Name: enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine
Uploaded: 2018-02-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
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Les auteurs remercient Véronique de Berardinis pour discussion fructueuse et Alain Perret, Christine Pellé et Peggy Sirvain pour le support technique.

1. préparation enzymatique
<ol><li>Express et purifier les protéines comme décrit précédemment26. Remarque : Les protéines recombinantes ont été obtenus avec les concentrations finales suivantes : αKAO Catenulispora acidiphila, UniProtKB ID : C7QJ42 (KDO1), 1,35 mg/mL ; ΑKAO de c. pinensis, UniProtKB ID : C7PLM6 (KDO2), 2,29 mg/mL ; PLP-DCs de S. rumirantium, UniProtKB ID : O50657 (LDCSrum), cellule libre extrait avec de l’enzyme totale à 12,44 mg/mL ; PLP-ms du c. pinensis, UniProtKB ID : C7PLM7 (DCCpin), 2,62 mg/mL.</li>
</ol>2. préparation des Solutions
Remarque : Toutes les solutions ci-dessous sont préparées dans l’eau désionisée.
<ol><li>Préparer 1 M d’un tampon HEPES, pH 7.5 ; ajuster avec 5 M de NaOH. NOTE : Lors de l’étape de réglage pH, porter des gants de protection, vêtements de protection, lunettes de protection et protection du visage (P280). En cas de contact avec les yeux (P305, P351, P338), rincer avec précaution à l’eau pendant plusieurs minutes enlever lentilles de contact si possible. Continuer à rincer et appeler immédiatement un centre antipoison ou un médecin (P310). Le code P renvoie à la déclaration de précaution (risque de classe et catégorie ; voir, par exemple, pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/ghs/).</li>
	<li>Préparer 100 mM L-lysine, 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysine, acide α-cétoglutarique 150 mM, ascorbate de sodium 100 mM, 10 mM d’ammonium, sulfate de fer (II) hexahydrate (sel de Mohr), 100 mM 5-phosphate de pyridoxal (PLP) et 100 mM le dithiothréitol (DTT).</li>
	<li>Préparer 1 M, 2M et 6M d’acide chlorhydrique (HCl) d’une solution de HCl 37 % (approximativement 12 M solution), suivant les mêmes consignes de sécurité que ceux décrits en 2.1. Remarque : Les solutions d’acide α-cétoglutarique, ascorbate de sodium et d’ammonium hexahydrate de sulfate ferreux s’imposent fraîches le jour d’utilisation. La solution de lysine peut être conservée pendant plusieurs mois à température ambiante. La solution PLP peut être conservée pendant un mois à 4 ° C. La solution de la TNT peut être conservée pendant un mois à-20 ° C.</li>
</ol>3. analyse à l’échelle des réactions
<ol><li>Élaboration de méthodes pour la réaction de décarboxylation (5R) - hydroxy - L-lysine<ol>
<li>Ajouter 11 µL de la solution 1 M d’HEPES tampon pH 7,5 (concentration finale de 50 mM) à un microtube 2 mL. Puis, ajouter 22 µL de 100 mM (5S) - hydroxy - L-lysine (concentration finale 10 mM), 2,2 µL de 100 mM PLP (concentration finale de 1 mM) et 2,2 µL de 100 mM DTT (concentration finale 1 mM). Remarque : Dans le cas de la réaction avec le LDCSrum, l’ajout de la TNT n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Ajouter le PLP-DC purifié (concentration finale de 0,1 mg/mL). Complet avec H2O pour un volume final de 220 µL.</li>
		<li>Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 3 h. NOTE : Secouer le mélange réactionnel avec un couvercle ouvert en plein air assure une bonne oxygénation du milieu réactionnel. Il n’est donc pas nécessaire bulles d’oxygène dans le milieu réactionnel.</li>
		<li>Prélever 10 µL du mélange réactionnel pour être analysés selon la procédure de suivi de réaction décrite à l’étape 6. Les échantillons sont de préférence dérivatisés et analysés directement après le prélèvement.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Élaboration de méthodes pour la réaction de cascade enzymatique combinant une étape d’hydroxylation catalysée par αKAO avec décarboxylation catalysée par PLP-DC<ol>
<li>Ajouter 11 µL de 1 M de HEPES tampon pH 7,5 (concentration finale de 50 mM) à un microtube 2 mL. Puis, ajouter 22 µL de 150 mM de l’acide α-cétoglutarique (concentration finale 15 mM), 5,5 µL de 100 mM d’ascorbate de sodium (concentration finale 2,5 mM), 22 µL de 10 mM de Mohr de sel (concentration finale de 1 mM) et 22 µL de 100 mM de L-lysine (concentration finale 10 mM).</li>
		<li>Complet avec H2O pour un volume final de 220 µL, compte tenu du volume de la solution d’enzyme à être ajouté à l’étape 3.2.3.</li>
		<li>Ajoutez l’enzyme requis αKAO purifiée selon la régiosélectivité ciblée : KDO1 pour l’hydroxylation en position C-3 ou KDO2 poste C-4 de L-lysine. La concentration finale de l’enzyme purifiée (0,05 à 0,5 mg/mL) a été déterminé permettre une conversion complète à environ 3 h.</li>
		<li>Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 3 h.</li>
		<li>Ajouter 2,2 µL de 100 mM du PLP (concentration finale ~ 1 mM) et 2,2 µL de 100 mM de la TNT (concentration finale ~ 1 mM). Remarque : Dans le cas de la réaction avec le LDCSrum, l’ajout de la TNT n’est pas nécessaire.</li>
		<li>Ajouter le PLP-DC purifié à une concentration qui permet une conversion complète à 18 h: LDCSrum à une concentration finale approximative de 0,1 mg/mL pour la réaction en cascade avec KDO1 et DCCpin à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL pour les réaction en cascade avec KDO2.</li>
		<li>Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert à l’air libre à 300 tr/min pendant 18 h.</li>
		<li>Exécuter une procédure de suivi comme au point 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Élaboration de méthodes pour la réaction de cascade enzymatique combinant deux étapes d’hydroxylation catalysées par αKAOs avec décarboxylation catalysée par PLP-DC<ol>
<li>Exécutez les étapes 3.2.1-3.2.2.</li>
		<li>Ajouter KDO1 à une concentration finale de 0,05 mg/mL. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 3h.</li>
		<li>Ajouter KDO2 à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL, calculée d’après le volume de la réaction initiale. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 18 h.</li>
		<li>Exécutez l’étape 3.2.5.</li>
		<li>Ajouter la purifiée PLP-DC DCCpin à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL, calculée d’après le volume de la réaction initiale. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, avec un couvercle ouvert en plein air, à 300 tr/min pendant 18 h.</li>
		<li>Exécutez la procédure de suivi comme au point 3.1.4.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. semi-préparative monotope réactions biocatalytiques
Remarque : Les réactions enzymatiques sont réalisées sur 0,1 mmol de L-lysine dans un verre en plein air 250 mL fiole Erlenmeyer pour un volume total de 10 mL.
<ol><li>Synthèse des dérivés monohydroxylated<ol>
<li>Ajouter 0,5 mL de tampon HEPES de 1 M, pH 7,5 (concentration finale de 50 mM) dans le ballon. Ensuite, ajouter 1 mL de 100 mM de L-lysine (concentration finale 10 mM), 1 mL d’acide α-cétoglutarique 150 mM (concentration finale 15 mM), 0,25 mL d’ascorbate de sodium 100 mM (concentration finale 2,5 mM), et sel de 1 mL de 10 mM Mohr (concentration finale de 1 mM).</li>
		<li>Complet avec H2O pour un volume final de 10 mL, en tenant compte du volume de la solution d’enzyme à être ajouté à l’étape 4.1.3.</li>
		<li>Ajoutez l’enzyme requis αKAO purifiée selon la régiosélectivité ciblée : KDO1 à une concentration finale de 0,075 mg/mL d’hydroxylation en position C-3 ou KDO2 à une concentration finale de 0,5 mg/mL pour le poste C-4 de L-lysine. La concentration finale de l’enzyme purifiée a été déterminée pour permettre une conversion complète à environ 3 h.</li>
		<li>Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante à 300 tr/min pendant la durée appropriée. Lorsque le contrôle de la réaction indique une réaction d’hydroxylation dûment rempli (exécuter toutes les étapes décrites dans l’étape 6 pour la réaction de protocole de surveillance), passer au point 4.1.5. Un temps de réaction typique est de 3 h.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de 100 mM PLP dans le mélange réactionnel de αKAO (concentration finale ~ 1 mM). Puis, ajouter 100 µL de 100 mM DTT (concentration finale ~ 1 mM), sauf quand on utilise la LDCSrum.</li>
		<li>Ajouter purifiée PLP-DC : LDCSrum à une concentration finale approximative de 0,05 mg/mL pour la réaction en cascade avec KDO1 ou DCCpin à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL pour la réaction en cascade avec KDO2.</li>
		<li>Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, 300 tr/min, pour 18 h et continuer directement vers les étapes détaillées dans l’étape 4.3.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Synthèse d’un dérivé dihydroxylé<ol>
<li>Ajouter 0,5 mL de tampon HEPES de 1 M, pH 7,5 (concentration finale de 50 mM), 1 mL de 100 mM de L-lysine (concentration finale 10 mM), 1 mL d’acide α-cétoglutarique 150 mM (concentration finale 15 mM), 0,25 mL d’ascorbate de sodium 100 mM (concentration finale 2,5 mM) , et sel de 1 mL de 10 mM Mohr (concentration finale de 1 mM). Complet avec H2O pour un volume final de 10 mL, en tenant compte du volume de la solution d’enzyme à être ajouté à l’étape 4.2.2.</li>
		<li>Ajouter KDO1 à une concentration finale de 0,075 mg/mL. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante, à 300 tr/min pour la durée appropriée.</li>
		<li>Lorsque le suivi de la réaction indique une réaction d’hydroxylation dûment rempli (Voir l’étape 6 pour la réaction de protocole de surveillance), passez à l’étape 4.2.5. Un temps de réaction typique est de 3 h.</li>
		<li>Ajouter 1 mL d’acide α-cétoglutarique 150 mM (concentration finale 15 mM), 0,25 mL d’ascorbate de sodium 100 mM (concentration finale 2,5 mM), et sel de 1 mL de 10 mM Mohr (concentration finale de 1 mM).</li>
		<li>Ajouter KDO2 à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL, calculée d’après le volume de la réaction initiale. Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante à 300 tr/min pendant 18 h.</li>
		<li>Lorsque le suivi de la réaction indique une réaction dihydroxylation dûment rempli (Voir l’étape 6 pour la réaction de protocole de surveillance), passez à l’étape 4.2.7. Un temps de réaction typique est de 18 h.</li>
		<li>Ajouter 100 µL de 100 mM de la TNT (concentration finale ~ 1 mM), sauf quand on utilise la LDCSrum.</li>
		<li>Ajouter la purifiée DCCpin à une concentration finale approximative de 0,5 mg/mL, calculée d’après le volume de la réaction initiale.</li>
		<li>Agiter le mélange réactionnel à la température ambiante à 300 tr/min pendant 18 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trempe<ol>
<li>Refroidir le mélange réactionnel en plaçant le verre de 250 mL fiole Erlenmeyer dans un bain de glace.</li>
		<li>Ajouter délicatement, pendant environ 1 min, 0,25 mL de HCl de 6 M en le secouant manuellement doucement le mélange réactionnel refroidi. Suivez les mêmes instructions de sécurité que ceux décrits à l’étape 2.1.</li>
		<li>Transfert le mélange acide dans une centrifugeuse de fond conique de 50 mL tube utilisant un verre pipette Pasteur équipée d’une ampoule, puis centrifuger à 1 680 x g et 4 ° C pendant 15 minutes.</li>
		<li>Retirer le surnageant et garder de côté dans un ballon à fond rond 250 mL.</li>
		<li>Ajouter 10 mL d’eau désionisée dans le tube à centrifuger conique-fond contenant le culot. Vortex pour remettre en suspension l’extrait concentré.</li>
		<li>Centrifuger à 1 680 x g, 4 ° C, pendant 15 minutes.</li>
		<li>Retirer le surnageant et ajoutez-le à la ballon à fond rond 250 mL contenant le premier surnageant (étape 4.3.4).</li>
		<li>Geler les surnageants recueillis par immersion du ballon dans l’azote liquide avec constante main tourbillonnant et transférer le ballon immédiatement vers un collecteur de benchtop lyophilisateur pour éviter que le matériau de la fonte.</li>
		<li>Après que le processus de lyophilisation est terminé (la nuit), enlever le ballon de la lyophilisateur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. purification des aminoalcools du mélange réactionnel enzymatique brut
<ol><li>Résine échangeuse d’ions<ol>
<li>Dissoudre le produit lyophilisé dans le montant minimum de solution aqueuse 0,1 M de HCl (environ 4 mL) jusqu'à ce que les particules solides ne sont plus visibles à le œil nu.</li>
		<li>La condition d’une résine échangeuse de cations groupe fonctionnel de l’acide sulfonique, maille de 200-400, dans une colonne de verre (20 x 250 mm) par l’éluant à pression atmosphérique 1 M HCl (volumes de colonne 4) suivie de 0,1 M HCl (4 volumes de colonne ; de la colonne volume = 10 mL).</li>
		<li>Charger l’échantillon soigneusement dans la partie supérieure de la résine sur les parois de la colonne de verre à l’aide d’une micropipette 1 000 µL. Ensuite, rincer le tube à centrifuger conique-fond qui contenait le produit brut trois fois avec 1 mL 0,1 M de HCl solution aqueuse par laver et charger les volumes de rinçage qui en résultent sur la colonne de la même manière.</li>
		<li>Éluer avec un non-linéaire dégradé : 4 volumes de colonne de 0,1 M HCl, 4 volumes de colonne d’eau, 4 volumes de colonne de 5 % NH4OH, 4 volumes de colonne de 10 % NH4OH, 4 volumes de colonne de 15 % NH4OH, 4 volumes de colonne de 20 % NH4OH , 4 volumes de colonne 25 % NH4OH et enfin 4 volumes de colonne de 28 % NH4OH.</li>
		<li>Surveiller la purification par HPLC (voir étape 6).</li>
		<li>Mettre en commun les fractions contenant le composé (NH4OH 20-28 %) et Freeze-Dry comme décrit dans les étapes 4.3.8-4.3.9. Remarque : La colonne échangeuse d’ions peut être réutilisée après élution avec de l’eau déionisée à la neutralisation de l’eau d’élution (environ 50 mL), suivie de la remise en état par élution avec 50 mL de HCl 1 M.</li>
	</ol>
</li>
	<li>SPE<ol>
<li>Solubiliser le composé lyophilisé dans environ 2 mL d’H3PO4/water (20 µL/mL).</li>
		<li>Place une mode mixte échangeuse de cations SPE 6 mL-cartouche sur un collecteur d’extraction raccordé à une pompe à eau. Conditionner la cartouche de dessin par le biais de 4 mL de méthanol sous pression réduite fournie par le collecteur. Equilibrer la cartouche en aspirant à travers 4 mL de H3PO4/water (20 µL/mL).</li>
		<li>Charger l’échantillon sur la cartouche à l’aide d’une micropipette µL 1 000 dans la partie supérieure de la résine sur les parois de la colonne de verre et rincer le flacon contenant le produit trois fois avec 0,75 mL de H3PO4/water (20 µL/mL) / cycle de lavage. Charger le volume de rinçage résultant sur la colonne de la même manière.</li>
		<li>Laver la cartouche par élution sous pression réduite, fournie par le collecteur, 4 mL de 2 % HCOOH dans l’eau, puis avec 4 mL d’eau. Éluer avec une pente de NH4OH dans l’eau (4 mL pour chaque élution, à partir de 4 % NH4OH : 10 %, 15 %, 15 %, 20 % et 28 %).</li>
		<li>Surveiller la purification par HPLC en analysant chaque fraction selon la réaction de surveillance protocole décrit à l’étape 6. Gardez toutes les fractions contenant pur dérivé désiré selon ultraviolet chromatogramme (UV) et passez à l’étape 5.2.6.</li>
		<li>Piscine les fractions contenant le composé dans un 100 mL ballon à fond rond, rincer les tubes contenant les fractions avec de l’eau et ajouter le volume de rinçage à la 100 mL autour de ballon.</li>
		<li>Éliminer le solvant sous pression réduite, à l’aide d’un évaporateur rotatif équipé d’une bouilloire de bain thermostat à 40 ° C et relié à une pompe à vide à 10 mbar.</li>
		<li>Solubiliser le solide dans un volume minimal d’eau et transvaser la solution dans un taré mL 25 ballon à fond rond. Rincer le ballon avec un volume minimal d’eau, ajouter le volume de rinçage dans la fiole de 25 mL et passez à l’étape 5.2.9.</li>
		<li>Peser le produit purifié et calculer le rendement.</li>
		<li>Dissoudre le produit purifié dans le volume minimal de 2M de HCl jusqu'à ce que les particules solides ne sont plus visibles à le œil nu et lyophiliser tel que décrit dans les étapes 4.3.8-4.3.9. Remarque : Les aminoalcools sont des composés sensibles et sont gardés comme leurs chlorhydrates.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. surveillance et analyse des produits
<ol><li>Dérivation des substrats et des produits avant l’analyse HPLC Remarque : Les substrats et les produits doivent être dérivés comme les dérivés aromatiques pour augmenter leur detectivity chromatographique UV. Nous avons utilisé 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzène (DNFB). Chaque échantillon est injecté dans la CLHP immédiatement après dérivatisation.<ol>
<li>Prendre 10 µL de la réaction enzymatique et le transfert à un microtube 1,5 mL. Ajouter 10 µL de 0,25 M de NaHCO3 solution aqueuse, 100 µL d’éthanol et 30 µL de 2,5 mg/mL de solution DNFB dans l’éthanol.</li>
		<li>Fermez le microtube et agiter la solution obtenue pendant 1 h à 65 ° C, à 1 000 tr/min. Étancher avec 10 µL 1 M de HCl.</li>
		<li>Filtrer sur un filtre de seringue non stérile diamètre 4 mm membrané 0,22 µm pore taille hydrophile Polyfluorure de vinylidène (PVDF) à l’aide d’une seringue à embout Luer 1 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Effectuer une surveillance de la réaction de dioxygénase en utilisant n’importe quel système capable de séparer des acides aminés dérivés. Ce protocole implique détection UV des acides aminés dérivés par le groupe de chromophore dinitrobenzène (DNB)27.<ol>
<li>La CLHP avec C18 dotée d’une colonne en phase inversée triméthyl silyl Capping (5 µm, 3 x 150 mm).</li>
		<li>Équilibrer la colonne C18 avec l’éluant (30 : 70) B (MeCN + 0,1 % TFA) d’éluant A (H2O + 0,1 % TFA) à un débit de 1 mL/min et 35 ° C pendant 15 min (correspondant à environ 20 volumes de colonne).</li>
		<li>Injecter 10 µL du mélange réactionnel dérivés (voir étape 6.1) sur la colonne CLHP C18. Utilisez un mélange de MeCN, 0,1 % TFA/H2O et 0,1 % TFA comme éluant avec un dégradé linéaire (ratio 30 : 70 à 70 : 30 en 9 min, température de 35 ° C, débit de 1 mL/min).</li>
		<li>Utiliser la détection UV fixée à 400 nm pour analyser les produits élués sur la colonne de chromatographie. DNB-lysine élue généralement environ 6,5 min, hydroxylé DNB-lysine autour de 5,5 min, dihydroxylé DNB-lysine environ 4,2 min et DNB-aminodiol environ 5,3 min.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. RMN analyse des aminoalcools purifiées
<ol><li>Dissoudre les aminoalcools purifiées en D2O (700 µL) et transvaser la solution dans un tube de résonance magnétique nucléaire (RMN).</li>
	<li>Acquisition de 1H et les spectres de RMN du 13C 13selon approprié NMR facility protocoles28.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Nestl, B. M., Hammer, S. C., Nebel, B. A., Hauer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+Generation+of+Biocatalysts+for+Organic+Synthesis.">New Generation of Biocatalysts for Organic Synthesis.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 53 (12), 3070-3095 (2014).</li><li>Reetz, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalysis+in+Organic+Chemistry+and+Biotechnology:+Past,+Present,+and+Future.">Biocatalysis in Organic Chemistry and Biotechnology: Past, Present, and Future.</a> J. Am. Chem. Soc. 135 (34), 12480-12496 (2013).</li><li>Turner, N. J., O'Reilly, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+retrosynthesis.">Biocatalytic retrosynthesis.</a> Nat. Chem. Biol. 9 (5), 285-288 (2013).</li><li>Oroz-Guinea, I., Garcia-Junceda, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzyme+catalysed+tandem+reactions.">Enzyme catalysed tandem reactions.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 17 (2), 236-249 (2013).</li><li>Ricca, E., Brucher, B., Schrittwieser, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Enzymatic+Cascade+Reactions:+Overview+and+Perspectives.">Multi-Enzymatic Cascade Reactions: Overview and Perspectives.</a> Adv. Syn. Catal. 353 (13), 2239-2262 (2011).</li><li>Ager, D. J., Prakash, I., Schaad, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1,2-Amino+Alcohols+and+Their+Heterocyclic+Derivatives+as+Chiral+Auxiliaries+in+Asymmetric+Synthesis.">1,2-Amino Alcohols and Their Heterocyclic Derivatives as Chiral Auxiliaries in Asymmetric Synthesis.</a> Chem. Rev. 96 (2), 835-876 (1996).</li><li>Abiko, A., Masamune, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+improved,+convenient+procedure+for+reduction+of+amino+acids+to+aminoalcohols:+Use+of+NaBH4-H2SO4.">An improved, convenient procedure for reduction of amino acids to aminoalcohols: Use of NaBH4-H2SO4.</a> Tet. Lett. 33 (38), 5517-5518 (1992).</li><li>McKennon, M. J., Meyers, A. I., Drauz, K., Schwarm, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+convenient+reduction+of+amino+acids+and+their+derivatives.">A convenient reduction of amino acids and their derivatives.</a> J. Org. Chem. 58 (13), 3568-3571 (1993).</li><li>Singh, P., Samanta, K., Das, S. K., Panda, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acid+chirons:+a+tool+for+asymmetric+synthesis+of+heterocycles.">Amino acid chirons: a tool for asymmetric synthesis of heterocycles.</a> Org. Biomol. Chem. 12 (33), 6297-6339 (2014).</li><li>Colomer, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aminomethylhydroxylation+of+alkenes:+Exploitation+in+the+synthesis+of+scaffolds+for+small+molecule+libraries.">Aminomethylhydroxylation of alkenes: Exploitation in the synthesis of scaffolds for small molecule libraries.</a> Bioorg. Med. Chem. 23 (11), 2736-2740 (2015).</li><li>Steinreiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Aromatic+1,2-Amino+Alcohols+Utilizing+a+Bienzymatic+Dynamic+Kinetic+Asymmetric+Transformation.">Synthesis of Aromatic 1,2-Amino Alcohols Utilizing a Bienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformation.</a> Adv. Syn. Catal. 349 (8-9), 1379-1386 (2007).</li><li>Steinreiber, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Thermodynamic+and+Kinetic+Limitations+of+Aldolase-Catalyzed+Reactions+by+Applying+Multienzymatic+Dynamic+Kinetic+Asymmetric+Transformations.">Overcoming Thermodynamic and Kinetic Limitations of Aldolase-Catalyzed Reactions by Applying Multienzymatic Dynamic Kinetic Asymmetric Transformations.</a> Ang. Chem. Int. Ed. 46 (10), 1624-1626 (2007).</li><li>Kohls, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+Access+to+All+Four+Diastereomers+of+a+1,3-Amino+Alcohol+by+Combination+of+a+Keto+Reductase-+and+an+Amine+Transaminase-Catalysed+Reaction.">Selective Access to All Four Diastereomers of a 1,3-Amino Alcohol by Combination of a Keto Reductase- and an Amine Transaminase-Catalysed Reaction.</a> Adv. Syn. Catal. 357 (8), 1808-1814 (2015).</li><li>Sehl, T., Maugeri, Z., Rother, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-step+synthesis+strategies+towards+1,2-amino+alcohols+with+special+emphasis+on+phenylpropanolamines.">Multi-step synthesis strategies towards 1,2-amino alcohols with special emphasis on phenylpropanolamines.</a> J. Mol. Cat. B: Enzymatic. 114, 65-71 (2015).</li><li>Martinez, S., Hausinger, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Catalytic+Mechanisms+of+Fe(II)-+and+2-Oxoglutarate-dependent+Oxygenases.">Catalytic Mechanisms of Fe(II)- and 2-Oxoglutarate-dependent Oxygenases.</a> J. Biol. Chem. 290 (34), 20702-20711 (2015).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Mono&#8208;and+Dihydroxylated+Amino+Acids+with+New+&#945;&#8208;Ketoglutarate&#8208;Dependent+Dioxygenases:+Biocatalytic+Oxidation+of+C-H+Bonds.">Synthesis of Mono&#8208;and Dihydroxylated Amino Acids with New &#945;&#8208;Ketoglutarate&#8208;Dependent Dioxygenases: Biocatalytic Oxidation of C-H Bonds.</a> ChemCatChem. , (2014).</li><li>Suzuki, H., Kurihara, S., Kusano, T., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+4.">Ch. 4.</a> Polyamines. 4, 47-59 (2015).</li><li>Kind, S., Wittmann, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bio-based+production+of+the+platform+chemical+1,5-diaminopentane.">Bio-based production of the platform chemical 1,5-diaminopentane.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (5), 1287-1296 (2011).</li><li>Schneider, J., Wendisch, V. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotechnological+production+of+polyamines+by+bacteria:+recent+achievements+and+future+perspectives.">Biotechnological production of polyamines by bacteria: recent achievements and future perspectives.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 91 (1), 17-30 (2011).</li><li>Qian, Z. -. G., Xia, X. -. X., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+Escherichia+coli+for+the+production+of+cadaverine:+A+five+carbon+diamine.">Metabolic engineering of Escherichia coli for the production of cadaverine: A five carbon diamine.</a> Biotechnol. Bioeng. 108 (1), 93-103 (2011).</li><li>Shin, J. H., Lee, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+engineering+of+microorganisms+for+the+production+of+L-arginine+and+its+derivatives.">Metabolic engineering of microorganisms for the production of L-arginine and its derivatives.</a> Microb. Cell. Fact. 13, (2014).</li><li>Nguyen, A., Schneider, J., Reddy, G., Wendisch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fermentative+Production+of+the+Diamine+Putrescine:+System+Metabolic+Engineering+of+Corynebacterium+Glutamicum.">Fermentative Production of the Diamine Putrescine: System Metabolic Engineering of Corynebacterium Glutamicum.</a> Metabolites. 5 (2), 211 (2015).</li><li>Kidron, H., Repo, S., Johnson, M. S., Salminen, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Classification+of+Amino+Acid+Decarboxylases+from+the+Alanine+Racemase+Structural+Family+by+Phylogenetic+Studies.">Functional Classification of Amino Acid Decarboxylases from the Alanine Racemase Structural Family by Phylogenetic Studies.</a> Mol. Biol. Evol. 24 (1), 79-89 (2007).</li><li>Takatsuka, Y., Onoda, M., Sugiyama, T., Muramoto, K., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Characteristics+of+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase+Capable+of+Decarboxylating+Both+L-Lysine+and+L-Ornithine.">Novel Characteristics of Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase Capable of Decarboxylating Both L-Lysine and L-Ornithine.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (6), 1063-1069 (1999).</li><li>Takatsuka, Y., Tomita, T., Kamio, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+Amino+Acid+Residues+Conferring+Substrate+Specificity+upon+Selenomonas+ruminantium+Lysine+Decarboxylase.">Identification of the Amino Acid Residues Conferring Substrate Specificity upon Selenomonas ruminantium Lysine Decarboxylase.</a> Biosci. Biotechnol. Biochem. 63 (10), 1843-1846 (1999).</li><li>Baud, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Approaches+towards+the+Synthesis+of+Chiral+Amino+Alcohols+from+Lysine:+Cascade+Reactions+Combining+alpha-Keto+Acid+Oxygenase+Hydroxylation+with+Pyridoxal+Phosphate-+Dependent+Decarboxylation.">Biocatalytic Approaches towards the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from Lysine: Cascade Reactions Combining alpha-Keto Acid Oxygenase Hydroxylation with Pyridoxal Phosphate- Dependent Decarboxylation.</a> Adv. Syn. Catal. 359 (9), 1563-1569 (2017).</li><li>Ilisz, I., Berkecz, R., Peter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+chiral+derivatizing+agents+in+the+high-performance+liquid+chromatographic+separation+of+amino+acid+enantiomers:+a+review.">Application of chiral derivatizing agents in the high-performance liquid chromatographic separation of amino acid enantiomers: a review.</a> J. Pharm. Biomed. Anal. 47 (1), 1-15 (2008).</li><li>. Organic Chemistry. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Available from: <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy">https://www.jove.com/science-education/5680/nuclear-magnetic-resonance-nmr-spectroscopy</a> (2017)</li><li>Hibi, M., Ogawa, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+and+biotechnology+applications+of+aliphatic+amino+acid+hydroxylases+belonging+to+the+Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent+dioxygenase+superfamily.">Characteristics and biotechnology applications of aliphatic amino acid hydroxylases belonging to the Fe(II)/alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase superfamily.</a> Appl. Microbiol. Biotechnol. 98 (9), 3869-3876 (2014).</li><li>H&#252;ttel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biocatalytic+Production+of+Chemical+Building+Blocks+in+Technical+Scale+with+&#945;-Ketoglutarate-Dependent+Dioxygenases.">Biocatalytic Production of Chemical Building Blocks in Technical Scale with &#945;-Ketoglutarate-Dependent Dioxygenases.</a> Chem. Ing. Tec. 85 (6), 809-817 (2013).</li><li>Kourist, R., Guterl, J. -. K., Miyamoto, K., Sieber, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+Decarboxylation-An+Emerging+Reaction+for+Chemicals+Production+from+Renewable+Resources.">Enzymatic Decarboxylation-An Emerging Reaction for Chemicals Production from Renewable Resources.</a> ChemCatChem. 6 (3), 689-701 (2014).</li><li>Lee, J., Michael, A. J., Martynowski, D., Goldsmith, E. J., Phillips, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phylogenetic+diversity+and+the+structural+basis+of+substrate+specificity+in+the+beta/alpha-barrel+fold+basic+amino+acid+decarboxylases.">Phylogenetic diversity and the structural basis of substrate specificity in the beta/alpha-barrel fold basic amino acid decarboxylases.</a> J. Biol. Chem. 282 (37), 27115-27125 (2007).</li><li>Porter, J. L., Rusli, R. A., Ollis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Enzymes+for+Industrial+Biocatalysis.">Directed Evolution of Enzymes for Industrial Biocatalysis.</a> ChemBiochem. 17 (3), 197-203 (2016).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Dérivés et des aminoalcools chiraux ont un large éventail d’applications, allant des auxiliaires chiraux pour la synthèse organique à la thérapie pharmaceutique. Synthèse en plusieurs étapes de fabrication d’aminoalcools par synthèse organique classique sont nombreux, mais peut ne pas être efficace à cause de mesures de protection/déprotection fastidieux ainsi qu’un contrôle sensible de la stéréochimie16. Une approche BIOCATALYTIQUE qui distribue avec les mesures de protection...

Malgré les avantages offerts par biocatalyse, l’intégration des étapes biocatalytiques de voies synthétiques ou itinéraires biocatalytiques totales reste essentiellement limitée aux résolutions cinétiques enzymatiques. Ces itinéraires ont été largement utilisés dans un premier temps en synthèse asymétrique de chimio-enzymatique, mais biocatalyse offre beaucoup plus de possibilités dans le groupe fonctionnel interconversions avec grande stéréosélectivité1,2,3 . En outre, comme réactions biocatalytiques sont déroulent dans des conditions similaires, il est donc possible d’effectuer des réactions de la cascade dans un seul récipient fashion4,5.
Aminoalcools chiraux sont des molécules polyvalents pour une utilisation comme auxiliaires ou des échafaudages en synthèse organique6. La portion d’alcool aminé est fréquemment trouvée dans les métabolites secondaires et dans les ingrédients pharmaceutiques actifs (API). Β-aminoalcools primaires sont facilement disponibles auprès des acides α-aminés correspondantes par synthèse chimique conventionnelle, mais l’accès à γ-aminoalcools chiraux ou aminoalcools secondaires nécessite souvent fastidieux parcours synthétiques ainsi que de sensibles contrôle de la stéréochimie7,8,9,10. En raison de sa grande stéréosélectivité, biocatalyse peut fournir une voie de synthèse supérieure à ces briques chiraux11,12,13,14.
Nous avons déjà indiqué la synthèse des mono - et di-hydroxy-L-lysines par diastéréosélective hydroxylation enzymatique catalysée par dioxygénases du fer (II) / dépendante de le α-cétoacide famille oxygénase (αKAO) (Figure 1)15. En particulier, à partir de L-lysine, le KDO1 dioxygénase catalyse la formation du (3S) - dérivé hydroxylé (1), tandis que les 4R- dérivé (2) est formé par la réaction avec KDO2 dioxygénase. Hydroxylations successives regiodivergent par KDO1 et KDO2 conduisent à la formation des (3R, 4R) - dihydroxy - L-lysine (3) sous forme optiquement pure. Cependant, la gamme limitée de substrat de ces enzymes empêche leur grande utilisation en synthèse chimique, en particulier dans l’hydroxylation des amines simples, une portion d’acide carboxylique en position α du groupe amino est essentielle pour l’activité16.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig1.jpg"> Figure 1 : conversions biocatalytiques de L-lysine. Conversion en (3S) - hydroxy - L-lysine (1) catalysée par la KDO1 dioxygénase ; (4R)- hydroxy - L-lysine (2) catalysée par KDO2 dioxygénase ; et 3R, 4R- dihydroxy - L-lysine (3) par réaction en cascade catalysée successivement par KDO1 et KDO2 dioxygénases. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Décarboxylation est une réaction commune au métabolisme17. En particulier, les acides aminés DCs (EC 4.1.1) sont exemptes de cofacteur (pyruvoyl-dépendante) ou enzymes PLP-dépendantes et catalyser la décarboxylation des acides aminés dans les polyamines correspondants chez les bactéries et supérieur organismes18,19 , 20 , 21 , 22. les mono - et dihydroxy composés (Figure 3) 4–7, 10-11 correspondent aux hydroxylés cadavérine, la diamine obtenue par décarboxylation de la L-lysine. La cadavérine est une composante clée pour l’industrie chimique, plus précisément, c’est un composant de polymères polyamide et polyuréthane. Par conséquent, production bio de cette diamine provenant de ressources renouvelables a attiré l’attention comme une alternative à la route à base de pétrole, et divers micro-organismes ont été conçus à cet effet. Dans ces voies métaboliques, lysine DC (PMA) est l’enzyme clé. PMA est une enzyme dépendante du PLP, appartenant à la famille alanine racémase (AR) structurel23. Les contrôleurs de domaine de PLP-dépendantes (PLP-DCs) sont connus pour être fortement axée sur le substrat. Cependant, quelques enzymes possèdent la capacité de la promiscuité légère, étant actif vers acides aminés aussi bien L-lysine et L-ornithine, comme par exemple la PMD à partir de Selenomonas rumirantium (LDCSrum), qui a des constantes cinétiques similaires pour lysine et ornithine décarboxylation24,25. Ce substrat étendu spécificité fait cette enzyme un bon candidat pour la décarboxylation des mono - et di-hydroxy-L-lysine. En outre, pour trouver DCs active vers les dérivés hydroxyles de lysine, nous avons examiné le contexte génomique des gènes codant les enzymes αKAO. En effet, dans les génomes procaryotes les gènes codant les enzymes impliquées dans la biosynthèse des même sont généralement conjointement localisés dans des groupes de gènes. Le gène KDO2 (à partir de Chitinophaga pinensis) a été trouvé Co localisé avec un gène codant putatif PLP-DC (Figure 2). En revanche, aucun gène codant la DC n’a été trouvé en analysant le contexte génomique de la dioxygénase KDO1. La protéine PLP-DC de c. pinensis (DCCpin) fut donc choisie comme un candidat prometteur pour catalyser l’étape de la décarboxylation de la réaction en cascade.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig2.jpg"> Figure 2 : contexte génomique du gène KDO2 dans c. pinensis. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Par conséquent, nous avons conçu des réactions enzymatiques cascade dioxygénases et DCs pour réaliser la synthèse d’alcools aliphatiques chiraux β - et γ-amino acides aminés (Figure 3). Comme indiqué précédemment, l’oxydation de C-H, catalysée par la αKAO introduit le centre stéréogène substituant hydroxy avec diastéréosélectivité total ; la chiralité Cβ/γ est préservée dans l’étape décarboxylante, qui affecte uniquement le carbone Cα des acides aminés portion16.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56926/56926fig3.jpg"> Figure 3 : analyse rétrosynthétique. Retrosynthesis (A) de β - et γ-aminoalcools (R) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (4) (5R) - hydroxy - L-Lysine et le (S) - 1, 5 - diaminopentan-2-ol (5) et 1, 5-diaminopentan-3-ol (6) de L-lysine. (B) Retrosynthesis de β, γ et β, δ-amino diols (2S, 3S) - 1, 5 - diaminopentane-2, 3-diol (10) et (2R, 4S) - 1,5 - diaminopentane-2, 4-diol (11) à partir de (5R)- hydroxy-L-lysine et 2R, 3R- 1,5 - diaminopentane-2, 3-diol (7) à partir de L-lysine. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56926/56926fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
À partir de L-lysine et ses 5R-dérivé hydroxylé, nous rapportons ici un deux/trois étape, un pot, procédure enzymatique combinant dioxygénases et PLP-DCs pour obtenir la cible aminoalcools. Avant la synthèse à l’échelle du laboratoire des molécules cibles, la méthode a été développée à l’échelle analytique pour ajuster les conditions de réaction, par exemple, les concentrations de l’enzyme, nécessaires pour permettre la conversion complète de produits de départ ; Nous présentons cette procédure aussi bien.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>L-lysine hydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L5626</td><td></td></tr><tr><td>(5&lt;em&gt;S&lt;/em&gt;)-hydroxy-L-lysine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>GPS NONH</td><td>Out sourcing</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-ketoglutaric acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>75892</td><td></td></tr><tr><td>Sodium ascorbate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7631</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium Iron(II) sulfate hexahydrate</td><td>Acros</td><td>201370250</td><td></td></tr><tr><td>Pyridoxal phosphate (PLP)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>82870</td><td></td></tr><tr><td>3,4-dimercaptobutane-1,2-diol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>1-fluoro-2,4-dinitrobenzene (DNFB)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D1529</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20825.290</td><td></td></tr><tr><td>Sodium hydrogen carbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71631</td><td></td></tr><tr><td>HCl 37%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>435570</td><td></td></tr><tr><td>HCl 0.1M</td><td>Fluka</td><td>35335</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83640.320</td><td></td></tr><tr><td>2,2,2-trifluoroacetic acid</td><td>VWR</td><td>153112E</td><td></td></tr><tr><td>Ammonia 28%</td><td>VWR</td><td>21182.294</td><td></td></tr><tr><td>Methanol HiPerSolv CHROMANORM for LC-MS</td><td>VWR</td><td>83638.32</td><td></td></tr><tr><td>Formic acid</td><td>Acros</td><td>270480010</td><td></td></tr><tr><td>Phosphoric acid 85%</td><td>Acros</td><td>201145000</td><td></td></tr><tr><td>Deuterium oxide</td><td>Acros</td><td>320,710,075</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5881</td><td></td></tr><tr><td>C18 HPLC column</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4601-Y0</td><td></td></tr><tr><td>Accela UHPLC System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accela PDA detector</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4mm syringe filters - 0,22&amp;micro;m - PVDF</td><td>Merck</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Single-use tuberculin syringe with ml graduation, Luer tip</td><td>VWR</td><td>HSWA5010.200V0</td><td></td></tr><tr><td>Cation exchange resin 100-200&amp;nbsp;mesh</td><td>Sigma Aldrich</td><td>217506</td><td></td></tr><tr><td>Mixed mode cation-exchange solid-phase extraction cartridge 6 mL</td><td>Waters</td><td>186000776</td><td></td></tr><tr><td>Extraction manifold</td><td>Waters</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>B&amp;uuml;chi</td><td>531-0103</td><td></td></tr><tr><td>Lyophilizer alpha 1-2 LDplus</td><td>Christ</td><td>L083302</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000031</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000074</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 500 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000112</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 1000 &amp;micro;L</td><td>Eppendorf</td><td>3121000120</td><td></td></tr><tr><td>300 MHz spectrometer</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL microtube</td><td>CLEARLine</td><td>CL20.002.0500</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical-bottom centrifuge tube</td><td>Fischer Scientific</td><td>05-539-8</td><td></td></tr><tr><td>25 mL round-bottom flask 14/23</td><td>Fischer Scientific</td><td>10353331</td><td></td></tr><tr><td>100 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL round-bottom flask 29/32</td><td>Fischer Scientific</td><td>11786183</td><td></td></tr><tr><td>250 mL erlenmeyer flask</td><td>Fischerbrand</td><td>15496143</td><td></td></tr></tbody></table>

enzymatic cascade reactions for the synthesis of chiral amino alcohols from l-lysine

Aminés alcools sont des composés polyvalents avec un large éventail d’applications. Par exemple, ils ont servi comme échafaudages chiraux en synthèse organique. Leur synthèse par classiques de chimie organique nécessite souvent des processus de synthèse à plusieurs étapes fastidieuses, avec contrôle difficile du résultat stéréochimique. Nous présentons un protocole enzymatiquement synthétiser des alcools aminés à partir de la L-lysine facilement disponible en 48 h. Ce protocole combine deux réactions chimiques qui sont très difficiles à mener en synthèse organique classique. Dans la première étape, la régio - et diastéréosélective l’oxydation d’une liaison C-H non activée de la lysine chaîne latérale est catalysée par une dioxygénase ; un deuxième régio - et diastéréosélective d’oxydation catalysée par une dioxygénase regiodivergent peut conduire à la formation des 1, 2-diols. Dans la dernière étape, le groupe carboxylique de l’acide aminé alpha est clivé par une décarboxylase de phosphate de pyridoxal (PLP) (DC). Cette étape décarboxylante affecte uniquement le carbone alpha de l’acide aminé, en conservant le centre stéréogène hydroxy substitué en position bêta/gamma. Les aminoalcools qui en résultent sont donc optiquement enrichis. Le protocole a été appliqué avec succès à la synthèse de quatre aminoalcools semipreparative-échelle. Surveillance des réactions a été réalisée par chromatographie liquide haute performance (HPLC) après dérivatisation par 1-fluoro-2, 4-dinitrobenzène. Simple purification par extraction en phase solide (SPE) accordée les aminoalcools avec d’excellents rendements (93 % de > 95 %).

Nous avons déjà rapporté la synthèse des mono - et di-hydroxy-L-lysines par diastéréosélective hydroxylation enzymatique catalysée par dioxygénases du fer (II) / αKAO famille (Figure 1)16. Afin d’optimiser le protocole des cascades ensemble présenté ici, qui combinent une ou deux étapes d’hydroxylation catalysées par une αKAO suivie d’une étape de décarboxylation catalysée par un PLP-DC, les conditions de réact...

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Enzymatic Cascade Reactions for the Synthesis of Chiral Amino Alcohols from L-lysine

Aminoalcools chiraux sont des molécules polyvalents pour une utilisation comme échafaudages en synthèse organique. A partir de L-lysine, synthétiser des aminoalcools par une réaction enzymatique cascade combinant diastéréosélective Cabay oxydation catalysée par dioxygénase suivie d’un clivage de la portion d’acide carboxylique de l’acide aminé hydroxyle correspondant par un décarboxylase.

Réactions de Cascade enzymatique pour la synthèse des aminoalcools chiraux de L-lysine

Amino alcohols are versatile compounds with a wide range of applications. For instance, they have been used as chiral scaffolds in organic synthesis. ...

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12.0K vues.  CEA, CNRS, Univ Evry, Univ Paris-Saclay. Aminoalcools chiraux sont des molécules polyvalents pour une utilisation comme échafaudages en synthèse organique. A partir de L-lysine, synthétiser des aminoalcools par une réaction enzymatique cascade combinant diastéréosélective Cabay oxydation catalysée par dioxygénase suivie d’un clivage de la portion d’acide carboxylique de l’acide aminé hydroxyle correspondant par un décarboxylase.

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Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical probe that targets the enzyme&#39;s active sites. A reporter tag introduced into the probe allows for the detection of the labeled enzyme by in-gel fluorescence scanning, protein blot, fluorescence microscopy, or liquid chromatography-mass spectrometry. Here, we describe the preparation and use of the compound ARN14686, a click chemistry activity-based probe (CC-ABP) that selectively recognizes the enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA). NAAA is a cysteine hydrolase that promotes inflammation by deactivating endogenous peroxisome proliferator-activated receptor (PPAR)-alpha agonists such as palmitoylethanolamide (PEA) and oleoylethanolamide (OEA). NAAA is synthesized as an inactive full-length proenzyme, which is activated by autoproteolysis in the acidic pH of the lysosome. Localization studies have shown that NAAA is predominantly expressed in macrophages and other monocyte-derived cells, as well as in B-lymphocytes. We provide examples of how ARN14686 can be used to detect and quantify active NAAA ex vivo in rodent tissues by protein blot and fluorescence microscopy.

Preparation and In Vivo Use of an Activity-based Probe for N-acylethanolamine Acid Amidase

Here, we describe the preparation and use of an activity-based probe (ARN14686, undec-10-ynyl-N-[(3S)-2-oxoazetidin-3-yl]carbamate) that allows for the detection and quantification of the active form of the proinflammatory enzyme N-acylethanolamine acid amidase (NAAA), both in vitro and ex vivo.

Préparation et<em&gt; In Vivo</em&gt; L&#39;utilisation d&#39;une sonde basée sur les activités pour<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Amidase Acid

Activity-based protein profiling (ABPP) is a method for the identification of an enzyme of interest in a complex proteome through the use of a chemical ...

Recherche

Biochimie

A Facile and Efficient Approach for the Production of Reversible Disulfide Cross-linked Micelles

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. Improving drug delivery to maximize therapeutic outcomes and to reduce drug-associated side effects are some of the cornerstones of present-day nanomedicine. Nanoparticles in particular have found a wide application in cancer treatment. Nanoparticles that offer a high degree of flexibility in design, application, and production based on the tumor microenvironment are projected to be more effective with rapid translation into clinical practice. The polymeric micellar nano-carrier is a popular choice for drug delivery applications.
In this article, we describe a simple and effective protocol for synthesizing drug-loaded, disulfide cross-linked micelles based on the self-assembly of a well-defined amphiphilic linear-dendritic copolymer (telodendrimer, TD). TD is composed of polyethylene glycol (PEG) as the hydrophilic segment and a thiolated cholic acid cluster as the core-forming hydrophobic moiety attached stepwise to an amine-terminated PEG using solution-based peptide chemistry. Chemotherapy drugs, such as paclitaxel (PTX), can be loaded using a standard solvent evaporation method. The O2-mediated oxidation was previously utilized to form intra-micellar disulfide cross-links from free thiol groups on the TDs. However, the reaction was slow and not feasible for large-scale production. Recently, an H2O2-mediated oxidation method was explored as a more feasible and efficient approach, and it was 96 times faster than the previously reported method. Using this approach, 50 g of PTX-loaded, disulfide cross-linked nanoparticles have been successfully produced with narrow particle size distribution and high drug loading efficiency. The stability of the resulting micelle solution is analyzed using disrupting conditions such as co-incubation with a detergent, sodium dodecyl sulfate, with or without a reducing agent. The drug-loaded, disulfide cross-linked micelles demonstrated less hemolytic activity when compared to their non-cross-linked counterparts.

To deliver cancer drugs to tumor sites with high specificity and reduced side effects, new methods based on nanoparticles are required. Here, we describe disulfide cross-linked micelles that can be easily prepared by hydrogen peroxide-mediated oxidation and are able to dissociate efficiently under a reducing tumor environment to release payloads.

Une approche efficace et Facile pour la production de micelles réversible Disulfure réticulés

Nanomedicine is an emerging form of therapy that harnesses the unique properties of particles that are nanometers in scale for biomedical application. ...

An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this procedure amino functionalized 'lysine' and guanido functionalized 'arginine' peptoid monomers can be included within the same peptoid sequence. This procedure uses on-resin (N-(1-(4,4-dimethyl-2,6-dioxocyclohexylidene)ethyl) or Dde protection, orthogonal conditions to the Boc protection of lysine monomers. Subsequent deprotection allows an efficient on-resin guanidinylation reaction to form the arginine residues. The procedure is compatible with the commonly used submonomer method of peptoid synthesis, allowing simple peptoids to be made using common laboratory equipment and commercially available reagents. The representative synthesis, purification and characterization of two mixed peptoids is described. The evaluation of these compounds as potential anti-infectives in screening assays against Leishmania mexicana is also described. The protozoan parasite L. mexicana is a causative agent of cutaneous leishmaniasis, a neglected tropical disease that affects up to 12 million people worldwide.

A protocol to synthesize peptoids with mixed cationic functionality in the same sequence is presented (lysine- and arginine-type monomers). Subsequent testing of these compounds against Leishmania mexicana, the protozoan parasites that cause cutaneous leishmaniasis, is also described.

Une méthode efficace pour la synthèse de Peptoïdes avec Monomères / Arginine type de type Lysine mixte et de l&#39;évaluation de leur activité anti-leishmaniose

This protocol describes the manual solid-phase synthesis of linear peptoids that contain two differently functionalized cationic monomers. In this ...

Hydrolysis of a Ni-Schiff-Base Complex Using Conditions Suitable for Retention of Acid-labile Protecting Groups

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide sequences. Synthesis of some unnatural amino acids often includes the use of a precursor consisting of a Schiff-base stabilized by a nickel cation. Unnatural side-chains can be installed on an amino acid backbone found in this Schiff-base complex. The resulting unnatural amino acid can then be isolated from this complex using hydrolysis of the Schiff-base, typically by employing reflux in strongly acidic solution. These highly acidic conditions may remove acid-labile side-chain protecting groups necessary for the unnatural amino acids to be used in microwave-assisted solid-phase peptide synthesis. In this work, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff base complex. Hydrolysis conditions presented in this work are suitable for retention of acid-labile side-chain protecting groups and may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Here, we present an efficient hydrolysis and subsequent Fmoc protection of an amino acid isolated from a Ni-Schiff-base complex. Hydrolysis conditions presented here are suitable for use when retention of acid-labile side-chain protecting groups is required. This technique may be adaptable to a variety of unnatural amino acid substrates.

Hydrolysats d&#39;un complexe Ni-base de Schiff Conditions Utilisation Convient pour le maintien de groupes protecteurs d&#39;acide labile

Unnatural amino acids, amino acids containing side-chain functionalities not commonly seen in nature, are increasingly found in synthetic peptide ...

Highly Stereoselective Synthesis of 1,6-Ketoesters Mediated by Ionic Liquids: A Three-component Reaction Enabling Rapid Access to a New Class of Low Molecular Weight Gelators

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form catalytically active N-Heterocyclic Carbenes (NHCs). Here we have used ILs as precatalysts in the addition of &#945;,&#946;-unsaturated aldehydes to chalcones to form 1,6-ketoesters, incorporating an anti-diphenyl moiety in a highly stereoselective fashion. The reaction has a broad substrate scope and several functional groups and heteroaromatics can be integrated into the ketoester backbone in generally good yields with maintained stereoselectivity. The reaction protocol is robust and scalable. The starting materials are inexpensive and the products can be obtained after simple filtration, avoiding solvent-demanding chromatography. Furthermore, the IL can be recycled up to 5 times without any loss of reactivity. Moreover, the 1,6-ketoester end product is a potent gelator in several hydrocarbon based solvents. The method enables rapid access to and evaluation of a new class of low molecular weight gelators (LMWGs) from recyclable and inexpensive starting materials.

Ionic liquids (ILs) mediate fast, simple and cheap access to 1,6-ketoesters in high diastereoselectivities and good yields. The reaction protocol is robust and the 1,6-ketoesters can be obtained in gram scale after a simple filtration protocol. Moreover, the 1,6-ketoesters are potent gelators in hydrocarbon solvents.

Synthèse hautement stéréosélective de 1,6-cétoesters médiée par des liquides ioniques: une réaction à trois composantes permettant l&#39;accès rapide à une nouvelle classe de faible poids moléculaire Gelators

In organic chemistry ionic liquids (ILs) have emerged as safe and recyclable reaction solvents. In the presence of a base ILs can be deprotonated to form ...

Chimie

Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene hydrothiolation. In addition, this protocol describes the preparation of vinyl-sulfide-tethered peptides using in-solution intramolecular thiol-yne hydrothiolation between amino acids that possess alkene/alkyne side chains and cysteine residues at i, i+4 positions. Linear peptides were synthesized using a standard Fmoc-based solid-phase peptide synthesis (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation is carried out using either an intramolecular thio-ene reaction or an intermolecular thio-ene reaction, depending on the peptide length. In this research, an intramolecular thio-ene reaction is carried out in the case of shorter peptides using on-resin deprotection of the trityl groups of cysteine residues following the complete synthesis of the linear peptide. The resin is then set to UV irradiation using photoinitiator 4-methoxyacetophenone (MAP) and 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). The intermolecular thiol-ene reaction is carried out by dissolving Fmoc-Cys-OH in an N,N-dimethylformamide (DMF) solvent. This is then reacted with the peptide using the alkene-bearing residue on resin. After that, the macrolactamization is carried out using benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt), and 4-Methylmorpholine (NMM) as activation reagents on the resin. Following the macrolactamization, the peptide synthesis is continued using standard SPPS. In the case of the thio-yne hydrothiolation, the linear peptide is cleaved from the resin, dried, and subsequently dissolved in degassed DMF. This is then irradiated using UV light with photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Following the reaction, DMF is evaporated and the crude residue is precipitated and purified using high-performance liquid chromatography (HPLC). These methods could function to simplify the generation of thioether-tethered cyclic peptides due to the use of the thio-ene/yne click chemistry that possesses superior functional group tolerance and good yield. The introduction of thioether bonds into peptides takes advantage of the nucleophilic nature of cysteine residues and is redox-inert relative to disulfide bonds.

We present a protocol for the construction of thioether/vinyl sulfide-tethered helical peptides using photo-induced thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Construction de Thiol-ene/yne hélicoïdale Peptides Via photoinduit thioéther/sulfure de vinyle-attaché Hydrothiolation

Here, we describe a detailed protocol for the preparation of thioether-tethered peptides using on-resin intramolecular/intermolecular thiol-ene ...

Efficient Construction of Drug-like Bispirocyclic Scaffolds Via Organocatalytic Cycloadditions of &#945;-Imino &#947;-Lactones and Alkylidene Pyrazolones

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. Recently, we have developed an efficient organocatalytic strategy, which provides facile access to a variety of enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons. In this paper, we demonstrate a detailed protocol for the asymmetric synthesis of drug-like bispirocyclic compounds with two spirocyclic carbon centers via an organocatyltic 1,3-dipolar cycloaddition reaction. Spirocyclization synthons &#945;-imino &#947;-lactones and alkylidene pyrazolones are prepared first, which are then subjected to a cycloaddition reaction in the presence of a bifunctional squaramide organocatalyst to afford the desired bispirocycles in high yields and excellent stereoselectivities. Chiral high-performance liquid chromatography (HPLC) is carried out to determine the enantiomeric purity of the products, and the d.r. value is examined by proton nuclear magnetic resonance (1H NMR). The absolute configuration of the product is assigned according to an X-ray crystallographic analysis. This synthetic strategy allows scientists to prepare a diversity of bispirocyclic scaffolds in high yields and excellent diastereo- and enantioselectivities.

Enantiomerically enriched bispiro[&#947;-butyrolactone-pyrrolidin-4,4&#39;-pyrazolone] skeletons are asymmetrically synthesized through a simple organocatalytic 1,3-dipolar cycloaddition reaction.

Efficace Construction d’échafaudages Drug-like Bispirocyclic Via Cycloadditions rapide de α-Imino γ-Lactones et alkylidène Hydantoïdes

Bispirocyclic scaffolds are one of the important structural subunits in many natural products that exhibit diverse and attractive biological activities. ...

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very difficult and laborious to make aziridines in optically pure forms on a large scale to apply asymmetric synthesis of aza compounds. Fortunately, we successfully achieved both enantiomers (2R)- and (2S)-aziridine-2-carboxylates with the electron-donating &#945;-methylbenzyl group at the ring nitrogen as non-activated aziridines. These starting aziridines have two distinct functional groups-highly reactive three-membered ring and versatile carboxylate. They are applicable in ring-opening or ring-transformation with aziridine and in functional group transformation to others from carboxylate. Both of these enantiomers were utilized in the preparation of biologically important amino acyclic and/or aza-heterocyclic compounds in an asymmetric manner. Specifically, this report describes the first expedient asymmetric synthesis of both enantiomers of 5, 6-dihydrouracil-type marine natural products biemamide B and D as potential TGF-&#946; inhibitors. This synthesis consisted of regio- and the stereoselective ring-opening reaction of aziridine-2-carboxylate and subsequent formation of 4-aminoteterahydropyrimidine-2,4-dione. One more example in this protocol dealt a highly stereoselective Mukaiyama reaction of aziridine-2-carboxylate and silyl enol ether, following intramolecular aziridine ring-opening to provide easy and facile access to (-)-epiallo-isomuscarine.

Preparation of Enantiopure Non-Activated Aziridines and Synthesis of Biemamide B, D, and epiallo-Isomuscarine

In this study, we prepare both enantiomers of aziridine-2-carboxylate, which are used in the asymmetric synthesis of alkaloids, including biemamide B and D, and (-)-epiallo-isomuscarine.

Préparation d’énoprures aziridines non activées et synthèse de biémamide B, D et d’épiallo-isomuscarine

Nitrogen-containing heterocycle aziridines are synthetically very valuable for the preparation of azacyclic and acyclic molecules. However, it is very ...

Organocatalysis

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of organocatalysis by illustrating the proper setup of a reaction that utilizes enamine catalysis. Organocatalysis is a form of catalysis that uses substoichiometric amounts of small organic molecules to accelerate reactions. This type of catalysis is complementary to other forms of catalysis such as transition metal or biocatalysis. Transition metal catalysis involves transition metals as catalysts and biocatalysis uses enzymes as catalysts. Some advantages of organocatalysis include the low toxicity and cost of the organocatalysts in comparison to many metal catalysts. In addition, most organocatalysts are not sensitive to air and moisture, unlike metal catalysts. In contrast to enzymes found in living organisms, the small molecules that act as organocatalysts are typically easy to access. Furthermore, organocatalysis offers complementary and new reactivity not observed with other forms of catalysis.

Organocatalysis: Principles and Applications

Organocatalyse

Source: Vy M. Dong and Faben Cruz, Department of Chemistry, University of California, Irvine, CA
This experiment will demonstrate the concept of ...

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Chimie organique II

Acid Halides to Esters: Alcoholysis

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce esters. The mechanism proceeds in three steps:
<ol>
	<li>First, the alcohol acts as a nucleophile and attacks the acyl carbon to form a tetrahedral intermediate.</li>
	<li>Next, the carbonyl re-forms with the loss of a chloride ion.</li>
	<li>Lastly, the positively charged intermediate loses a proton to give an ester as the final product along with H3O+, making HCl an overall byproduct of the reaction.</li>
</ol>
<img alt="Organic reaction mechanism diagram, nucleophilic substitution process displaying molecular transition." src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_1.svg" style="text-align: center; height: 200px;" data-altupdatedat="1747908711000" data-alt="Figure1">
Pyridine is used as a base to neutralize the acidic reaction mixture.
Alcoholysis of sulfonyl chlorides follows a similar pattern and forms sulfonic acid esters.
<img alt="Chemical reaction diagram; synthesis process; reaction of acyl chloride with alcohol; ester formation." src="/files/ftp_upload/12362/12362_PT_Figure_2.svg" style="text-align: center; height: 75px;" data-altupdatedat="1747908711000" data-alt="Figure2">

Halogénures acides en esters : alcoolyse

Alcoholysis is a nucleophilic acyl substitution reaction in which an alcohol functions as a nucleophile. Acid halides react with alcohol to produce ...

Réactions de Cascade enzymatique pour la synthèse des aminoalcools chiraux de L-lysine

Résumé

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