins et un assistant qui manipule le D&#39;autres échantillons consécutivement et immédiatement après la collecte. NOTE: Dans le cas d&#39;une collecte plus avancée du tissu placentaire, une personne supplémentaire est requise. </li></ol></li><li> Équipement <ol><li> Préparez l&#39;équipement, 50 ml de solution salée tamponnée au phosphate 1 M (PBS), 25 ml de solution stabilisatrice d&#39;ARN froide et 5 x 0,5 ml de composé de température de coupe optimal (OCT). Étiquetez les aspirateurs et les tubes. Voir la liste provisoire de l&#39;équipement. </li></ol></li></ol> 2. Caractéristiques de la mère <ol><li> Notez les caractéristiques cliniques et non cliniques maternelles à l&#39;inclusion et répétez les questions pertinentes et moiLes précautions, y compris le poids, au moment de la livraison. Notez la durée de la période de jeûne avant la césarienne et tous les épisodes hypotensifs se produisant pendant la chirurgie. Note: Inclure l&#39;ensemble minimal de données cliniques maternelles signalé dans une publication récente de CoLaboratory Global de Grossesse (COLAB). Cet article comprend également des aspects très importants dans le choix des populations étudiées et devrait être abordé lors de la planification de l&#39;étude 18 . </li><li> Envisager d&#39;enregistrer les caractéristiques paternelles, y compris l&#39;appartenance ethnique, l&#39;âge et l&#39;indice de masse corporelle (IMC). </li></ol> 3. Echographie <ol><li> Effectuez l&#39;échographie Doppler le jour de la livraison, avec les femmes en état de jeûne. Effectuer l&#39;examen pendant une période de quiescence foetale, avec la femme en position semi-supine, incliné légèrement latéralement en face de la région d&#39;intérêt afin d&#39;éviter la compression de l&#39;aorte et de la veine cave. Surveiller la sortie dansLa tension par les indices mécaniques et thermiques sur l&#39;affichage. </li><li> Veine ombilicale <ol><li> Visualiser la veine ombilicale dans une transitoire sagittale ou oblique de l&#39;abdomen fœtal. Mesurer le diamètre interne du vaisseau dans la partie droite de la veine ombilicale intra-abdominale, avant toute branche visible. Utilisez le mode B régulier et visualisez le vaisseau dans un angle d&#39;insonction perpendiculaire pour les mesures du diamètre et gardez plusieurs cadres optimaux pour des mesures ultérieures pour minimiser l&#39;effet des changements de diamètre pulsatile. <ol><li> Répétez les mesures de cinq à dix fois 19 . </li></ol></li><li> Sur le même site, utilisez l&#39;échographie Doppler et ajustez la sonde pour obtenir un angle d&#39;insonance le plus bas possible (toujours &lt;30 °) afin de mesurer la vitesse maximale moyenne en temps (TAMX). Obtenir la vitesse sur une période de 3 à 5 s (débit non pulsé). </li></ol></li><li> Artère utérine <ol><li> Utiliser DopplerÉchographie pour visualiser l&#39;artère utérine alors qu&#39;elle traverse l&#39;artère iliaque externe, immédiatement après qu&#39;elle se ramifie de l&#39;artère iliaque interne. Réglez la sonde sur ce site pour obtenir un faible angle d&#39;insonance (toujours &lt;30 °) et mesurez TAMX. Obtenez la vitesse comme vitesse moyenne de trois cycles cardiaques. </li><li> Étant donné qu&#39;il est peu probable d&#39;avoir un angle perpendiculaire au même endroit que le TAMX, il faut suivre le vaisseau distalement pour obtenir un angle correct pour des mesures de diamètre aussi proches des sites de mesures de diamètre que possible. Exclure les mesures du diamètre si des vaisseaux visibles s&#39;écoulent avant ce site comme évalué par échographie Doppler couleur. <ol><li> Utilisez le mode B régulier et visualisez le vaisseau dans un angle d&#39;insonction perpendiculaire pour les mesures du diamètre et gardez plusieurs cadres optimaux pour des mesures ultérieures pour minimiser l&#39;effet des changements de diamètre pulsatile. </li><li> Répétez les mesures de cinq à dix fois 19 . </li></ol></<html> Li&gt; </ol></li><li> Notez la position du placenta. </li></ol> 4. Échantillonnage de sang à 4 vaisseaux REMARQUE: la chronologie des procédures est décrite à la figure 1 et une vue d&#39;ensemble des échantillons est illustrée à la figure 2 . <img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55847/55847fig2.jpg" /> Figure 2 : Illustration schématique de la vasculature placentielle et des sites d&#39;échantillonnage. Dans la méthode d&#39;échantillonnage à 4 vaisseaux, des échantillons de sang sont tirés de la veine utérine, de l&#39;artère radiale (en tant que vecteur de l&#39;artère utérine) et des artères et des veines ombilicales. Le flux sanguin dans l&#39;artère utérine et la veine ombilicale est mesuré par ultrasons. Des échantillons de tissus provenant du placenta sont collectés. Illustration: Øystein H. Horgmo, Université d&#39;Oslo.5847fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre. <ol><li> Les procédures de sécurité <ol><li> Fournir tout le personnel dans l&#39;opération théâtre avec des gants, des combinaisons chirurgicales, des masques et des couvre-chefs. </li><li> Fournir aux chirurgiens et au personnel de recherche en contact avec le champ d&#39;opération avec des combinaisons chirurgicales, des masques, des couvre-chefs, des robes et des gants doubles. Les lunettes sont facultatives. </li><li> Fournir au personnel qui manipule les échantillons de sang avec des gants. </li><li> Fournir au personnel qui manipule les échantillons de placenta avec des gants et un masque chirurgical. L&#39;homogénéisation nécessite l&#39;utilisation de hottes. </li></ol></li><li> Préparation à l&#39;opération Théâtre <ol><li> Donner un briefing et remettre l&#39;équipement à tout le personnel qui aidera l&#39;échantillonnage avant le début de la chirurgie. </li><li> S&#39;adresser à l&#39;infirmière anesthésiologiste et anesthésiste qui aidera à l&#39;accès artérielle et veineuse périphérique nécessaire et veillera à ce queAucun liquide n&#39;est administré par voie intraveineuse avant l&#39;échantillonnage. </li><li> Donner trois seringues (10 mL) sans aiguilles à la personne aidant avec l&#39;échantillon de veine antecubitale et deux seringues (une 20 mL et une 10 mL) et une seringue à sang (avec l&#39;héparine) à l&#39;aide de l&#39;artère radiale. </li><li> Préparez deux seringues stériles (20 mL), cinq seringues stériles (10 mL), trois &quot;aiguilles papillons&quot; et deux seringues à gaz pour le champ d&#39;opération. </li></ol></li><li> Accès aux vaisseaux sanguins. <ol><li> Suivez la procédure standard avant la césarienne pour assurer l&#39;accès intraveineux périphérique (iv). NOTE: La veine antecubitale est préférable car il est plus facile de prélever des échantillons sur ce site. </li><li> Localiser l&#39;artère radiale au poignet par ultrasons ou par palpation. Après 0,5 ml d&#39;analgésie sous la lidocaïne sous-cutanée, placez une ligne artérielle dans l&#39;artère radiale. Abandonnez l&#39;échantillonnage de ce site en cas de trois insertions échouées, ouSi la femme éprouve de la douleur lors de l&#39;insertion. REMARQUE: effectuer la procédure chirurgicale de la césarienne selon la procédure standard. Seuls les ajustements nécessaires à la procédure d&#39;échantillonnage sont soulignés ci-dessous. </li></ol></li><li> Échantillons de sang maternel NOTE: Obtenez les trois échantillons de sang maternel (veine utérine, artère radiale et veine antecubitale) simultanément avant l&#39;incision utérine. <ol><li> Pour la veine utérine, après avoir ouvert la cavité abdominale, utilisez un rétracteur pour soulever la paroi abdominale et exposez les branches principales des veines utérines sur les côtés antérolégéraux de l&#39;utérus. Obtenir du sang dans les branches de la veine utérine du même côté que le placenta chaque fois que possible ou utiliser le plexus veineux le plus important si le placenta est situé dans la ligne médiane utérine. <ol><li> Insérez une aiguille de papillon sur une seringue de sang dans la veine utérine à un angle d&#39;environ 30 degrés et collectez le sang par aspiration douce pour éviterL&#39;hémolyse. Tout en garantissant soigneusement la position iv de l&#39;aiguille papillon, remplacez la seringue à gaz remplie par une seringue de 20 mL et 10 mL consécutivement. REMARQUE: L&#39;accès optimal est mieux assuré lorsqu&#39;il est debout sur le côté contralateral de la veine utérine choisie. </li></ol></li><li> Pour l&#39;artère radiale, aspirer à partir de la ligne intra-artérielle. Jeter les premiers 5 mL, puis aspirer 3 mL dans la seringue d&#39;héparine pour les analyses de gaz sanguins, puis 3 mL dans deux seringues (20 + 10 mL). </li><li> Pour la veine antecubitale, aspirer doucement du cathéter intraveineux. Jeter les premiers 5 mL, puis aspirer 30 mL dans trois seringues (10 mL). </li><li> Effectuer une inspection finale du site d&#39;échantillonnage sur la veine utérine avant de commencer à fermer l&#39;abdomen. </li></ol></li><li> Échantillons de sang fœtal <ol><li> Lorsque l&#39;enfant est né, aspirer immédiatement le sang de l&#39;artère ombilicale, sans serrer le cordon ombilical ou administrer le placenta. Commencez l&#39;espritH la seringue pour l&#39;analyse des gaz sanguins et suivre avec trois seringues de 10 mL si possible. </li><li> Lorsque les échantillons artériels sont sécurisés, serrer le cordon et remettre l&#39;enfant à la sage-femme avant l&#39;échantillonnage de la veine ombilicale (gaz de sang et 20 + 10 mL de seringues). REMARQUE: Obtenez tous les échantillons ombilicaux en quelques secondes de l&#39;accouchement et avec le placenta in situ à moins qu&#39;il ne soit détaché spontanément. </li><li> Suivez les recommandations norvégiennes sur le serrage du cordon tardif. Dans le cas d&#39;un enfant en difficulté, serrez et coupez le cordon immédiatement et laissez l&#39;enfant à la sage-femme et au néonatologue. </li></ol></li><li> Manipulation des échantillons de sang <ol><li> Mettez les seringues de gaz sanguins sur de la glace tout en préparant le reste des échantillons de sang et analysez-les dans un analyseur de gaz sanguin dans les 5 minutes. </li><li> Transférer immédiatement les échantillons de sang aux vacutainers et placer les tubes de plasma sur un rocker pendant 1 à 2 minutes avant de les mettre sur de la glace. Laissez les tubes de sérum sur le travailUn banc de règlement pour s&#39;établir pendant 30 minutes. REMARQUE: Il s&#39;agit d&#39;une étape critique dans la procédure qui nécessite une attention particulière car les échantillons des cinq sites doivent être préparés simultanément pour assurer une bonne qualité. </li><li> Centrifuger les échantillons de plasma dès que possible et dans les 30 minutes, à 6 ° C, 2 500 xg pendant 20 min. </li><li> Après 30 min, centrifuger les échantillons de sérum à température ambiante pendant 10 min à 2 500 x g. </li><li> Aliquotez les surnageants avec soin dans 2 mL de tubes cryo, en laissant 0,5 mL du surnageant au-dessus de la pastille pour assurer un plasma exempt de plaquettes. </li><li> Conservez les échantillons à -80 ° C. </li></ol></li></ol> 5. Collecte de tissu plaquettaire <ol><li> Placez le placenta à plat vers le bas sur un plateau de dissipation refroidi par glace dès que possible après avoir été livré. Photographiez et mesurez le plus long diamètre et le diamètre à 90 degrés. </li><li> Peser le placenta. </li><li> Notez le poids, les deux diamètres, tout gLa pathologie de Ross, le nombre de vaisseaux dans le cordon et l&#39;intervalle de temps entre la livraison et le moment où le placenta a été placé sur de la glace. REMARQUE: Envoyer le placenta à l&#39;examen pathologique s&#39;il est indiqué cliniquement. </li><li> Placez le placenta avec la surface maternelle vers le haut et identifiez 4 à 5 sites d&#39;échantillonnage situés au hasard dans chaque quadrant du placenta, en évitant les zones de pathologie franche. Retirez la décidua à l&#39;aide de ciseaux pour couper 3 à 5 mm de la surface maternelle. Recueillir un morceau de tissu vilain de 1 à 2 cm 3 de chaque site. </li><li> Lavez doucement le tissu récolté dans 50 ml de PBS froid 1 M. Diviser en plusieurs pièces de chaque site d&#39;échantillonnage et une aliquote. Remarque: La taille des pièces du placenta dépend des analyses planifiées. </li><li> Ajouter des aliquotes de 0,1 à 0,5 cm 3 échantillons de tissus à 5 tubes cryo et congélation instantanée dans de l&#39;azote liquide. </li><li> Ajouter de petits morceaux de 0,1 à 0,2 cm 3 au tube avec 25 ml de solution de stabilisation d&#39;ARN. Magasin à 46; C pendant 24 h, jeter la solution de stabilisation d&#39;ARN et la remplacer. Gel. </li><li> Ajouter des morceaux de 0,5 cm 3 aux 5 tubes cryo avec 0,5 ml d&#39;OCT, compléter avec OCT, mélanger et congeler. </li><li> Conservez les échantillons à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;analyse. NOTE: Burton et al. Fournit un excellent aperçu des aspects pratiques de l&#39;échantillonnage du placenta en fonction des analyses prévues. 20 Considérez préparer le tissu restant pour l&#39;isolement des membranes microvillées et basales, et pour collecter le tissu décalé par technique d&#39;aspiration sous vide. 21 , 22 </li></ol> 6. Caractéristiques néonatales <ol><li> Enregistrez les caractéristiques néonatales, y compris le score Apgar (1, 5 et 10 min), le sexe, le poids, la longueur, l&#39;âge gestationnel et l&#39;admission à l&#39;Unité de soins intensifs du nouveau-né (durée et résultat du séjour). </li><li> Envisager de mesurer la composition du corps néonatal par des mesures anthropométriques, déplacer l&#39;airPléthysmographe ou double absorptiométrie des rayons X. 23 , 24 </li></ol> 7. Calculs <ol><li> Supposons une composition sanguine similaire dans l&#39;artère radiale et utérine et calculez la différence de concentration artérioveineuse uteroplacentale. Différence de concentration artérioveineuse uteroplacentaire = C A - C V Différence de concentration artérielle veineuse - artérielle = C v - C a Lorsque C est la concentration avec les indices: A, l&#39;artère radiale; V, la veine utérine; V la veine ombilicale et a, l&#39;artère ombilicale. </li><li> Calculer le débit sanguin du volume, mL / min (Q): <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/55847/55847eq1.jpg" /> Lorsque D est le diamètre du navire (cm), TAMX est la vitesse maximale moyenne en temps et h est le coefficient pour le profil spatial de la vitesse du sang. Utilisez 0,5 comme coefficient pour la veine ombilicale et0,6 pour l&#39;artère utérine 25 , 26 . </li><li> Calculez l&#39;absorption et la libération du placenta selon le principe de Fick: Capture uteroplacentale = ( C A - C V ) x Qm Absorption fœtale = ( C v - C a ) X Q f Sous-rubriques: m, maternelle et f, foetale. </li></ol>

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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Body-composition+assessment+in+infancy:+air-displacement+plethysmography+compared+with+a+reference+4-compartment+model.">Body-composition assessment in infancy: air-displacement plethysmography compared with a reference 4-compartment model.</a> Am J Clin Nutr. 85 (1), 90-95 (2007).</li><li>Haugen, G., Kiserud, T., Godfrey, K., Crozier, S., Hanson, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Portal+and+umbilical+venous+blood+supply+to+the+liver+in+the+human+fetus+near+term.">Portal and umbilical venous blood supply to the liver in the human fetus near term.</a> Ultrasound Obstet Gynecol. 24 (6), 599-605 (2004).</li><li>Acharya, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+uterine+artery+volume+blood+flow+measurement+by+Doppler+ultrasonography+in+pregnant+sheep.">Experimental validation of uterine artery volume blood flow measurement by Doppler ultrasonography in pregnant sheep.</a> Ultrasound Obstet Gynecol. 29 (4), 401-406 (2007).</li><li>Wu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-glutamine+cycle+and+exchange+in+the+placenta-fetus+unit+during+late+pregnancy.">Glutamate-glutamine cycle and exchange in the placenta-fetus unit during late pregnancy.</a> Amino Acids. 47 (1), 45-53 (2015).</li><li>Tuckey, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+synthesis+by+the+human+placenta.">Progesterone synthesis by the human placenta.</a> Placenta. 26 (4), 273-281 (2005).</li><li>Simmons, M. A., Meschia, G., Makowski, E. L., Battaglia, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+metabolic+response+to+maternal+starvation.">Fetal metabolic response to maternal starvation.</a> Pediatr Res. 8 (10), 830-836 (1974).</li><li>Simmons, M. A., Jones, M. D., Battaglia, F. C., Meschia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+effect+on+fetal+glucose+utilization.">Insulin effect on fetal glucose utilization.</a> Pediatr Res. 12 (2), 90-92 (1978).</li><li>Bujold, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+supporting+that+the+excess+of+the+sVEGFR-1+concentration+in+maternal+plasma+in+preeclampsia+has+a+uterine+origin.">Evidence supporting that the excess of the sVEGFR-1 concentration in maternal plasma in preeclampsia has a uterine origin.</a> J Matern Fetal Neonatal Med. 18 (1), 9-16 (2005).</li><li>Jansson, T., Aye, I. L., Goberdhan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+emerging+role+of+mTORC1+signaling+in+placental+nutrient-sensing.">The emerging role of mTORC1 signaling in placental nutrient-sensing.</a> Placenta. 33, 23-29 (2012).</li><li>Cetin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+transport+of+amino+acids+in+normal+and+growth-restricted+pregnancies.">Placental transport of amino acids in normal and growth-restricted pregnancies.</a> Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 110, 50-54 (2003).</li></ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

<html> La méthode d&#39;échantillonnage du placenta à 4 navires est pertinente pour trois objectifs principaux. Tout d&#39;abord, il peut être utilisé pour étudier comment des substances spécifiques sont absorbées par le placenta du côté maternel et éventuellement transférées à la circulation ombilicale et au foetus, comme en témoignent nos études sur le glucose et les acides aminés. Deuxièmement, la méthode est très pertinente pour étudier les substances produites par le placenta et libérées dans ...

Selon le National Institutes of Health, aux États-Unis, le placenta est l&#39;organe le moins compris dans le corps humain 1 , 2 , 3 . Il est difficile d&#39;accéder et d&#39;étudier le placenta humain in vivo sans imposer de contraintes éthiques sur la grossesse en cours. Les études de la fonction placentaire chez l&#39;humain reposent en grande partie sur des modèles in vitro et ex vivo . La majorité des études antérieures in vivo sur le transport du placenta et le métabolisme ont été réalisées chez les animaux 4 , 5 , 6 . Cependant, comme la structure et les fonctions du placenta varient considérablement d&#39;une espèce à l&#39;autre, l&#39;extrapolation des résultats des animaux aux humains doit être effectuée avec prudence. Seules quelques études humaines in vivo plus petites ont étudié l&#39;absorption et le transport du placenta et du fœtus dans des conditions physiologiques normalesToutes les conditions, et aucun n&#39;a exploré le transfert intégré de plusieurs composés 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Ces études fondamentales illustrent que les études in vivo du placenta humain sont réalisables et qu&#39;elles peuvent servir à plusieurs fins. Tout d&#39;abord, les concepts actuels de fonctions placentaires principalement dérivés d&#39;études in vitro , ex vivo et animales peuvent être testés dans un milieu humain et fournir ainsi une vision nouvelle et plus spécifique du placenta humain. Deuxièmement, les propriétés du placenta dysfonctionnel associé à la croissance aberrante du foetus, la prééclampsie, le diabète maternel, le syndrome métabolique et d&#39;autres troubles métaboliques maternels peuvent être mieux caractérisés. Troisièmement, les études humaines in vivo offrent l&#39;occasion de développer le diagnosticTic et les outils prédictifs de la fonction placentaire. Dans ce contexte, nous avons cherché à établir une collection complète de données physiologiques pour étudier la fonction placentaire humaine in vivo. Au cours d&#39;une césarienne planifiée, nous exploitons l&#39;accès intra-abdominal à la veine utérine pour recueillir des échantillons de sang provenant des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta (la méthode d&#39;échantillonnage à 4 vaisseaux). Ces échantillons sont utilisés pour calculer les différences de concentration artérioveineuses appariées des nutriments et d&#39;autres substances 14 . En outre, nous mesurons le débit sanguin du volume des deux côtés du placenta par ultrasons. Par conséquent, l&#39;absorption placentaire et foetale de tout composé peut être quantifiée. En outre, il est possible de déterminer les substances libérées par le placenta aux circulations maternelle et fœtale 15 , 16 , 17 . Lorsqu&#39;on combineD avec des paramètres cliniques de la mère et de l&#39;enfant, et des analyses des tissus placentaires et d&#39;autres tissus pertinents, cette méthode a le potentiel excitant d&#39;intégrer de nombreux aspects des fonctions placentaires in vivo dans les mêmes paires mère-fœtus.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Maternal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Impedance scale</td><td>Tanita</td><td></td><td>or similar</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Ultrasound measurements&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sequoia 512 ultrasound machine</td><td>Acuson</td><td></td><td>equipped with a curved transducer with colour and pulsewave Doppler (frequency bandwidth 2 - 6 MHz)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Blood samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Arerial cannula</td><td>BD Medical</td><td>682245</td><td>or similar</td></tr><tr><td>20 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-20ES</td><td>or similar. 3 needed.</td></tr><tr><td>10 cc Eccentric Luer Tip Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-10ES</td><td>or similar. 9 needed.</td></tr><tr><td>5 cc 6% Luer Syringe without Needle</td><td>Termo</td><td>SS-05S1</td><td>or similar. 2 needed.</td></tr><tr><td>Arterial blood gas syringe&amp;nbsp;</td><td>Radiometer Medical</td><td></td><td>or similar. 4 needed.</td></tr><tr><td>Sterile winged needle connected to flexible tubing, 21 gauge</td><td>Greiner Bio-One</td><td>450081</td><td>(intended for single use).3 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL EDTA&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456043</td><td>or similar. Label with sample site. 10 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 5 mL LH Lithium Heparin Separator</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456305</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 6 mL Serum Clot Activator&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>456089</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Vacutainer tube 3 mL&amp;nbsp; 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>454334</td><td>or similar. Label with sample site. 5 needed.</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site, serum/type of plasma and ID. 90 needed.</td></tr><tr><td>Marked trays to transport the syringes</td><td></td><td></td><td>to transport the blood samples in the operation theatre</td></tr><tr><td>Rocker</td><td></td><td></td><td>for gentle mixing of the samples</td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Placenta samples&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal tray</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ice</td><td></td><td></td><td>in styrofoam box</td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Metal ruler</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 M Phosphate buffered saline</td><td>Sigma</td><td>D1408</td><td>or similar. Dilute 10 M to&amp;nbsp; 1 M before use</td></tr><tr><td>RNA stabilization solution</td><td>Sigma</td><td>R0901-500ML&amp;nbsp;</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Optimal Cutting Temperature (O.C.T.) compound</td><td>vwr</td><td>361603E</td><td>or similar</td></tr><tr><td>Cryogenic vials, 2.0 mL</td><td>Corning</td><td>430488</td><td>or similar. Label with sample site. content and ID. 10 needed.</td></tr><tr><td>Centrifuge tubes, conical bottom 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227,285</td><td>or similar. Label with &quot;RNA later&quot;, sample site and ID. 2 needed.</td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td>in appropriate container</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Fetal body composition&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calibrated scale</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Measuring tape</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

the 4-vessel sampling approach to integrative studies of human placental physiology in vivo

Le placenta humain est très inaccessible à la recherche alors qu&#39;il est encore in utero . La compréhension actuelle de la physiologie du placenta humain in vivo repose en grande partie sur des études sur les animaux, malgré la grande diversité des espèces en anatomie placentaire, l&#39;hémodynamique et la durée de la grossesse. La grande majorité des études sur le placenta humain sont des études de perfusion ex vivo ou des études de trophoblastes in vitro . Bien que les études in vitro et les modèles animaux soient essentiels, l&#39;extrapolation des résultats de ces études au placenta humain in vivo est incertaine. Nous avons visé à étudier la physiologie du placenta humain in vivo à terme et à présenter un protocole détaillé de la méthode. En exploitant l&#39;accès intra-abdominal à la veine utérine juste avant l&#39;incision utérine pendant la césarienne prévue, nous recueillons des échantillons de sang des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta. En combinant conDes mesures de centration à partir d&#39;échantillons de sang avec des mesures du débit sanguin, nous sommes en mesure de quantifier l&#39;absorption du placenta et du fœtus et la libération de tout composé. En outre, les échantillons de tissus placentaires provenant des mêmes paires mère-foetus peuvent fournir des mesures de la densité et de l&#39;activité des transporteurs et d&#39;autres aspects des fonctions placentaires in vivo . Grâce à cette utilisation intégrative de la méthode d&#39;échantillonnage à 4 navires, nous sommes en mesure de tester certains des concepts actuels de transfert de nutriments placentaires et de métabolisme in vivo , à la fois chez les grossesses normales et pathologiques. En outre, cette méthode permet d&#39;identifier les substances sécrétées par le placenta à la circulation maternelle, ce qui pourrait être une contribution importante à la recherche de biomarqueurs de dysfonctionnement du placenta.

La méthode d&#39;échantillonnage à 4 navires s&#39;applique à la pratique clinique et nous avons réussi à obtenir des prélèvements sanguins provenant de 209 couples mère / nourrissons. Dans 128 d&#39;entre eux, nous avons également réalisé pour mesurer le débit sanguin du volume. L&#39;échantillonnage complet de 4 navires et les mesures de débit de qualité des vaisseaux maternels et fœtaux ont été obtenus dans 70 paires mère-foetus ( figure 3</str...

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The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

Nous présentons une méthode détaillée pour étudier la physiologie du placenta humain in vivo à terme. La méthode combine l&#39;échantillonnage du sang des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta avec des mesures ultrasonores du flux sanguin volumique et de l&#39;échantillonnage du tissu placentaire.

L&#39;approche d&#39;échantillonnage à 4 navires pour les études intégratives de la physiologie du plaidoyer humain<em&gt; In vivo</em

The human placenta is highly inaccessible for research while still in utero. The current understanding of human placental physiology in vivo is therefore ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

The 4-vessel Sampling Approach to Integrative Studies of Human Placental Physiology In Vivo

10.5K vues.  Oslo University Hospital.  Nous présentons une méthode détaillée pour étudier la physiologie du placenta humain in vivo à terme. La méthode combine l'échantillonnage du sang des vaisseaux entrants et sortants sur les côtés maternel et fœtal du placenta avec des mesures ultrasonores du flux sanguin volumique et de l'échantillonnage du tissu placentaire. 

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Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC twin pregnancies develop complications arising from the shared placenta and associated vascular connections1. Severe twin-to-twin syndrome (TTTS) is reported to account for approximately 20% of these complications2,3. Inter-twin vascular connections occur in almost all MC placentas and are related to the prognosis and outcome of these high-risk twin pregnancies. The number, size and type of connections have been implicated in the development of TTTS and other MC twin conditions. Three types of inter-twin vascular connections occur: 1) artery to vein connections (AVs) in which a branch artery carrying deoxygenated blood from one twin courses along the fetal surface of the placenta and dives into a placental cotyledon. Blood flows via a deep intraparenchymal capillary network into a draining vein that emerges at the fetal surface of the placenta and brings oxygenated blood toward the other twin. There is unidirectional flow from the twin supplying the afferent artery toward the twin receiving the efferent vein; 2) artery to artery connections (AAs) in which a branch artery from each twin meets directly on the superficial placental surface resulting in a vessel with pulsatile bidirectional flow, and 3) vein to vein connections (VVs) in which a branch vein from each twin meets directly on the superficial placental surface allowing low pressure bidirectional flow. In utero obstetric sonography with targeted Doppler interrogation has been used to identify the presence of AV and AA connections4. Prenatally detected AAs that have been confirmed by postnatal placental injection studies have been shown to be associated with an improved prognosis for both twins5. Furthermore, fetoscopic laser ablation of inter-twin vascular connections on the fetal surface of the shared placenta is now the preferred treatment for early, severe TTTS. 
Postnatal placental injection studies provide a valuable method to confirm the accuracy of prenatal Doppler ultrasound findings and the efficacy of fetal laser therapy6. Using colored dyes separately hand-injected into the arterial and venous circulations of each twin, the technique highlights and delineates AVs, AAs, and VVs. This definitive demonstration of MC placental vascular anatomy may then be correlated with Doppler ultrasound findings and neonatal outcome to enhance our understanding of the pathophysiology of MC twinning and its sequelae. Here we demonstrate our placental injection technique.

Vascular mapping of monochorionic (MC) twin placentas after birth provides a means for detailed demonstration of vascular connections between the twins&#x2019; circulations. 
Imbalance of these connections is thought to play a pivotal role in the development of complications of MC twinning including twin-to-twin transfusion syndrome.

Cathétérisme Guide fil assistée et coloré pour la cartographie d&#39;injection de colorant vasculaires de monochoriales placentas jumelles

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

Recherche

Médecine

Isolation and Analysis of Hematopoietic Stem Cells from the Placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. All HSCs emerge during embryonic development, after which their pool size is maintained by self-renewing cell divisions. Identifying the anatomical origin of HSCs and the critical developmental events regulating the process of HSC development has been complicated as many anatomical sites participate during fetal hematopoiesis. Recently, we identified the placenta as a major hematopoietic organ where HSCs are generated and expanded in unique microenvironmental niches (Gekas, et al 2005, Rhodes, et al 2008). Consequently, the placenta is an important source of HSCs during their emergence and initial expansion.
In this article, we show dissection techniques for the isolation of murine placenta from E10.5 and E12.5 embryos, corresponding to the developmental stages of initiation of HSCs and the peak in the size of the HSC pool in the placenta, respectively. In addition, we present an optimized protocol for enzymatic and mechanical dissociation of placental tissue into single-cell suspension for use in flow cytometry or functional assays. We have found that use of collagenase for single-cell suspension of placenta gives sufficient yields of HSCs. An important factor affecting HSC yield from the placenta is the degree of mechanical dissociation prior to, and duration of, enzymatic treatment.
We also provide a protocol for the preparation of fixed-frozen placental tissue sections for the visualization of developing HSCs by immunohistochemistry in their precise cellular niches. As hematopoietic specific antigens are not preserved during preparation of paraffin embedded sections, we routinely use fixed frozen sections for localizing placental HSCs and progenitors.

We have identified the placenta as a major hematopoietic organ during development. We found that hematopoietic stem cells (HSCs) are both generated and expanded in the placenta in unique microenvironmental niches. Here, we describe experimental techniques required for isolation and visualization of HSCs in the mouse placenta.

Isolement et analyse de cellules souches hématopoïétiques à partir du placenta

Hematopoietic stem cells (HSCs) have the ability to self-renew and generate all cell types of the blood lineages throughout the lifetime of an individual. ...

Biologie

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced birth defects and many later studies afterwards proved the opposite. Today several harmful xenobiotics like nicotine, heroin, methadone or drugs as well as environmental pollutants were described to overcome this barrier. With the growing use of nanotechnology, the placenta is likely to come into contact with novel nanoparticles either accidentally through exposure or intentionally in the case of potential nanomedical applications. Data from animal experiments cannot be extrapolated to humans because the placenta is the most species-specific mammalian organ 1. Therefore, the ex vivo dual recirculating human placental perfusion, developed by Panigel et al. in 1967 2 and continuously modified by Schneider et al. in 1972 3, can serve as an excellent model to study the transfer of xenobiotics or particles.
Here, we focus on the ex vivo dual recirculating human placental perfusion protocol and its further development to acquire reproducible results.
The placentae were obtained after informed consent of the mothers from uncomplicated term pregnancies undergoing caesarean delivery. The fetal and maternal vessels of an intact cotyledon were cannulated and perfused at least for five hours. As a model particle fluorescently labelled polystyrene particles with sizes of 80 and 500 nm in diameter were added to the maternal circuit. The 80 nm particles were able to cross the placental barrier and provide a perfect example for a substance which is transferred across the placenta to the fetus while the 500 nm particles were retained in the placental tissue or maternal circuit. The ex vivo human placental perfusion model is one of few models providing reliable information about the transport behavior of xenobiotics at an important tissue barrier which delivers predictive and clinical relevant data.

Determination of the Transport Rate of Xenobiotics and Nanomaterials Across the Placenta using the ex vivo Human Placental Perfusion Model

The ex vivo dual recirculating human placental perfusion model can be used to investigate the transfer of xenobiotics and nanoparticles across the human placenta. In this video protocol we describe the equipment and techniques required for a successful execution of a placenta perfusion.

Détermination de la vitesse de transport des xénobiotiques et des nanomatériaux à travers le placenta en utilisant l&#39;<em&gt; Ex vivo</em&gt; Human perfusion placentaire modèle

Decades ago the human placenta was thought to be an impenetrable barrier between mother and unborn child. However, the discovery of thalidomide-induced ...

Bio-ingénierie

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

Isolation des gouttelettes lipidiques cellulaires: deux techniques de purification partir de cellules de levure et placentas humains

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

Rendu tridimensionnel et l’analyse d’immunomarquées, a précisé réseaux vasculaires villosités placentaires humains

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Biologie du développement

Ex Vivo Perfusion of the Rodent Placenta

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An assay is described here to perfuse an isolated rat placenta and evaluate the maternal-to-fetal translocation of xenobiotics ex vivo. In addition, the evaluation of physiological processes such as fluid flow to the fetus and placental metabolism may be conducted with this methodology. This technique is suitable for evaluating maternal-to-fetal kinetics of pharmaceutical candidates or environmental contaminants. In contrast to current alternative approaches, this methodology allows the evaluation of the isolated maternal-fetal vasculature, with the systemic neural or immune involvement removed, allowing any observed changes in physiological function to be attributable to local factors within the isolated tissue.

Here is presented a protocol of ex vivo maternal-fetal vascular perfusion to enable the administration of a test article into maternal vasculature and to evaluate placental transfer of xenobiotic particles or pharmacological agents in addition to alterations in placental physiology.

Perfusion ex vivo du placenta de rongeurs

The placenta is a key organ during pregnancy that serves as a barrier to fetal xenobiotic exposure and mediates the exchange of nutrients for waste. An ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Cultures placentaire et déciduale organe humain pour l&#39;étude des infections à l&#39;interface materno-fœtale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Immunologie et infection

Améliorer la culture d’explants placentaires ex vivo à l’aide d’une approche basée sur le flux

Ex Vivo Placental Explant Flow Culture - Mimicking the Dynamic Conditions In Utero

The existing ex vivo placental explant culture models are primarily grounded in static culture systems using well plates. However, these models inadequately reflect the dynamic in utero setting, where the placenta encounters constant slight shear stress due to plasma or blood flow. To address this limitation, a flow culture system has been devised to bring ex vivo placental explant cultivation closer to the in utero flow conditions experienced within the maternal body. Within this approach, placental explants are cultivated in a sequence of five interconnected flow chambers. This setting&#160;maintains physiological oxygen concentrations and a consistent flow rate. The collected data reveals that under flow conditions, the preservation of tissue morphology exhibits notable enhancement compared to conventional static methods. This innovative technique introduces a straightforward means of ex vivo placental explant culture, offering a more faithful representation of the dynamic in vivo environment. Moreover, this study introduces new&#160;possibilities for investigating the functional dynamics of the feto-maternal interface. By embracing feasible dynamic methodologies, a deeper comprehension of placental biology is facilitated, underscoring its relevance for maternal-fetal health.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser la recherche grâce au séquençage unicellulaire et à l’histologie spatiale des tissus placentaires 

Here is a protocol for culturing placental explants under constant flow conditions. This approach enhances traditional static villous culture systems by enabling the replication of dynamic physiological environments.

L'approche d'échantillonnage à 4 navires pour les études intégratives de la physiologie du plaidoyer humain

Résumé

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