Name: antimicrobial characterization of advanced materials for bioengineering applications
Uploaded: 2018-08-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 8 s
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Les auteurs aimerait remercier la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir pour le soutien financier pour ce travail à travers le 001UCV-231-2017 et 2018-231-001UCV subventions.

1. préparation de l’échantillon
<ol><li>Couper les échantillons de matériaux en disques de diamètre 10 mm avec un diamètre de 10 mm poinçon cylindrique. Remarque : Matériaux fragiles peuvent être ramollies dans les solvants qui conviennent stériles pendant 1 h et ensuite coupés en disques. Par exemple, les matériaux hydrophiles comme alginate de zinc ont été analysés selon ce protocole et ont été imbibés dans l’eau autoclavé avant de les couper afin d’éviter la rupture de l’échantillon. Toutefois, autres matériaux hydrophobes tels que les poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) n’ont pas besoin n’importe quel genre de gonflement précédent afin d’être correctement coupé.</li>
	<li>Sécher les disques matérielles de l’échantillon à 60 ° C dans une étuve à vide (< 10-2 Torr) pendant 24 h. Remarque : Certains matériaux peut-être besoin une haute température de séchage. Toutefois, il est important de ne pas atteindre une température qui pourrait dégrader thermiquement le matériel.</li>
	<li>Mesurer les épaisseurs de matériel film avec un pied à coulisse numérique. Remarque : Ce protocole recommande l’utilisation de matériels films avec une épaisseur constante et analogue lors de la comparaison de l’activité antimicrobienne de différents matériaux.</li>
	<li>Stériliser à chaque spécimen par immersion dans de l’éthanol 70 % pendant 10 min et les rayons ultraviolets (UV) pendant 1 h par chaque côté. NOTE : Rayonnement UV peut être effectuée en plaçant chaque spécimen dans une boîte de Petri stérile à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire avec une lampe de 12,0 W de rayonnement UV-C. ATTENTION : Chercheurs ne devraient pas s’exposer aux rayons ultraviolets, parce qu’il est mutagène.</li>
	<li>Effectuez les étapes 1.1, 1.2, 1.3 et 1.4. avec les disques de matériel de contrôle. Remarque : Le polyéthylène téréphtalate (PET) ou des matériaux non antimicrobiens alternatifs pourraient servir comme un disque de contrôle dans la méthode de diffusion et contact. Plus, lorsque la caractérisation nanocomposites ou matériaux traités, le matériau de base devrait être utilisé comme matériel de contrôle.</li>
</ol>2. recommandée de micro-organismes
Remarque : Nous recommandons l’utilisation de 3 différents microorganismes pour étudier la capacité antimicrobienne du matériau testé contre un large éventail de microorganismes.
<ol><li>Utiliser des cultures pures de 3 microorganismes : les bactéries à Gram positif Staphylococcus aureus, Escherichia coliles bactéries à Gram négatif et la levure Candida albicans. Remarque : Autres espèces de micro-organismes aussi peuvent être testés avec ce protocole en modifiant les conditions d’incubation si nécessaire. ATTENTION : Les mesures de biosécurité requises doivent être suivies selon le type de micro-organisme employée dans le présent protocole.</li>
	<li>Travailler avec du matériel préalablement stérile ou autoclavé et utiliser un brûleur Bunsen pendant tout le processus de la manipulation microbienne ou une enceinte de sécurité biologique (si nécessaire) afin d’assurer des conditions d’asepsie. Remarque : Des conditions recommandées autoclave sont 121 ° C pendant 15 min pour les milieux de culture et 121 ° C pendant 20 min. pour le matériel de travail et les résidus biologiques.</li>
</ol>3. agar disque Diffusion Test (méthode de Diffusion)
Remarque : Lorsqu’une liquide diffusion de composés antimicrobiens pourrait être le principal mécanisme antimicrobien des matériaux avancés, la méthode de diffusion peut fournir des informations très utiles quant à la capacité antimicrobienne de ces matériaux. Le disque de matière situé au centre de la gélose peut former une zone d’anneau transparent (halo) où une inhibition de la croissance de microorganismes se produit après 24 h de culture (voir Figure 1).
<ol><li>
Procédure d’essai de diffusion
	<ol>
<li>Préparer et autoclave une gélose trypticase soja (TSA) suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Versez la TSA dans des plats de Pétri stérile dans des conditions aseptiques à l’aide d’un bec Bunsen ou une hotte à flux laminaire. Remarque : Les plaques TSA doivent être de 4 à 6 mm d’épaisseur.</li>
		<li>La culture de micro-organismes différents à tester en aérobiose pendant 18-24 heures dans les boîtes de Pétri avec TSA dans un incubateur à 37 ° C.</li>
		<li>Préparer et bouillon de trypticase soja autoclave (BST) suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Versez le BST dans un tube à centrifuger préstérilisé 50 mL avec une pipette sérologique préstérilisé dans des conditions aseptiques à l’aide d’un bec Bunsen ou une hotte à flux laminaire.</li>
		<li>Resuspendre quelques colonies d’étape 3.1.3 dans 25 mL de TSB contenue dans un tube à centrifuger stérile à l’aide d’un coton-tige stériles et vortex eux pendant 1 min obtenir un mélange homogène.</li>
		<li>Ajuster l’absorbance (à 540 nm) de la culture avec un spectrophotomètre pour le nombre approprié de colonies formant des unités (UFC) par mL : environ 1,5 x 108 UFC/mL pour les bactéries et de 1 x 106 à 5 x 106 UFC/mL pour la levure. Remarque : Les volumes pour mesurer l’absorbance de la culture et de la cuvette doivent être choisies selon le type du spectrophotomètre utilisé.</li>
		<li>Vortex le bouillon de culture microbienne pendant 5 secondes pour améliorer la dispersion du micro-organisme et Plongez brièvement un coton-tige stériles dans cette suspension microbienne. Enlever l’excès de liquide de l’écouvillon en le pressant contre la paroi du tube contenant la culture.</li>
		<li>-Ensemencer uniformément la suspension microbienne bouillon avec le coton-tige stériles sur la surface des plaques TSA dans 3 plans pour couvrir leur toute la surface avec le micro-organisme et le laisser sécher pendant 5 min après l’inoculation. Remarque : Pour supprimer toute trace d’humidité, les plaques TSA doivent être placés ouverts en position inversée à 37 ° C pendant 10 à 15 min avant l’inoculation.</li>
		<li>Stériliser une paire de pincettes en immergeant dans un bécher avec de l’éthanol 96 % et ensuite les flammes avec un bec Bunsen ou la lampe à alcool.</li>
		<li>Placer les disques d’échantillon pour tester et contrôler le disque au centre des plaques TSA en utilisant une paire de pinces stériles.</li>
		<li>Incuber en aérobiose la TSA en position inversée à 37 ° C pendant 24 h. Remarque : Pour éviter tout risque de contamination, il est recommandé à incuber les boîtes de Pétri de TSA. Toutefois, si le disque échantillon se détache des plaques TSA, n’effectuez pas cette étape en position inversée. Dans ce cas, il est recommandé de sécher les plaques dans la hotte à flux laminaire. Ce test antimicrobiens doit être effectué au moins en quadriplicate à des jours différents pour assurer la reproductibilité.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vérification de la pureté et la concentration de la suspension microbienne Remarque : Les étapes suivantes sont nécessaires afin de vérifier que la concentration microbienne déterminée avec le spectrophotomètre à l’étape 3.1.7 est correcte et s’assurer qu’il n’existait aucune contamination microbienne de l’environnement. Une contamination microbienne de l’environnement peut être facilement détectée par l’apparition de divers types de colonies microbiennes après 24 h de culture. En outre, aucune contamination microbienne du milieu du BST au cours de sa manipulation dans les dilutions décimales en série ne doit être assurée avec une plaque de contrôle négative du BST.<ol>
<li>Diluer le TSB stérile (préparé à l’étape 3.1.4) dans des microtubes stériles à l’aide d’une micropipette avec des pointes autoclavés appropriés dans des conditions aseptiques. L’un d’eux sera utilisé comme contrôle négatif du BST.</li>
		<li>Effectuer des dilutions décimales en série avec la suspension microbienne bouillon utilisée à l’étape 3.1.9 dans les tubes de microcentrifuge stérile contenant du BST.</li>
		<li>Propagation de 100 µL de chaque dilution sur des plaques TSA à l’aide d’une spatule de Drigalski préstérilisée ou un autre instrument. Aussi répandu 100 μl de milieu du BST sans micro-organisme (préparé à l’étape 3.2.1) sur une plaque TSA comme une plaque de contrôle négative du BST.</li>
		<li>Incuber en aérobiose la TSA en aérobie à 37 ° C pendant 24 h.</li>
		<li>Compter le nombre de colonies pour vérifier que le CFU/mL sont semblables à celui déterminé à l’étape 3.1.7.</li>
		<li>Vérifier qu’il n’y a aucune contamination microbienne environnementale sur les plaques de la TSA avec qu’un seul type de colonies.</li>
		<li>Vérifier qu’il n’y a aucune contamination microbienne sur la plaque de contrôle négatif du BST ne montrant aucune colonie</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. mesure de l’activité antimicrobienne sur les Surfaces des matériaux (méthode de Contact)
 Remarque : Lorsque la surface de contact peut être le mécanisme principal d’antimicrobiens de certains matériaux de pointe, la méthode de contact peut fournir des informations très utiles quant à la capacité antimicrobienne de ces matériaux. Dans cette méthode, les micro-organismes sont placés directement sur la surface du matériau et leur inhibition de la croissance peut être déterminée après un certain laps de temps.
<ol><li>
Procédure initiale
	<ol>
<li>Préparer et stériliser du BST en suivant les instructions du fabricant.</li>
		<li>Versez le BST dans un tube à centrifuger préstérilisé 50 mL avec une pipette sérologique préstérilisé dans des conditions aseptiques à l’aide d’un bec Bunsen ou une hotte à flux laminaire.</li>
		<li>Culture les différents microorganismes à tester en aérobiose, du jour au lendemain dans le tube avec le BST dans un agitateur orbital (140 tr/min) à 37 ° C.</li>
		<li>Diluer la culture nuitée dans 20 mL du BST dans un tube à centrifuger préstérilisé 50 mL à une concentration d’environ 106 UFC/mL (déterminé avec un spectrophotomètre à 540 nm). Remarque : Les volumes pour mesurer l’absorbance de la culture et de la cuvette doivent être choisies selon le type du spectrophotomètre utilisé.</li>
		<li>Effectuer des dilutions décimales en série de cette culture en tubes de microcentrifuge stérile contenant du BST. Répandre 100µl de la culture sur des plaques TSA et il incuber en aérobie à 37 ° C pendant 24 h.</li>
		<li>Dénombrer les colonies afin d’assurer une concentration cellulaire initial d’environ 1 x 106 UFC/mL</li>
		<li>4 place les disques de contrôle pour le comptage microbienne après 24h et 4 disques d’échantillon de chaque type des matériaux testés pour le comptage microbienne après que 24h en sépare les puits d’une plaque de 48 puits stérile.</li>
		<li>Distribuer 150 µL de la suspension microbienne sur chaque surface de disque.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microbienne de comptage sur le contrôle et les matériaux testés (après 24 h)
	<ol>
<li>Après l’étape 4.1.6, en aérobiose Incuber les 4 disques échantillon restant dans la plaque de 48 puits à 37 ° C pendant 24 h. Remarque : Ce temps d’incubation de 24 heures peuvent être modifié afin d’étudier l’inhibition de la croissance à des moments plus ou moins longues.</li>
		<li>Après 24 h d’incubation, distribuer 850 µL de PBS stérile sur la surface des 4 disques échantillon et mélangez-le avec les 150 µL de la suspension microbienne.</li>
		<li>Percevoir le mélange de suspension microbienne/PBS et chaque disque de la plaque 48 puits et transférez-les sur un tube de 10 mL pré-stérilisés.</li>
		<li>Vortex le mélange de suspension microbienne/PBS et chaque disque pendant 1 min, ultrasons il à 50 Hz pendant 5 min et vortex il à nouveau pendant 1 min pour s’assurer qu’aucun des microorganismes viables ne restent ont adhéré à la surface du matériau.</li>
		<li>Effectuer des dilutions décimales en série de chaque culture aux ultrasons dans des tubes de microcentrifuge stérile contenant du BST et répandre 100µl de la culture sur des plaques TSA et il incuber en aérobie à 37 ° C pendant 24 h.</li>
		<li>Compter le nombre de colonies, qui sont le nombre de micro-organismes viables sur chaque surface de disque échantillon et témoin. Exprimer ce nombre de cellules viables dans (UFC/mL).</li>
		<li>Prenez une photo de la culture microbienne finale pour les disques de l’échantillon et témoin.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. analyse des résultats antimicrobiens
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig1.jpg"> Figure 1 : mesures pour la largeur normalisée de l’antimicrobien « halo ». Ce panneau indique le diamètre de la zone d’inhibition (diz) et le diamètre du disque (d). <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<ol><li>
Analyse des résultats méthode diffusion
	<ol>
<li>Mesurer le diamètre de la zone d’inhibition (diz) et le diamètre du disque (d) (voir la Figure 1) avec un pied à coulisse numérique. Remarque : L’inhibition zone ou antimicrobien « halo » est formé par suite de l’inhibition de la croissance microbienne produite par le disque de matière antimicrobien (voir Figure 1). Il est possible d’observer qu’il y a une zone transparente anneau proche de l’échantillon par rapport au reste de la plaque où les micro-organismes sont développées correctement (zone opaque).</li>
		<li>Déterminer la largeur normalisée de l’antimicrobien « halo » (nwhalo) de chaque disque en appliquant l’équation (1). (1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq1.jpg">
</li>
		<li>Déterminer la moyenne et l’écart de la largeur normalisée des valeurs nwhalo antimicrobien « halo » avec 4 déterminé de chaque échantillon.</li>
		<li>Prenez une photo de la culture microbienne finale avec le disque de matière. Remarque : Le diamètre de la zone d’inhibition (diz) et le diamètre du disque (d) peuvent être mesurées aussi de la photo prise à l’étape 5.1.4 en utilisant une logiciel de traitement d’image adaptée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Méthode de contact résultats analyse
	<ol>
<li>Déterminer le nombre de micro-organismes viables récupérés selon l’équation (2). (2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq2.jpg"> NOTE : Ici, N est le nombre de micro-organismes viables récupérés par cm2 par éprouvette ; C est la teneur en germes ; D est le facteur de dilution ; A est la surface de l’éprouvette en cm2 déterminé par le diamètre du disque échantillon.</li>
		<li>Déterminer la perte de viabilité (LV) pour tenir compte de l’inhibition de la croissance cellulaire en appliquant l’équation (3). (3)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq3v3.jpg"> NOTE : Ici, C est le nombre moyen de micro-organismes viables (N) en UFC/mL•cm2, prélevés les échantillons de contrôle après 24 h ; S est le nombre de micro-organismes viables (N) en UFC/mL•cm2, extraite des éprouvettes après 24h.</li>
		<li>Déterminer la moyenne et l’écart type de la perte de viabilité avec les 4 valeurs déterminées de LV(%) de chaque échantillon.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego-Ferrer, G., SuayAnt&#243;n, J., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+water+and+polymer+chains+in+poly(hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels.">Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels.</a> Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+crosslinking+on+porous+poly(methyl+methacrylate)+produced+by+phase+separation.">Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation.</a> Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).</li><li>Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego Ferrer, G., Suay Ant&#243;n, J., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+poly+(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels.">Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels.</a> Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroporous+poly(methyl+methacrylate)+produced+by+phase+separation+during+polymerisation+in+solution.">Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution.</a> Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Llorens-G&#225;mez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+analysis+and+water+vapour+sorption+of+highly+porous+poly(methyl+methacrylate).">Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate).</a> Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Campillo-Fern&#225;ndez, A. J., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Monle&#243;n-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels+prepared+by+radical+polymerisation+with+methanol+as+diluent.">Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent.</a> Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).</li><li>Rodr&#237;guez-Hern&#225;ndez, J. C., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Monle&#243;n-Pradas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+nanocomposite+scaffolds+with+ordered+cylindrical+orthogonal+pores.">Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores.</a> J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).</li><li>Br&#237;gido-Diego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylic+scaffolds+with+interconnected+spherical+pores+and+controlled+hydrophilicity+for+tissue+engineering.">Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering.</a> J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-G&#225;mez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+water+diffusion+and+compression+performance+of+crosslinked+alginate+with+a+minuscule+amount+of+graphene+oxide.">Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide.</a> Sci Rep. 7, 11684 (2017).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+irregular+graphene+oxide+tubes+using+green+chemistry+and+their+potential+use+as+reinforcement+materials+for+biomedical+applications.">Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications.</a> PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).</li><li>S&#225;nchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fern&#225;ndez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels+reinforced+with+graphene+oxide:+Remarkable+improvement+of+water+diffusion+and+mechanical+properties.">Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties.</a> J Appl Polym Sci. , (2018).</li><li>Serrano-Aroc, &. #. 1. 9. 3. ;., Iskandar, L., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+synthetic+routes+to+alginate-graphene+oxide+composite+hydrogels+with+enhanced+physical+properties+for+bioengineering+applications.">Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications.</a> Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).</li><li>Llorens-G&#225;mez, M., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Advanced+Hydrogels+of+Calcium+Alginate/Carbon+Nanofibers+with+Enhanced+Water+Diffusion+and+Compression+Properties.">Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties.</a> Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).</li><li>Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibility+testing+by+a+standardized+single+disk+method.">Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method.</a> A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).</li><li>Taubes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacteria+fight+back.">The bacteria fight back.</a> Science. 321 (5887), 356-361 (2008).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=10+x+'20+progress--development+of+new+drugs+active+against+Gram-negative+bacilli:+an+update+from+the+infectious+diseases+society+of+America.">10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’activité antimicrobienne de nouveaux matériaux avancés peut être analysée par le présent protocole facile à suivre, consistant en 2 procédures complémentaires basées sur 2 méthodes existantes : la méthode de diffusion sur gélose test38 et mesuré l’activité antimicrobienne surfaces de matériaux selon la norme ISO 22196:200739.
Dans ce domaine de recherche, nombreux tests antimicrobiens rapportées dans la littérature sont très dépendants de l’essai. Il est donc très important d’avoir des détaillées et cohérente des protocoles en place dans les laboratoires. Cet article est une étape dans cette direction. En outre, il pourrait être très utile pour de nombreux chercheurs qui sont moins expérimentés dans ce domaine et qui doivent être approfondie, étape par étape à suivre pour des résultats précis.
Ce protocole peut être utilisé avec plusieurs types de matériaux découpés en formes de disque de 10 mm de diamètre. Les matériaux fragiles peuvent être gonflées dans un solvant approprié pendant 1 h rendre le processus de découpe plus facile. Ainsi, des matériaux hydrophiles comme les alginates peuvent être hydratés dans l’eau distillée autoclavé. Autres solvants, comme l’éthanol, cétone et le dichlorométhane, peuvent servir à gonfler des matières hydrophobes pendant 1 h avant de les couper. Cependant, certains matériaux tels que le poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) n’avez pas besoin d’être gonflé, et ils peuvent être coupés directement. Après cela, il est très important de sécher les disques matérielles de l’échantillon dans une étuve à vide et stériliser chaque échantillon avec l’éthanol et le rayonnement UV pendant 1 h pour éviter tout risque de contamination.
Ce protocole recommande TSA et BST comme milieux de culture et de l’utilisation des cultures pures de 3 microorganismes pour atteindre un large éventail de microorganismes : les bactéries à Gram positif Staphylococcus aureus, Escherichia coli, les bactéries à Gram négatif et la levure Candida albicans. Cependant, les milieux de culture alternative et d’autres microorganismes qui ont besoin de conditions différentes d’incubation pourraient également être utilisés avec ce protocole. Parfois, 1 seul micro-organisme est testé pour avoir une première idée de l’activité antimicrobienne d’un nouveau matériau.
Les matériaux à forte activité antimicrobienne contre les 3 recommandés montrant différents types de microorganismes doivent également être testés contre les agents pathogènes résistants aux antibiotiques comme la méthicilline-résistant Staphylococcus epidermidis (MRSE), qui ont été utilisés avec succès avec ce protocole. Autres micro-organismes résistants aux médicaments importants qui causent beaucoup de soucis sont le Gram positif méthicilline-résistant Staphylococcus aureus (SARM) et vancomycin-resistant Enterococci (ERV) et le Gram-négatif Pseudomonas aeruginosa40,41.
Inhibition de biofilm et l’activité antimicrobienne des matériaux contre d’autres types de micro-organismes tels que les virus et les parasites ne peuvent être testés avec ce protocole. Toutefois, ce protocole prévoit un très bon point de départ pour une étude d’antimicrobiens d’un nouveau matériel de pointe.
Dans le test de diffusion de disque antimicrobien agar, une étape cruciale se produit lorsque le disque de l’échantillon doit être placé dans le centre de la plaque car certains matériaux plier dès qu’ils obtiennent en contact avec les milieux gélosés. Dans ce cas, il est recommandé d’utiliser une paire stérile de pincettes pour Dépliez délicatement l’échantillon. En revanche, dans la méthode de contact, il est essentiel de laver le contrôle et disques d’échantillon très bien avec du PBS de pipetage eux quatre fois suivie d’une agitation vigoureuse et la sonication afin de ne garantir qu’aucun des microorganismes viables restent collés à la matière surface.
Ce protocole vidéo peut être utilisé dans de nombreuses applications de la bio-ingénierie, tels que le génie des bioprocédés, génie tissulaire, livraison de drogue contrôlée, matériaux d’emballage, traitement des eaux usées et l’agriculture, qui utilisent des biomatériaux avec une très capacité antimicrobienne souhaitable.
Les résultats obtenus avec ce protocole sont qualitatives (les images) et quantitative (la largeur normalisée de l’antibactérien « halo » et la perte de viabilité) avec une bonne analyse de sa reproductibilité (moyenne ± écart-type). Lorsque l'on compare les différents matériaux, ces valeurs moyennes obtenues avec l’analyse de résultats de méthode diffusion et contact doivent être analysés par ANOVA, suivie de l’analyse post hoc de la Turquie, afin d’étudier si elles sont, statistiquement, significativement à différents (p < 0,01).

Échec de l’implant est souvent une conséquence des infections microbiennes qui se produisent en dépit de la prophylaxie antimicrobienne et des conditions de travail aseptique. Ce problème est entraînant des coûts très élevés de soins de santé, est pénible parmi les patients1. Important des bactéries telles que Staphylococcus aureus sont actuellement considérés comme très dangereux agents pathogènes nosocomial infections liées aux cathéters et d’autres implants médicaux et sont les principaux contaminants des instruments médicaux2. Par conséquent, le développement de nouvelles stratégies antimicrobiennes est absolument nécessaire pour les utilisations quotidiennes et médicale.
Agents antimicrobiens incluent antibiotiques3composés d’ammonium quaternaire4, ions/oxydes métalliques5et peptides antimicrobiens (ampères)6. Antibiotiques deviennent progressivement moins efficaces en raison de la résistance bactérienne7, qui est à la hausse en raison de la surutilisation antibiotique8. Composés d’ammonium quaternaire ne sont plus très efficaces pour une utilisation à court terme en raison de la résistance microbienne,9. Les ions/oxydes métalliques ont été longtemps utilisés comme agents antimicrobiens très efficaces et sont utilisés dans nombreux produits commerciaux communs, y compris les pansements, les filtres à eau, peintures, etc.10,11,12. Toutefois, il a été démontré que ces types de composés peuvent être toxiques pour certains types de cellules de mammifères,13.
Ampères excellent antimicrobien et immunomodulatrices propriétés14,15, et bactéries semblent très difficile de développer une résistance contre les16. Cependant, le processus pour produire des amplis purs est cher ; par conséquent, une production à grande échelle n’est pas viable. Ainsi, des stratégies pour contrer les problèmes dans la production d’amplificateurs ont été mis au point (p. ex., petites peptoid antibactérien moléculaire imite17, peptoids18, α-peptides19 et β-peptides20). Polypeptoids et polypeptides méthacrylate à composition non limitée ont été synthétisés pour antimicrobien et antifouling coatings21.
Le développement de nouveaux agents antimicrobiens tels que les matériaux de pointe en pure ou forme hybride, capable de prévenir et traiter les infections pharmaco-résistante, est de plus en plus nécessaire. Une large gamme de nouveaux matériaux avancés pour les nombreux domaines de la bio-ingénierie comme tissu et génie des bioprocédés ont été développés avec des propriétés chimiques et physiques améliorées au cours des dernières décennies via plusieurs méthodes : plasma-polymérisation greffage sur un substrat hydrophobe22,23,24, l’adaptation de la densité de réticulation25,26, la polymérisation en solution27,28,29 , 30, porogen dissolution31,32et par l’incorporation des nanomatériaux comme le graphène oxyde (aller)33,34,35,36 et carbone nanofibres (CNFs)37.
L’étude de la capacité antimicrobienne de ces nouveaux matériaux pourrait augmenter exponentiellement leur applicabilité éventuelle de la bioingénierie et est, par conséquent, devenue indispensable. Nous présentons un protocole facile à suivre afin de quantifier l’activité antimicrobienne de ces nouveaux matériaux avancés. Ici, après la préparation de l’échantillon, deux méthodes complémentaires sont suivies : la première repose sur la gélose disque diffusion test38 (méthode de diffusion) et le second est basé sur la norme de 22196:2007 ISO39 pour mesurer l’activité antimicrobienne sur surfaces des matériaux (méthode de contact).

<table><tbody><tr><td>Cylindrical punch&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>10 mm diameter</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>soria genlab</td><td>P101</td><td>90 mm diameter, sterile</td></tr><tr><td>Tryptic soy agar (TSA)</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>Dehydrated medium 500 g (powder)</td></tr><tr><td>Tryptic soy broth (TSB)</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>Dehydrated medium 500 g (powder)</td></tr><tr><td>Sterile cotton swab</td><td>EUTOTUBO</td><td>300200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>429900</td><td>50 mL, sterile</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>83813360</td><td>Absolute ethanol</td></tr><tr><td>Sterile 48-wells plate</td><td>COSTAR</td><td>3548</td><td>Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene</td></tr><tr><td>A pair of tweezers</td><td>BRAUN</td><td>24612036</td><td>Toothless</td></tr><tr><td>Sterile phosphate buffered saline (PBS).</td><td>VWR</td><td>E404-100TAPBS</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum oven with a connected vacuum pump</td><td>JP Selecta, SA</td><td>5900620</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood</td><td>TELSTAR Technologies, SL</td><td>TELSTAR AH-100</td><td>12.0 W lamp of UV-C radiation</td></tr><tr><td>Class II Biological safety cabinet</td><td>LABOGENE</td><td>MARS 1200</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ASTEC CO, LTD</td><td>SCA-165DR</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Biosan</td><td>V-1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Macherey-Nagel, Germany</td><td>Nanocolor UV/VIS II</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>JP Selecta, SA</td><td>7001539</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol burner</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>1658/20</td><td>In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>sartorius stedim</td><td>8864845</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>SELECTA</td><td>3000617</td><td>50/60 Hz</td></tr><tr><td>Digital calliper</td><td>ACHA</td><td>17-260</td><td>0-150 mm</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td>25 mL, sterile</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td>5 mL, sterile</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>VWR</td><td>612-5541</td><td>10 mL, sterile</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>FA10005P</td><td>Pipetman L P200L, plastic 20-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>Pipetman P1000, 200-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette&amp;nbsp;</td><td>GILSON</td><td>FA10016</td><td>Pipetman L P12X300L, 20-300 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette tips</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-200-960</td><td>2-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette tips</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-1K0-480</td><td>100-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Pre-sterilized tube&amp;nbsp;</td><td>INSULAB</td><td>301402</td><td>10 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Photo camera</td><td>Canon EOS 5D</td><td></td><td>Any camera with high resolution can also be utilized</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td></td><td>&amp;nbsp;strain V329</td><td>Cucarella et al. &lt;em&gt;J Bacteriol&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;183 (9)&lt;/strong&gt;,&amp;nbsp; 2888&amp;ndash;2896 (2001)</td></tr><tr><td>Gram-negative bacteria &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 101</td><td></td></tr><tr><td>Yeast &lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 1394</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>DASLAB</td><td>175508</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>JP Selecta, SA</td><td>4002136</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer-cuvettes</td><td>UVAT Bio CB</td><td>F-0902-02</td><td>4,5 mL</td></tr><tr><td>Drigalski spatula</td><td>LABBOX</td><td>SPRP-L05-1K0</td><td>Sterile, disposable&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>glass balls (2 mm diameter)</td><td>Hecht Karl</td><td>1401/2</td><td>Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula</td></tr><tr><td>Autoclave bags</td><td>DELTALAB</td><td>200318</td><td>To sterilize microbiological residues or contaminated material</td></tr><tr><td>Electronic pipette filling device</td><td>JetPip</td><td>JET BIOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-100-010</td><td>100 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-250-010</td><td>250 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-500-010</td><td>500 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-1K0-010</td><td>1000 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>DENIA</td><td>2278000000</td><td></td></tr><tr><td>Indicator tape for sterilization</td><td>LABBOX</td><td>STAP-A55-001</td><td>Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.</td></tr><tr><td>Universal test tube rack</td><td>LABBOX</td><td>MTSP-001-001</td><td>To hold centrifuge tubes</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube rack</td><td>VWR</td><td>211-0210</td><td>To hold microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Sterile loop</td><td>ACEFE S.A.</td><td>100140055</td><td>10 &amp;micro;L of capacity for microbial culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M1</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M2</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M3</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type3</td></tr><tr><td>Material M4</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material C</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Control material</td></tr></tbody></table>

antimicrobial characterization of advanced materials for bioengineering applications

Le développement de nouveaux matériaux avancés avec des propriétés améliorées devient de plus en plus important dans un large éventail d’applications de la bio-ingénierie. Ainsi, de nombreux nouveaux biomatériaux est conçus pour imiter les environnements spécifiques requis pour des applications biomédicales telles que l’ingénierie tissulaire et de la livraison de drogue contrôlée. Le développement de matériaux aux propriétés améliorées pour l’immobilisation des cellules ou des enzymes est également un sujet de recherche actuels en génie des bioprocédés. Cependant, une des propriétés plus désirables d’un matériau dans ces applications est la capacité antimicrobienne pour éviter toute infection indésirables. Pour ce faire, nous présentons des protocoles facile à suivre pour la caractérisation antimicrobienne des matériaux à base de (i) le critère de diffusion disque agar (méthode de diffusion) et (ii) la norme de 22196:2007 ISO pour mesurer l’activité antimicrobienne sur les surfaces des matériaux (contact méthode). Ce protocole doit être effectué à l’aide de bactéries Gram-positives et Gram-négatives et la levure pour couvrir un large éventail de microorganismes. À titre d’exemple, 4 des matériaux avec différentes natures chimiques sont testés suivant ce protocole contre Staphylococcus aureus, Escherichia coliet Candida albicans. Les résultats de ces tests montrent une activité non antimicrobiens pour la matière première et en augmentant l’activité antibactérienne contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives pour les 3 autres matériaux. Toutefois, aucun des 4 matières sont capables d’inhiber la croissance de Candida albicans.

Ce protocole a été employé, à titre d’exemple, pour tester la capacité antimicrobienne de 4 matériaux avec différentes natures chimiques contre les 3 recommandé microorganismes : Staphylococcus aureus, Escherichia coliet Candida albicans . Les résultats des tests agar disque diffusion (méthode de diffusion) a présenté une activité non antimicrobiens pour la matière première (M1) car elle a eu lieu dans le disque de contrôle (C, image ne pas montrée) et en augmentant l’activité antibactérienne contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives bactéries pour les 3 autres matériaux M2, M3 et M4 (voir Figure 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig2.jpg"> Figure 2 : résultats de méthode de diffusion antimicrobiens. Ce panneau indique la méthode de diffusion aux antimicrobiens pour les 4 matières (M1, M2, M3 et M4) disques (diamètre 10 mm x 1 mm d’épaisseur) contre s. aureus et Escherichia coli après 24 h d’incubation. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
La figure 3 montre les différentes largeurs normalisées de l’antimicrobien « halo » (nwhalo), pour les matériaux différents exemple M1, M2, M3 et M4 contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives, calculé avec l’équation (1). Cependant, aucun des 4 matières étaient capables d’inhiber la croissance de la levure Candida albicans (images non illustrés).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2.jpg"> Figure 3 : résultats de diffusion aux antimicrobiens « halo ». Ce panneau montre le normalisée « halo » (nwhalo) pour chaque disque (M1, M2, M3 et M4) matérielle (diamètre 10 mm x 1 mm d’épaisseur) contre s. aureus et Escherichia coli après 24 h d’incubation. Les différences sont statistiquement significatives (p < 0,01). Cependant, l’échantillon M1 ne présentait aucune activité antimicrobienne. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Les résultats de la méthode de contact a également une activité non antimicrobiens pour la matière première (M1) car elle a eu lieu dans le disque de contrôle (C) et la croissante activité antibactérienne contre Grampositive et bactéries à Gram négatif pour les 3 autres matériaux (voir La figure 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3.jpg"> Figure 4 : antimicrobienne contacter les résultats de la méthode. Ce panneau montre les plaques respectives de 90 mm du 4 matière (M1, M2, M3 et M4) surface activité antimicrobienne dosage selon l’ISO 22196:2007 après 24 h d’incubation pour Staphylococcus aureus et Escherichia coli (facteur de dilution de 10-4). C est la bactérie viable, récupérée à partir du disque de contrôle après 24 h d’incubation. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
La perte de viabilité (%) a été déterminée par l’équation (2) et (3) comme indiqué dans le présent protocole (voir Figure 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2.jpg"> Figure 5 : perte de viabilité par la méthode de contact. Ce panneau montre la perte de viabilité (%) pour le M1, M2, M3 et M4 contre Staphylococcus aureus et Escherichia coli sur les surfaces des matériaux. M1 de l’échantillon n’exposé aucune activité antimicrobienne. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Cependant, aucun des 4 matières étaient capables d’inhiber la croissance de la levure Candida albicans par la méthode de contact soit (non illustrés d’images). Par conséquent, 3 de ces 4 matériaux avancés a montré des résultats positifs antimicrobiens contre les bactéries Gram-positives et Gram-négatives et donc pourrait être très utile pour de nombreuses applications de la bio-ingénierie avec les exigences de haute activité antibactérienne. Cependant, aucun des 4 matières étaient capables d’inhiber la croissance de levure.

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Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

Nous présentons un protocole pour la caractérisation antimicrobienne des matériaux avancés. Ici, l’activité antimicrobienne sur les surfaces des matériaux est mesurée par deux méthodes qui se complètent mutuellement : une repose sur le test de diffusion sur disque, et l’autre est une procédure standard basée sur la norme de 22196:2007 ISO.

Antimicrobiens caractérisation de matériaux de pointe pour des Applications de bio-ingénierie

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.9K vues.  Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir. Nous présentons un protocole pour la caractérisation antimicrobienne des matériaux avancés. Ici, l’activité antimicrobienne sur les surfaces des matériaux est mesurée par deux méthodes qui se complètent mutuellement : une repose sur le test de diffusion sur disque, et l’autre est une procédure standard basée sur la norme de 22196:2007 ISO.

Vidéo: Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

Haut-débit Identification des bactéries Polymères répulsifs pour les dispositifs médicaux

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Recherche

Bio-ingénierie

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

Matériaux biomimétiques à caractériser les interactions bactéries-hôtes

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Immunologie et infection

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Les analyses qualitatives et quantitatives pour la détection et la caractérisation des antimicrobiens en protéines

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Ciblage biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Utilisation de résazurine Basé Essai de sensibilité aux médicaments

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Une plate-forme de dosages anti-biofilm Adaptés à l&#39;exploration des bibliothèques de composés naturels

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Synthèse des Nanotubes de carbone Multi modifiés avec des nanoparticules d’argent et de l’évaluation de leurs activités antibactériennes et propriétés cytotoxiques

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been explored previously in clinical and environmental settings and in consumable food products. However, a lack of consistency in the experimental methods and materials used has culminated in conflicting results, even amongst studies of the same nanostructure types and bacterial species. For researchers who wish to employ nanostructures as an additive or coating in a product design, these conflicting data limit their utilization in clinical settings. 
To confront this dilemma, in this article, we present four different methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, and discuss their applicability in different scenarios. Adapting consistent methods is expected to lead to reproducible data that can be compared across studies and implemented for different nanostructure types and microbial species. We introduce two methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and two methods for the antimicrobial activities of nanostructured surfaces. 
For nanoparticles, the direct co-culture method can be used to determine the minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations of nanoparticles, and the direct exposure culture method can be used to assess real-time bacteriostatic versus bactericidal activity resulting from nanoparticle exposure. For nanostructured surfaces, the direct culture method is used to determine the viability of bacteria indirectly and directly in contact with nanostructured surfaces, and the focused-contact exposure method is used to examine antimicrobial activity on a specific area of a nanostructured surface. We discuss key experimental variables to consider for in vitro study design when determining the antimicrobial properties of nanoparticles and nanostructured surfaces. All these methods are relatively low cost, employ techniques that are relatively easy to master and repeatable for consistency, and are applicable to a broad range of nanostructure types and microbial species.

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

We introduce four methods to evaluate the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces using in vitro techniques. These methods can be adapted to study the interactions of different nanoparticles and nanostructured surfaces with a broad range of microbial species.

Évaluation des activités antimicrobiennes des nanoparticules et des surfaces nanostructurées in vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been ...

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are frequently used to cultivate bacterial biofilms for rapid antimicrobial susceptibility testing to calculate minimal biofilm eradication concentration (MBEC) values. Standard biofilm devices consist of polystyrene pegged-lids fitted to 96-well microplates and are ideal for measuring biofilm biomass and MBEC values, but these devices are limited by available peg surface area for biomass accumulation and cost. Here, we outline a protocol to use self-assembled polypropylene 96-well deep well PCR-plate pegged-lid device to grow Escherichia coli BW25113 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. A comparison of 24-hour biofilms formed on standard and deep well devices by each species using crystal violet biomass staining and MBEC determination assays are described. The larger surface area of deep well devices expectedly increased overall biofilm formation by both species 2-4-fold. P. aeruginosa formed significantly greater biomass/mm2 on deep well pegs as compared to the standard device. E. coli had greater biomass/mm2 on standard polystyrene devices as compared the deep well device. Biofilm eradication assays with disinfectants such as sodium hypochlorite (bleach) or benzalkonium chloride (BZK) showed that both compounds could eliminate E. coli and P. aeruginosa biofilms from both devices but at different MBEC values. BZK biofilm eradication resulted in variable E. coli MBEC values between devices, however, bleach demonstrated reproducible MBEC values for both species and devices. This study provides a high throughput deep well method for growing larger quantities of biofilms on polypropylene devices for downstream studies requiring higher amounts of static biofilm.

This protocol presents methodology to perform biofilm growth and biomass measurements using self-assembled deep well PCR-plate devices for high-throughput 96-well pegged lid static biofilm screening.

Génération d’une plus grande biomasse de biofilm bactérien à l’aide de dispositifs de microplaques de puits profonds à plaques PCR

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nanocomposites antibactériens d’oxyde de graphène/cuivre pour bactéries résistantes

Fabrication of Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to antibiotics. Developing&#160;antimicrobial agents that can replace existing antibiotics is essential because antibiotic-resistant bacteria have resistance mechanisms for all current antibiotics and can promote nosocomial infections. To address this challenge, in this study, we propose graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as antibacterial materials that can replace the existing antibiotics. GO/Cu nanocomposites are characterized by transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. They show that copper (Cu) nanoparticles are well-grown on the graphene oxide sheets. Additionally, a microdilution broth method is used to confirm the efficacy of the antimicrobial substance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), which are frequently implicated in nosocomial infections. Specifically, 99.8% of MRSA and 84.7% of P. aeruginosa are eliminated by 500 &#181;g/mL of GO/Cu nanocomposites. Metal nanocomposites can eradicate antibiotic-resistant bacteria by releasing ions, forming reactive oxygen species, and physically damaging the bacteria. This study demonstrates the potential of antibacterial GO/Cu nanocomposites in eradicating antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Des nanocomposites métalliques pour éliminer les bactéries résistantes aux antibiotiques

Herein, we introduce graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as an antibacterial nanomaterial. The antibacterial effectiveness of the GO/Cu nanocomposites was evaluated against both antibiotic-resistant gram-positive and gram-negative bacteria.

Fabrication de nanocomposites antibactériens d’oxyde de graphène et de cuivre

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to ...

<meta charset="utf8"></head><body> Synthèse de nanoparticules d’oxyde de zinc et analyse de ses effets antibactériens

Preparation of Zinc Oxide Nanoparticles and the Evaluation of their Antibacterial Effects

Nosocomial bacterial infections have become increasingly challenging due to their inherent resistance to antibiotics. The emergence of multidrug-resistant bacterial strains in hospitals has been attributed to the extensive and varied use of antibiotics, further exacerbating the problem of antibiotic resistance. Metal nanomaterials have been widely studied as an alternative solution for eradicating antibiotic-resistant bacterial cells. Metallic nanoparticles attack bacterial cells through various mechanisms, such as the release of antibacterial ions, generation of reactive oxygen species, or physical disruption, against which bacteria cannot develop resistance. Among the actively researched antimicrobial metal nanoparticles, zinc oxide nanoparticles, which are FDA-approved, are known for their biocompatibility and antibacterial properties. In this study, we focused on successfully developing a precipitation method for synthesizing zinc oxide nanoparticles, analyzing the properties of these nanoparticles, and conducting antimicrobial tests. Zinc oxide nanoparticles were characterized using transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering (DLS), ultraviolet/visible spectroscopy, and X-ray diffraction (XRD). Antibacterial tests were conducted using the broth microdilution test with the multidrug-resistant strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa. This study demonstrated the potential of zinc oxide nanoparticles in inhibiting the proliferation of antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Pleins feux sur l’auteur : Explorer les effets antibactériens des nanoparticules d’oxyde de zinc pour surmonter la résistance aux antibiotiques

In this study, zinc oxide nanoparticles were synthesized using a precipitation method. The antibacterial effect of the synthesized particles was tested against multidrug-resistant methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa bacterial strains.

Préparation de nanoparticules d’oxyde de zinc et évaluation de leurs effets antibactériens

Nosocomial bacterial infections have become increasingly challenging due to their inherent resistance to antibiotics. The emergence of multidrug-resistant ...

Antimicrobiens caractérisation de matériaux de pointe pour des Applications de bio-ingénierie

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