Name: rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development
Uploaded: 2018-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development at JoVE.com

Nous sommes redevables à nos assistants techniques : Bröder U. et H. Shkarlet, qui nous ont aidé au cours de procédures expérimentales. Ce travail a été financé en partie par des subventions de l’UE (UniVax, contrat n° 601738 et TRANSVAC2, contrat n° 730964) et une subvention de l’Association Helmholtz (HAI-IDR). Les sources de financement n’a pas influencé la recherche conception, génération de manuscrit ou décision de le soumettre pour publication.

Toutes les souris utilisées dans cette étude proviennent de l’arrière-plan de C57BL/6. Tous les animaux se trouvaient dans des conditions exempts de micro-organismes pathogènes. Toutes les expériences ont été réalisés selon la normative de la loi allemande de protection animale (TierSchG BGBl. J’AI S 1105 ; 25.05.1998) et ont été approuvés par le Comité de Basse Saxe sur l’éthique de l’expérimentation animale et de l’office de l’État (Basse Saxe État Office de la Protection des consommateurs et la sécurité alimentaire), sous le numéro de permis 33,4-42502-04-13/1281 et 162280.
1. CFSE coloration des OT-j’ai T cellules et transfert adoptif
NOTE : OT-je souris sont des animaux transgéniquement générés qui expriment un récepteur des cellules T (TCR) avec α fixe et chaînes β qui ensemble reconnaissent le peptide immuno-dominante des ovules, SIINFEKL10,11. En conséquence, ces souris ont un nombre considérablement élevé de CD8 spécifiques SIINFEKL+ T cells (97 %)12 par rapport aux souris normales ou ovules vaccinés (≤ 1 %)13.
<ol><li>Isolement des CD8 traçables les cellules de+ T de OT-j’ai des souris exprimant l’allèle de lymphocytes T spécifiques Thy1un (Thy1.1) :<ol>
<li>Euthanasier OT âgés de 6 à 9 semaines-j’ai souris par inhalation de CO2 suivie de dislocation cervicale14. Disséquer la rate et les principaux ganglions lymphatiques (paires inguinales, axillaires et col de l’utérus) en coupant la peau avec des ciseaux chirurgicaux, détacher la peau du corps avec l’aide de pinces chirurgicales et forceps et placez-les dans des boîtes de Pétri (60 x 15 mm) contenant chacune un 100µm pore maille coupe libération de meulage et cellule de tissus.</li>
		<li>Maintenir Pétri (chacun avec un maillage tasse) dans 3 à 5 mL de milieu RPMI complet (RPMI 1640, 10 % v/v FCS, 100 U/mL de pénicilline, 50 µg/mL de streptomycine) gardé sur glace.</li>
		<li>Écraser les organes à l’aide d’un piston de la seringue ou un instrument stérile similaire (la découpe préalable n’est pas nécessaire) et recueillir la suspension monocellulaire qui en résulte dans des tubes à centrifuger 15 mL.</li>
		<li>Centrifuger la suspension de cellules à 300 g pendant 10 min à 4 ° C. Jeter le surnageant. Laver les cellules dans 10 mL de PBS froid par centrifugation et lyse des érythrocytes de la rate par re-suspension du culot dans 1 mL/rate de chlorure d’ammonium buffer (tampon ACK, disponible dans le commerce). Incuber les cellules pendant 1,5 min sur glace et par la suite laver les cellules avec 10 mL de PBS froid par centrifugation (comme avant).</li>
		<li>Resuspendre le culot dans le même tube dans 1 mL de PBS (pH 7,2) contenant 5 % sérum de veau fœtal pour isolation magnétique.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour une isolation magnétique, procéder à la sélection négative des CD8+ T des cellules à l’aide d’un kit d’isolation magnétique selon les instructions du fabricant ou la publication des protocoles15.</li>
	<li>Pour effectuer CFSE coloration, tout d’abord compter le nombre de CD8+ T cellules obtenues à partir des OT-je souris à l’aide d’un compteur de cellules automatisées (compteur de particules). Tache 1-5 x 107 cellules/mL dans un volume de 1 à 5 mL avec 5 µM CFSE dans du PBS pendant 7 min à 37 ° C, abri de la lumière dans un tube falcon de 15 ml.</li>
	<li>Étancher la CFSE coloration en ajoutant le même volume (1:1) de sérum de veau fœtal aux cellules et les incuber supplémentaire 7 min à 37 ° C, abri de la lumière. Laver les cellules avec 10 mL de PBS.</li>
	<li>Compter les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisées. Définir le nombre de cellules à 3-5 x 107 cellules/mL de PBS afin d’injecter 3 à 5 x 106 cellules/souris dans 100 µL par voie intraveineuse (i.v.) via la veine caudale.</li>
	<li>Pour effectuer des injections de veine de queue, immobiliser les souris dans retardateurs appropriés. Réchauffer le dos et la queue des souris pour être injecté à l’aide d’une lampe de lumière rouge, placée entre 20 à 25 cm des souris pendant 1-3 min afin de permettre une vasodilatation de la queue veineuse. Remarque : Cela contribue à la détection de veine de facilité et de l’administration de la suspension cellulaire.</li>
	<li>S’assurer que (avec la main placée entre les souris et la lampe) qu’il n’est pas trop chaud pour les souris et lorsque les veines de queue sont clairement visibles, procéder à l’injection. Injecter les cellules dans la veine de queue latéral ou dorsal, à l’aide d’une seringue de 1mL avec une aiguille de calibre 2516.</li>
</ol>2. vaccination (Endo-free OVA +/-Adjuvant)
<ol><li>Placez les souris transplantées avec OT-j’ai des cellules (étape 1.7, Figure 1) dans une chambre d’anesthésie et d’administrer isoflurane en oxygène par une anesthésie machine14.</li>
	<li>Lorsque la souris est complètement endormie sous anesthésie, sortez-le de la chambre et raser la fourrure de la souris sur la zone au-dessus du gluteus superficialis (latéral bas du dos) à l’aide d’une machine de coupe de cheveux électriques, afin d’effectuer une injection propre avec une bonne vue de la zone d’application.</li>
	<li>Injecter 50 µL du vaccin, l.c. dans la zone rasée à l’aide d’une aiguille de calibre 25.</li>
</ol>3. isolement des Lymphocytes et de coloration pour l’analyse en cytométrie en flux
<ol><li>Isolement des lymphocytes et des splénocytes<ol>
<li>Euthanasier les souris vaccinées par inhalation de2 CO suivie par dislocation cervicale.</li>
		<li>Extraire le drainants et lointains des ganglions lymphatiques et la rate et les placer dans séparé de Pétri contenant 100 µm pore maille tasses libération de meulage et cellule de tissus. Suivez les étapes 1.1.2 par 1.1.3.</li>
		<li>Décanter le liquide surnageant après centrifugation et remettre en suspension les granules cellulaires dans le même volume de vestige PBS (env. 100 µL).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Coloration pour l’analyse en cytométrie en flux<ol>
<li>Dans un tube à centrifuger de 15 mL, préparez un mélange maître contenant les anticorps coloration dans les concentrations décrites dans le tableau 1, produisant ainsi un 2 x mélange concentré de coloration. Préparer un volume suffisant de mélange maître d’avoir 100 µL par échantillon. Mélanger les cellules et master mix 1:1 et il incuber à 4° C pendant 30 min. Remarque : Le volume final de coloration par échantillon devrait être de 200 µL (100 µL de cellules pellet + 100 µL du mélange maître d’anticorps).</li>
		<li>Laver les cellules deux fois par centrifugation, tel que décrit en 1.1.3, ajouter 10 mL de PBS, deux fois.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules colorées en 0,5 à 1 mL de PBS pour l’acquisition et la cession de la suspension aux tubes cytomètre de flux. Toujours garder les échantillons sur la glace et abri de la lumière.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. cytométrie en flux
<ol><li>Préfiltre toujours les échantillons de cellules à l’aide de filtres de 70 à 100 µm.</li>
	<li>Préparer les contrôles de compensation coloration unique pour les fluorophores détaillés dans le tableau 1 (perles ou cellules). Remarque : Une indemnité devrait être effectuée dans cytomètre ou analyse logiciel17,18,19 et appliquée à tous les échantillons.</li>
	<li>Suivre la stratégie de blocage illustrée au tableau 2. En bref, les populations de porte en hauteur avant dispersion vs zone de dispersion vers l’avant (Figure 2 a), puis diffusion latérale large vs zone de dispersion latérale (SSA, Figure 2 b) afin d’exclure les doublets.</li>
	<li>Porte la population de la Figure 2 b en traçant BV 650 (auto-fluorescence) vs FITC (CFSE) afin de discriminer le vrai CFSE teinté de cellules provenant des cellules auto-fluorescent hautes. Inclure des perles ou cellules colorées avec l’anticorps conjugué à BV 650 dans les contrôles de compensation. Ce terrain BV 650 vs FITC (Figure 2) est utilisé pour la porte de l’ancien testament-j’ai CFSE teinté de cellules.</li>
	<li>Porte la population de la Figure 2 C pour Pe-Cy7 (Thy1.1 - CD90.1-) vs APC (CD8) afin de distinguer les cellules provenant de donneurs vs souris destinataires. Remarque : Les cellules dérivées de OT-je souris de donateurs sont Thy1.1+ (CD90.1), tandis que les cellules d’origine souris (C57BL/6, destinataires) WT sont Thy1.2+ (CD90.2) (Figure 2D). Certains laboratoires ont OT-je souris dans un contexte de Thy1.2 et WT (C57BL/6) dans un Thy1.1. Dans ce cas vous devez utiliser un anticorps contre Thy1.2 pour l’OT-I de cellules Gate.</li>
	<li>Re-gate CD8 les cellules de+ de Thy1.1+ population en traçant il sur un portail comprenant 450 BV (CD4) vs APC (CD8) (Figure 2E).</li>
	<li>Afficher la population Figure 2E contrôlée à l’aide d’un affichage de l’histogramme de la CD8+ cellules montrant CFSE (FITC, 530/15 canaux - bleu laser-), porte la population constituée en incluant des intensités de 102 jusqu’au niveau où les populations de contrôle indivis sont (intensités ~ 105, selon l’efficacité de la coloration de CFSE et le réglage de la tension sur le cytomètre en flux) (Figure 2F).</li>
	<li>Faire une porte supplémentaire (ne pas affiché à la figure 2) traçage marqueur FITC vs L/D (450/20 canaux, laser UV) afin d’évaluer les cellules mortes en parallèle à l’évaluation de la prolifération.</li>
	<li>Acquérir au moins 5000 manifestations pour les commandes de compensation et 10,000 (porte E, Figure 2) des échantillons à un cytomètre en flux. Exécutez le cytomètre à débit faible ou moyenne (ne pas dépasser les vitesses d’écoulement de 20.000 événements/s).</li>
</ol>

<ol>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Idéalement, les vaccins modernes sont composedof antigène purifié et adjuvants, avec l’ajout éventuel d’un système de livraison comme les liposomes, les Pseudo-particules virales, les nanoparticules ou les vecteurs vivants. Un aspect clé lors de la conception d’un vaccin consiste à choisir le bon adjuvant selon les besoins cliniques. Partie du champ d’application pourrait impliquer favorisant un humorale vs réponse immunitaire cellulaire (ou les deux), l’élection d’un local par rapport à une répons...

Les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) induisant des vaccins sont les principales interventions thérapeutiques qui ont été développées pour lutter contre certains types de cancer1. CTL sont également importants pour les vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires2. En outre, CTL sont l’un de ses mécanismes de défense immunitaires peu fonctionnellement actifs dans les populations à risque tels que les nouveaux-nés3,4 dont dépendent aussi de CTL pour lutter contre le début vie infections5. À cet égard, les vaccins contre le Virus Respiratoire Syncytial (RSV) qui ont été élaborés avec un adjuvant qui ne pas permis d’obtenir les réponses CTL (alun) a abouti à un échec complet du vaccin conduisant à des complications graves sur les infections chez les nourrissons de6. Ces effets négatifs de la vaccination peuvent être renversés par un CD8+ réaction de lymphocytes T7. Nous avons démontré précédemment que les principales cytokines (interférons de type I) provoquées par certains stimulateur d’agonistes de gènes (STING) interféron sont essentiels pour les réponses CTL générés par ces adjuvants8, en partie par la mesure de la prolifération des OT-I T cellules après vaccination et en utilisant ces résultats comme une mesure de CTL induisant des capacités fait observer dans l’extension de vaccination annexes9. La mesure de la prolifération des OT-j’ai CD8+ T des cellules dans une souris destinataire C57BL/6 de type sauvage (WT) de colorant de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE) dilution est une estimation fiable de la capacité de l’adjuvant du vaccin à générer Croix-amorçage de SIINFEKL, (le peptide immuno-dominante de l’ovalbumine, ovules). Les variations de cette technique sont largement utilisées pour l’évaluation de la prolifération des OT-j’ai CD8+ et OT-II CD4+ T des cellules. Par exemple, il a été utilisé en l’absence de certaines cytokines (souris KO) ou pour mesurer l’efficacité du vaccin après rappel antigène chez les animaux de WT. Nous mis au point un protocole court (4 jours experiment) dans lequel après transfert passif des OT CFSE teinté-j’ai CD8+ T cells, une vaccination sous-cutanée de (c.s.) consistant en une seule dose de 50 µg d’ovules exempte d’endotoxine additionnée d’adjuvants de test est administré (Figure 1). Le suivi des résultats 48 heures après la vaccination fournit une preuve fiable de la capacité de l’adjuvant pour générer des réponses CTL. Par cette stratégie, il est possible d’évaluer la puissance de la réponse immunitaire locale dans le ganglion lymphatique drainant après vaccination ainsi que l’ampleur de la réponse en mesurant l’activité CTL dans la rate (ou d’éloignés des ganglions).

<table><tbody><tr><td>BD LSR Fortessa Cell Analyzer</td><td>BD</td><td>Special Order</td><td>Flow Cytometer</td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Molecular Probes</td><td>C34554</td><td>Proliferation Dye</td></tr><tr><td>MojoSort Mouse CD8 T Cell Isolation Kit</td><td>Biolegend</td><td>480007</td><td>Magnetic Isolation Beads and antibodies for negative selection of untouched CD8 T cells.</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation</td><td>Molecular Probes</td><td>L23105</td><td>Dead Cell Marker</td></tr><tr><td>CD90.1 (Thy-1.1) Monoclonal Antibody (HIS51), PE-Cyanine7</td><td>eBioscience</td><td>25-0900-82</td><td>antibody</td></tr><tr><td>APC anti-mouse CD8a Antibody</td><td>BioLegend</td><td>100712</td><td>antibody</td></tr><tr><td>BV421 Rat Anti-Mouse CD4</td><td>BD</td><td>740007</td><td>antibody</td></tr><tr><td>Z2 coulter Particle count and Size Analyzer</td><td>Beckman Coulter</td><td>9914591DA</td><td>Cell counter. Z2 Automated particle/cell counter</td></tr><tr><td>EndoGrade Ovalbumin (10 mg)</td><td>Hyglos(Germany)</td><td>321000</td><td>Ovalbumin endotoxin free tested.</td></tr><tr><td>Cell Strainer 100&amp;micro;m nylon</td><td>Corning</td><td>352360</td><td>Cell strainer (100 &amp;micro;m pore mesh cups).</td></tr><tr><td>Sample Vials</td><td>Beckman Coulter</td><td>899366014</td><td>Sample vials for Z2 automated counter</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice (CD90.2)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Company is now Envigo</td></tr><tr><td>OT-I (C57BL/6 background, CD90.1)</td><td>Harlan (Rossdorf, Germany)</td><td></td><td>Inbreed at our animal facility. Company from where adquired is now Envigo</td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>14-959-5</td><td>Corning Falcon Round-Bottom Polystyrene Tubes</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL tubes</td><td>Fischer (Corning)</td><td>05-527-90</td><td>Falcon 15mL Conical Centrifuge Tubes</td></tr><tr><td>PBS (500 mL)</td><td>Fischer (Gibco)</td><td>20-012-027</td><td>Gibco PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2</td></tr><tr><td>Red lamp (heating lamp)</td><td>Dirk Rossmann GmbH (Germany)</td><td>405096</td><td>Heating infrred lamp (100 wats)</td></tr><tr><td>IsoFlo (Isoflurane)</td><td>Abbott Laboratories (USA)</td><td>5260.04-05.</td><td>Isoflurane anesthesic (250 mL flask).</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Tabletop Anesthesia Machine/Mobile Anesthesia Machine with CO2 Absorber&lt;/strong&gt;</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000PK</td><td>Isoflurane anesthesia machine.</td></tr><tr><td>RPMI 1640 medium</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>11-875-093</td><td>Base medium with Glutamine (500 mL)</td></tr><tr><td>Pen-Strept antibiotic solution (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>15-140-148</td><td>Gibco Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td></tr><tr><td>Fetal Bobine Serum (Gibco)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>10082147</td><td>Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, US origin</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer (100 ml)</td><td>Gibco (distributed by ThermoFischer)</td><td>A1049201</td><td>Amonium Chloride Potasium (ACK) Whole Blood Lysis Buffer, suitable for erytrocyte lysis in spleen suspensions also</td></tr><tr><td>Plastic Petri Dishes</td><td>Nunc (distributed by ThermoFischer)</td><td>150340</td><td>60 x 15mm Plastic Petri Dish, Non-treated</td></tr><tr><td>Cell Clump Filter</td><td>CellTrics (Sysmex)</td><td>04-004-2317</td><td>CellTrics&amp;reg; 50 &amp;mu;m, sterile</td></tr></tbody></table>

rapid in vivo assessment of adjuvant's cytotoxic t lymphocytes generation capabilities for vaccine development

L’évaluation des vaccins sous-unité moderne révèle que la production d’anticorps neutralisants est important mais insuffisant pour le choix de l’adjuvant. Par conséquent, les adjuvants grâce aux fonctions cellulaires et humorales immuno-stimulant qui sont en mesure de promouvoir les réponses (CTL) les lymphocytes T cytotoxiques sont urgent. Ainsi, la surveillance fidèle des candidats adjuvant qui induisent des croix-amorçage et ensuite améliorent la génération de CTL représente une étape cruciale dans le développement de vaccins. Ici, nous présentons une demande pour une méthode qui utilise SIINFEKL-spécifique (OT-je) les cellules T pour surveiller la présentation croisée du modèle antigène ovalbumine (OVA) in vivo en présence de candidats différents adjuvants. Cette méthode représente un test rapide pour sélectionner les adjuvants avec les meilleures capacités de croix-amorçage. La prolifération des CD8+ T cellules est la plus précieuse indication de croix-amorçage et il est également considéré comme un corrélat de la présentation croisée induite par le traitement adjuvant. Cette fonctionnalité peut être évaluée dans les différents organes du système immunitaire comme les ganglions lymphatiques et la rate. L’étendue de la génération de CTL peut être également surveillée, ce qui donne des idées sur la nature d’un local (drainage ganglionnaire principalement) ou une réponse systémique (ganglions éloignées et/ou la rate). Plus loin, cette technique permet plusieurs modifications pour tester des médicaments qui peuvent inhiber les voies spécifiques de présentation croisée et offre également la possibilité d’être utilisé dans différentes souches de souris classiques et génétiquement modifiées. En résumé, l’application que nous vous présentons ici sera utile pour les laboratoires de vaccin dans l’industrie ou des universités qui développent ou modifient des adjuvants chimiques pour la recherche sur les vaccins et le développement.

Afin de tester les traitements à l’aide d’une combinaison différente des adjuvants (ADJ1 et ADJ2), nous avons évalué la capacité de production de CTL en mesurant la prolifération des OT Moutschen transféré-j’ai CD8+ T des cellules par cytométrie en flux (Figure 2). Pour ce faire, nous avons teinté précédemment cellules isolées du drainage des ganglions et rate (tableau 1). En mesurant la prolifération des CD8<su...

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Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

Nous présentons ici une demande d’une norme technique immunologique (CFSE teinté OT-j’ai la prolifération) permettent de contrôler rapidement induite par le traitement adjuvant des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) génération in vivo. Cette estimation rapide des capacités CTL est utile pour le développement de vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires, mais aussi des vaccins thérapeutiques contre le cancer.

Évaluation rapide In Vivo des fonctions de génération de l’Adjuvant T cytotoxique Lymphocytes pour le développement de vaccins

The assessment of modern sub-unit vaccines reveals that the generation of neutralizing antibodies is important but not sufficient for adjuvant selection. ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

Rapid In Vivo Assessment of Adjuvant's Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development

8.6K vues.  Helmholtz Centre for Infection Research. Nous présentons ici une demande d’une norme technique immunologique (CFSE teinté OT-j’ai la prolifération) permettent de contrôler rapidement induite par le traitement adjuvant des lymphocytes T cytotoxiques (CTL) génération in vivo. Cette estimation rapide des capacités CTL est utile pour le développement de vaccins prophylactiques contre les pathogènes intracellulaires, mais aussi des vaccins thérapeutiques contre le cancer.

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In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

Essai in vitro pour évaluer l&#39;impact de IMMUNOREGULATEURS voies sur T CD4 cellulaire effecteur Fonction spécifique au VIH

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

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Immunologie et infection

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of immunotherapies. Here we describe the use of fluorescent target array (FTA) technology, which utilizes vital dyes such as carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), violet laser excitable dyes (CellTrace Violet: CTV) and red laser excitable dyes (Cell Proliferation Dye eFluor 670: CPD) to combinatorially label mouse lymphocytes into &#62;250 discernable fluorescent cell clusters. Cell clusters within these FTAs can be pulsed with major histocompatibility (MHC) class-I and MHC class-II binding peptides and thereby act as target cells for CD8+ and CD4+ T cells, respectively. These FTA cells remain viable and fully functional, and can therefore be administered into mice to allow assessment of CD8+ T cell-mediated killing of FTA target cells and CD4+ T cell-meditated help of FTA B cell target cells in real time in vivo by flow cytometry. Since &#62;250 target cells can be assessed at once, the technique allows the monitoring of T cell responses against several antigen epitopes at several concentrations and in multiple replicates. As such, the technique can measure T cell responses at both a quantitative (e.g.&#160;the cumulative magnitude of the response) and a qualitative (e.g.&#160;functional avidity and epitope-cross reactivity of the response) level. Herein, we describe how these FTAs are constructed and give an example of how they can be applied to assess T cell responses induced by a recombinant pox virus vaccine.

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The ability to monitor T cell responses in detail in vivo is important for the development of our understanding of the immune response. Here we describe the use of fluorescent target arrays (FTAs) in an in vivo T cell assay that assesses &#62;250 parameters simultaneously by flow cytometry.

L&#39;utilisation des tableaux cibles fluorescentes pour l&#39;évaluation des réponses des cellules T<em&gt; In vivo</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Whole-animal Imaging and Flow Cytometric Techniques for Analysis of Antigen-specific CD8+ T Cell Responses after Nanoparticle Vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various nanoparticle systems have been engineered to mimic features of pathogens to improve antigen delivery to draining lymph nodes and increase antigen uptake by antigen-presenting cells, leading to new vaccine formulations optimized for induction of antigen-specific CD8+ T cell responses. In this article, we describe the synthesis of a &#8220;pathogen-mimicking&#8221; nanoparticle system, termed interbilayer-crosslinked multilamellar vesicles (ICMVs) that can serve as an effective vaccine carrier for co-delivery of subunit antigens and immunostimulatory agents and elicitation of potent cytotoxic CD8+ T lymphocyte (CTL) responses. We describe methods for characterizing hydrodynamic size and surface charge of vaccine nanoparticles with dynamic light scattering and zeta potential analyzer and present a confocal microscopy-based procedure to analyze nanoparticle-mediated antigen delivery to draining lymph nodes. Furthermore, we show a new bioluminescence whole-animal imaging technique utilizing adoptive transfer of luciferase-expressing, antigen-specific CD8+ T cells into recipient mice, followed by nanoparticle vaccination, which permits non-invasive interrogation of expansion and trafficking patterns of CTLs in real time. We also describe tetramer staining and flow cytometric analysis of peripheral blood mononuclear cells for longitudinal quantification of endogenous T cell responses in mice vaccinated with nanoparticles.

We describe whole-animal imaging and flow cytometry-based techniques for monitoring expansion of antigen-specific CD8+ T cells in response to immunization with nanoparticles in a murine model of vaccination.

Imagerie animal entier et cytométrie de flux techniques pour T CD8 + Analyse des réponses spécifiques de l&#39;antigène de cellule après nanoparticules vaccination

Traditional vaccine adjuvants, such as alum, elicit suboptimal CD8+ T cell responses. To address this major challenge in vaccine development, various ...

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol specifically intended to measure antigen-specific killing without an infection. This protocol is designed and describes methods to overcome these limitations by allowing for the detection of antigen-specific killing of a target cell by CD8+ T cells in vivo. This is accomplished by merging a vaccination model with a traditional CFSE-labeled target killing assay. This combination allows the researcher to assess the antigen-specific CTL potential directly and quickly as the assay is not dependent upon tumor growth or infection. In addition, the readout is based on flow cytometry and so should be readily accessible to most researchers. The major limitation of the study is identifying the timeline in vivo that is appropriate to the hypothesis being tested. Variations in antigen strength and mutations in the T cells that may result in differential cytolytic function need to be carefully assessed to determine the optimal time for cell harvest and assessment. The appropriate concentration of peptide for vaccination has been optimized for hgp10025-33 and OVA257-264, but further validation would be needed for other peptides that may be more appropriate to a given study. Overall, this protocol allows a quick assessment of killing function in vivo and can be adapted to any given antigen.

In Vivo Assay for Detection of Antigen-specific T-cell Cytolytic Function Using a Vaccination Model

The goal of this protocol is to allow for detection of in vivo antigen-specific killing of a target cell in a murine model.

In Vivo Test pour la détection de cellules T spécifiques de l’antigène fonction cytolytique en utilisant un modèle de Vaccination

Current methodologies for antigen-specific killing are limited to in vitro use or utilized in infectious disease models. However, there is not a protocol ...

Immunostimulatory Agent Evaluation: Lymphoid Tissue Extraction and Injection Route-Dependent Dendritic Cell Activation

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we investigated immunological effects of a novel lipid-DNA immunostimulant in nanoparticle form from different administration routes in the mouse: oral, intranasal, subcutaneous, footpad, intraperitoneal, and intravenous. These injections will directly influence the immune response, and harvesting lymphatic tissues and analysis of dendritic cell (DC) activation in the tissues are crucial parts of these evaluations. The extraction of mediastinal lymph nodes (mLNs) is important but quite complex because of the size and location of this organ. A stepwise procedure for harvesting the inguinal lymph node (iLN), mLN, and spleen and analyzing DC activation by flow cytometry is described.

Experimental procedures for the subsequent extraction of lymphatic tissues to test lymphoid dendritic cell activation are described after treatment of an immunostimulating nanomaterial.

Immunostimulantes Agent Evaluation : Lymphoïde tissu Extraction et Injection Route-dépendante des cellules dendritiques Activation

For evaluation of a new therapeutic agent for immunotherapy or vaccination, analysis of immune cell activation in lymphatic tissues is essential. Here, we ...

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte (CTL) responses elicited against tumor- and pathogen-derived peptides. They offer several advantages over traditional killing assays. First, they permit the monitoring of CTL-mediated cytotoxicity within architecturally intact secondary lymphoid organs, typically in the spleen. Second, they allow for mechanistic studies during the priming, effector and recall phases of CTL responses. Third, they provide useful platforms for vaccine/drug efficacy testing in a truly in vivo setting. Here, we provide an optimized protocol for the examination of concomitant CTL responses against more than one peptide epitope of a model tumor antigen (Ag), namely, simian virus 40 (SV40)-encoded large T Ag (T Ag). Like most other clinically relevant tumor proteins, T Ag harbors many potentially immunogenic peptides. However, only four such peptides induce detectable CTL responses in C57BL/6 mice. These responses are consistently arranged in a hierarchical order based on their magnitude, which forms the basis for TCD8 &#8220;immunodominance&#8221; in this powerful system. Accordingly, the bulk of the T Ag-specific TCD8 response is focused against a single immunodominant epitope while the other three epitopes are recognized and responded to only weakly. Immunodominance compromises the breadth of antitumor TCD8 responses and is, as such, considered by many as an impediment to successful vaccination against cancer. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular factors and mechanisms that dictate or shape TCD8 immunodominance. The protocol we describe here is tailored to the investigation of this phenomenon in the T Ag immunization model, but can be readily modified and extended to similar studies in other tumor models. We provide examples of how the impact of experimental immunotherapeutic interventions can be measured using in vivo cytotoxicity assays.

Tailoring In Vivo Cytotoxicity Assays to Study Immunodominance in Tumor-specific CD8+ T Cell Responses

We describe here a flow cytometry-based in vivo killing assay that enables examination of immunodominance in cytotoxic T lymphocyte (CTL) responses to a model tumor antigen. We provide examples of how this elegant assay may be employed for mechanistic studies and for drug efficacy testing.

Adaptation des dosages de cytotoxicité in vivo à l’étude de l’immunodominance dans des réponses cellulaires spécifiques à la tumeur et aux lymphocytes T

Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-based in vivo cytotoxicity assays enable sensitive and accurate quantitation of CD8+ cytolytic T lymphocyte ...

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; in particular, some MHC I-restricted epitopes can induce effective cytotoxic T lymphocyte activity to clear tumor cells. Additionally, nasal administration is an effective and safe delivery technique for tumor vaccines due to its convenience and improved patient compliance. However, epitope peptides are unsuitable for nasal delivery because of their poor immunogenicity and lack of delivery efficiency. Nanoemulsions (NEs) are thermodynamically stable systems that can be loaded with antigens and delivered directly to the nasal mucosal surface. Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) is the core pentapeptide of laminin, an integrin-binding peptide expressed by human respiratory epithelial cells. In this study, an intranasal self-assembled epitope peptide NE tumor vaccine containing the synthetic peptide IKVAV-OVA257-264 (I-OVA) was prepared by a low-energy emulsification method. The combination of IKVAV and OVA257-264 can enhance antigen uptake by nasal mucosal epithelial cells. Here, we establish a protocol to study the physicochemical characteristics by transmission electron microscopy (TEM), atomic force microscopy (AFM), and dynamic light scattering (DLS); stability in the presence of mucin protein; toxicity by examining the cell viability of BEAS-2B cells and the nasal and lung tissues of C57BL/6 mice; cellular uptake by confocal laser scanning microscopy (CLSM); release profiles by imaging small animals in vivo; and the protective and therapeutic effect of the vaccine by using an E.G7 tumor-bearing model. We anticipate that the protocol will provide technical and theoretical clues for the future development of novel T cell epitope peptide mucosal vaccines.

Preparation, Characteristics, Toxicity, and Efficacy Evaluation of the Nasal Self-Assembled Nanoemulsion Tumor Vaccine In Vitro and In Vivo

Here, we present detailed methods for the preparation and evaluation of the nasal self-assembled nanoemulsion tumor vaccine in vitro and in vivo.

Préparation, caractéristiques, toxicité et évaluation de l’efficacité du vaccin nasal auto-assemblé contre les tumeurs en nanoémulsion in vitro et in vivo

Epitope peptides have attracted widespread attention in the field of tumor vaccines because of their safety, high specificity, and convenient production; ...

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated with antigens. Ophiopogonin D (OP-D), a purified component extracted from the plant Ophiopogon japonicus, has been found to be useful as a vaccine adjuvant. The problems of the low solubility and toxicity of OP-D can be effectively overcome by using a low-energy emulsification method to prepare nanoemulsion ophiopogonin D (NOD). In this article, a series of in vitro protocols for cellular activity evaluation are examined. The cytotoxic effects of L929 were determined using a cell counting kit-8 assay. Then, the secreted cytokine levels and corresponding immune cell numbers after the stimulation and culture of splenocytes from immunized mice were detected by ELISA and ELISpot methods. In addition, the antigen uptake ability in bone marrow-derived dendritic cells (BMDCs), which were isolated from C57BL/6 mice and matured after incubation with GM-CSF plus IL-4, was observed by laser scanning confocal microscopy (CLSM). Importantly, macrophage activation was confirmed by measuring the levels of IL-1&#946;, IL-6, and tumor necrosis factor alpha (TNF-&#945;) cytokines by ELISA kits after coculturing peritoneal macrophages (PMs) from blank mice with the adjuvant for 24 h. It is hoped that this protocol will provide other researchers with direct and effective experimental approaches to evaluate the cellular response efficacies of novel vaccine adjuvants.

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

The protocol presents detailed methods for evaluating whether the nanoemulsion ophiopogonin D adjuvant promotes effective cellular immune responses.

In vitro Évaluation de l’activité cellulaire de l’adjuvant du vaccin à nanoémulsion ophiopogonine D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Determination of Vaccine Immunogenicity Using Bovine Monocyte-Derived Dendritic Cells

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and play a unique role within the immune system by linking the innate and adaptive immune responses. These cells can phagocytize and then present captured antigens to effector immune cells, triggering a diverse range of immune responses. This paper demonstrates a standardized method for the in vitro generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) isolated from cattle peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and their application in evaluating vaccine immunogenicity.
Magnetic-based cell sorting was used to isolate CD14+ monocytes from PBMCs, and the supplementation of complete culture medium with interleukin (IL)-4 and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) was used to induce the differentiation of CD14+ monocytes into naive MoDCs. The generation of immature MoDCs was confirmed by detecting the expression of major histocompatibility complex II (MHC II), CD86, and CD40 cell surface markers. A commercially available rabies vaccine was used to pulse the immature MoDCs, which were subsequently co-cultured with naive lymphocytes.
The flow cytometry analysis of the antigen-pulsed MoDCs and lymphocyte co-culture revealed the stimulation of T lymphocyte proliferation through the expression of Ki-67, CD25, CD4, and CD8 markers. The analysis of the mRNA expression of IFN-&#947; and Ki-67, using quantitative PCR, showed that the MoDCs could induce the antigen-specific priming of lymphocytes in this in vitro co-culture system. Furthermore, IFN-&#947; secretion assessed using ELISA showed a significantly higher titer (**p &#60; 0.01) in the rabies vaccine-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture than in the non-antigen-pulsed MoDC-lymphocyte co-culture. These results show the validity of this in vitro MoDC assay to measure vaccine immunogenicity, meaning this assay can be used to identify potential vaccine candidates for cattle before proceeding with in vivo trials, as well as in vaccine immunogenicity assessments of commercial vaccines.

The methodology describes the generation of bovine monocyte-derived dendritic cells (MoDCs) and their application for the in vitro evaluation of antigenic candidates during the development of potential veterinary vaccines in cattle.

Détermination de l’immunogénicité du vaccin à l’aide de cellules dendritiques dérivées de monocytes bovins

Dendritic cells (DCs) are the most potent antigen-presenting cells (APCs) within the immune system. They patrol the organism looking for pathogens and ...

An Immunological Technique to Monitor Adjuvant-Mediated Cytotoxic T Lymphocyte Generation

Source: Lirussi, D. et al., <a href="https://app.jove.com/v/57401">Rapid In Vivo&#160;Assessment of Adjuvant&#39;s Cytotoxic T Lymphocytes Generation Capabilities for Vaccine Development.</a> J. Vis. Exp. (2018)
The video demonstrates an immunological method to monitor in vivo adjuvant-induced cytotoxic T lymphocyte or CTL production. A mouse is pre-injected with genetically engineered, proliferative dye-stained donor CD8+ T lymphocytes. Subcutaneous injection of ovalbumin with adjuvants generates cytotoxic CD8+ T lymphocytes that are identified post-harvesting through immunostaining and flow cytometry.

Une technique immunologique pour surveiller la génération de lymphocytes T cytotoxiques médiés par adjuvant

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
All mice ...

Évaluation rapide In Vivo des fonctions de génération de l’Adjuvant T cytotoxique Lymphocytes pour le développement de vaccins

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