Name: methods for the study of regeneration in stentor
Uploaded: 2018-06-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
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Ce travail a été soutenu par la subvention de NIH R01 GM113602 (WFM) et NSF 1144247 (AL). Nous reconnaissons Mark Slabodnick et Natalie Kirkland pour développer les versions initiales de certains de ces protocoles et informatives. Nous remercions Karina Perlaza et Greyson Lewis pour une lecture critique du manuscrit.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Culture de Stentor présente un certain nombre de défis. Tout d’abord, pour réaliser des expériences qui nécessitent un grand nombre de cellules, il faut maintenir un grand nombre de cultures de Stentor , en tant que cultures devenus insalubres lorsque la concentration de Stentor dépasse 20 cellules/mL. Deuxièmement, les organismes qui peuvent contaminer les cultures de Stentor souvent divisent plus rapidement que Stentor et submergent la culture (un contaminant commun est rotifères). Ainsi, il est nécessaire d’inspecter la culture sous un microscope périodiquement et de supprimer les contaminants. Occasionnellement, une nouvelle culture doit être démarré à partir d’un petit nombre de cellules a sauvé manuellement d’une culture contaminée. Cela augmente le temps nécessaire pour maintenir les cultures saines de Stentor . Troisièmement, l’expansion une cellule unique dans une culture de 400 mL exige au moins un mois parce que Stentor cell cycle est de 3 à 5 jours. Quatrièmement, contrairement à d’autre modèle ciliés, Stentor rarement entrer dans la forme de kyste et ils ne peuvent pas être figés.
Un aspect important de la culture de Stentor est la sélection d’un organisme d’une alimentation appropriée. Diverses méthodes de culture de Stentor ont été décrites précédemment. L’un d’eux suggère d’utiliser du lait écrémé pour des bactéries de culture qui se nourrissent alors de Stentor. Cette technique est efficace dans la mise en culture de Stentor; application de techniques génomiques exige toutefois des échantillons purs pour éviter la confusion résultant de la génomique se lit d’organismes alimentaires non défini. En utilisant le protocole actuel, Stentor peuvent être cultivés en masse et, parce que leur nourriture, Chlamydomonas, a été séquencé, la présence de contamination génomique de l’Organization de nourriture peut être détectée et contrôlée pour. Pour des raisons inconnues, tartare dû reconstituer ses stocks en retournant à où il a trouvé Stentor avant. Avec le protocole actuel, nous avons pu garder de Stentor pour années.
Expériences de régénération avec Stentor sont généralement simples, mais il y a quelques détails essentiels à garder à l’esprit. En ce qui concerne l’article 2, coupe de Stentor dans la moitié des cellules peuvent être maîtrisées en quelques minutes. Maîtriser les procédures de microchirurgie plus avancées de Stentor peut exiger une semaine de pratique. Tout en effectuant un traitement de saccharose ou de l’urée (Section 3), si au début de l’imagerie, la plupart des cellules ont encore leurs bandes membranellar, augmenter le temps d’incubation de 10 à 30 s pour quand le traitement de saccharose est effectué ensuite. N’augmentez pas le temps de traitement de saccharose au-delà de 3 min d’incubation parce qu’elle se traduira par la mort des cellules.
Imagerie de Stentor régénération exige des méthodes pour les grosses cellules image sur de longues périodes de temps. La méthode d’imagerie, détaillée dans la Section 4 peut seulement être utilisée avec un microscope vertical. Si un microscope inversé est disponible au lieu de cela, des cellules peuvent être placés sur une diapositive ou une lamelle couvre-objet en petites chambres. Une méthode consiste à créer une chambre de gelée de pétrole et de la couverture avec une autre lamelle couvre-objet pour éviter l’évaporation. Par ailleurs, une chambre pour une cellule individuelle peut être faite en faisant un trou avec un poinçon de trou de la taille souhaitée en 1 x 1 cm2 carrés de l’entretoise de silicium (Table des matières), placer l’entretoise sur un lamelle couvre-objet, mettre des cellules dans la chambre et couvrant la chambre avec une autre lamelle. Quand l’imagerie, si Stentor ne sont pas dans le bon sens à observer les caractéristiques de chacune des étapes de la régénération, taper la plaque fermement pour rendre le contrat de la cellule. Regardez la cellule étendre afin d’identifier la phase de régénération (extension complète prend environ 45 s). Si la cellule est toujours dans la mauvaise orientation, répéter la mise sur écoute. Les images montrées dans la Figure 1 et Figure 6 ont été prises par un microscope stéréo zoom ; Cependant, toutes les expériences détaillées peuvent être effectuées à l’aide d’un 5 X binoculaire stéréo.
Un autre défi en plus de culture et d’imagerie de Stentor est le suivi de la régénération, plus précisément la quantité de temps nécessaire pour identifier les étapes. Si la régénération cellulaire est parfaitement orientée avec la région du primordium orale bien visible, identification de l’étape prend quelques secondes. Parfois, cependant, la cellule de Stentor est dans une orientation empêchant l’attribution précise des stade de régénération, ainsi prendre plus de temps à identifier. La quantité importante de temps nécessaire au stade des cellules régénératrices individuelles pourraient retarder la quantification des rejets de toutes les cellules régénératrices, diminuant ainsi la précision temporelle de la mise en scène et exiger l’observateur d’attendre et de recréer l’image sur la cellule après qu’il a déménagé à une nouvelle orientation. Par conséquent, cette expérience est temps et demande beaucoup de travail. Pour ces raisons, il serait hautement souhaitable d’élaborer des méthodes automatisées pour détecter les cellules de Stentor et assignant les étapes de la régénération de données vidéo microscopie. Il permettrait aussi d’autres expériences reproductibles, augmente dans la taille de l’échantillon et l’enlèvement de partialité humaine.
L’émergence de méthodes génomiques et protéomiques hautement sensibles a commencé à mettre des études des cellules individuelles dans reach. Pour ces analyses unicellulaires, la taille géante d’une cellule de Stentor permet un cobaye souhaitable pour des expériences de validation. Pour de telles expériences possible, cultivant Stentor est fondamentale, et si les méthodes décrites ici devraient jouer un rôle dans le développement de techniques plus avancées de cellule unique.

Les cellules ne sont pas simples sacs d’enzymes, mais plutôt très complexes machines dont les composants sont soigneusement mis à l’échelle à la bonne taille et disposés dans des positions bien définies. La morphogénèse des cellules individuelles représente un processus clé dans la cellule et de la biologie du développement, mais son mécanisme moléculaire est inconnu1,2. Alors que certaines des cellules ressemblent à des objets BLOB, organismes unicellulaires peuvent avoir extrêmement compliquées architectures, illustrées par les patrons corticales complexes chez les ciliés3,4.
Peut-être l’exemple le plus extrême d’une cellule très structurée est Stentor coeruleus, un géant eurytèles cilié vaguement apparenté à Tetrahymena et Paramecium. Stentor est 1 mm de long et est recouvert de plus de 100 bandes longitudinales de pigment bleu alternant avec des rangées de cils organisés par piles parallèles de rubans de microtubules qui courent le long de toute la cellule. La cellule est en forme de trompette (Figure 1), avec une bande de membranellar et un appareil oral (OA) à son extrémité antérieure et un pied qui s’adapte sur la cellule du substrat à son extrémité postérieure. En plus de la polarité de claire antéro-postérieur, la cellule montre également une structuration chirale distincte, tels que l’espacement entre les lignes ciliaires progressivement augmente dans le sens horaire. Cela se traduit par une discontinuité à l’intersection de la ligne plus étroite la ligne plus large et cette région de la surface cellulaire, connu comme le locus de contraste rayure, peut induire la formation de la deuxième série de structures de l’extrémité antérieure lorsque greffé sur une autre cellule5, ce qui en fait officiellement équivalent à organisateur de Spemann. Ainsi, tous les principaux processus de biologie du développement ont leurs analogues dans Stentor: axiation formation du patron et induction. Dans un embryon, ces processus sont conduits par des différences de destin entre différentes cellules, mais à Stentor, ils doivent être pilotées par des différences de destin entre les différentes régions au sein d’une seule cellule. Ce qui définit les différences entre les régions au sein de Stentor est un mystère.
Si une partie quelconque de Stentor est coupée, la pièce manquante de la cellule peut se régénérer pour produire une cellule normale en quelques heures. Si une cellule est coupé de moitié, ou même en très petits morceaux, chaque pièce se réorganise dans une cellule d’apparence normale mais en plus petite et restaure bonne proportionnalité entre cellule pièces6,7. Même de petits fragments, 1/64ème la taille de la cellule d’origine, sont capables de se régénérer dans une cellule petite mais normalement proportionnée et puis passer à la taille6. Stentor a ainsi présente une occasion unique d’étudier les mécanismes des organites taille mise à l’échelle et la cellule de régulation de la croissance en utilisant des méthodes chirurgicales qui sont généralement appliqués au niveau des tissus ou des organismes entiers.
Une des propriétés de Stentor qui lui permet de se régénérer d’un large éventail d’opérations chirurgicales est qu’elle contient un seul nodulées macronucleus (Figure 1) avec environ 50 000 copies du génome entier8. Tant qu’un fragment de cellule contenait au moins un nœud macronucléaire, il a la capacité de se régénérer complètement. Une autre propriété qui sous-tendent la capacité de régénération de Stentorest sa prodigieuse capacité de cicatrisation. Bien que plusieurs types de cellules sont capables de guérir leurs blessures9, Stentor est capable de récupérer d’une gamme extraordinaire de perturbations physiques. Un exemple de Stentor rétablissement après une perturbation radicale, ainsi que les méthodes de visualisation des flux cytoplasmique dans Stentor10 ont été rapportées. Ces méthodes permettent l’étude de l’effet de régénération comment blessant et suivantes de l’état physique du cytoplasme.
La taille énorme de stentor, la capacité de régénération extraordinaire et le fait qu’elle manifeste beaucoup des phénomènes du développement chez les embryons multicellulaires (tels que les organisateurs, axiation et structuration) a attiré de nombreux biologistes du développement au cours de le tournant du siècle dernier, dont Thomas Hunt Morgan7. Durant les années 50 et 60, les approches microchirurgicales face a montré un tableau saisissant des processus régénératifs et morphogénétiques dans cet organisme unicellulaire11. Toutefois, Stentor a été développé comme un système modèle de biologie moléculaire que récemment. Au cours des dernières années, le génome de Stentor a été séquencé et assemblé8, et la méthode pour perturber l’expression des gènes à l’aide d’Arni en se nourrissant était développé12.
Une des raisons que Stentor a été transformé en un organisme modèle pour la biologie moléculaire moderne seulement récemment était la difficulté de plus en plus de grandes cultures en raison de son long cycle de cellules (3 à 5 jours). Cependant, les méthodes modernes de génomiques et protéomiques nécessitent moins de matériel qu’ils ont utilisé pour, et le volume d’une seule cellule de Stentor est suffisant pour ces méthodes, même sans recourir à des méthodes ultrasensibles qui ont été développées pour l’analyse du single cellules qui sont plus petits que Stentor. L’article 1 du protocole détaille la procédure pour l’établissement d’une grande culture d’une seule cellule de Stentor . La même approche peut servir à établir une culture grande d’un fragment de cellules obtenue en coupant une cellule. Article 1er stipule également les lignes directrices pour le maintien des cultures saines de Stentor sur de longues périodes de temps. Article 2 du protocole prévoit la méthodologie induisant la régénération cellulaire en coupant les cellules manuellement avec une aiguille de verre. L’article 3 du protocole est dédié à deux méthodes d’induction de la régénération des structures de cellule spécifique (membranellar band et oral appareils) : traitant les cellules avec saccharose ou urée conduit à l’effusion de ces structures, suivies de leur régénération. L’article 4 du protocole détaille une méthode pour l’imagerie de cellules régénératrices individuelles sur de longues périodes de temps. L’article 4 se termine par la description des phases de régénération et de conseils sur l’analyse de la dynamique de la régénération.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Stentor coeruleus&lt;/em&gt; live culture</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>131598</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; &lt;em&gt;reinhardtii&lt;/em&gt; on agar</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>152040</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurized springwater, 1-quart bottle</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>132458</td><td></td></tr><tr><td>Methyl cellulose, 1500 cP</td><td>Millipore Sigma</td><td>M0387</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex glass spot plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>13748B</td><td></td></tr><tr><td>Wide-mouth glass jar with screw cap, 60 mL</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>715740</td><td></td></tr><tr><td>2-cup glass container with glass lid</td><td>Pyrex</td><td>1095600</td><td></td></tr><tr><td>CultureWell silicone sheet material</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly Clark</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Posi-Click 1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Cover Glass</td><td>Fisher finest</td><td>12-548-B</td><td></td></tr><tr><td>TAP Growth Media, optimized for &lt;em&gt;Chlamydomonas&lt;/em&gt; culture</td><td>ThermoFisher</td><td>A1379801</td><td></td></tr><tr><td>Silicone spacer, CultureWell Silicone Sheet, 0.25mm Thick/13 cm x 18 cm</td><td>Grace Bio Labs</td><td>664475</td><td></td></tr><tr><td>Petrolatum, Petroleum Jelly, White</td><td>Spectrum</td><td>P1037</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate glass capillary tubes.&lt;br/&gt; OD: 1.2 mm, ID: 0.9 mm, length: 10 cm.</td><td>Sutter Instrument</td><td>B120-90-10</td><td></td></tr><tr><td>Needle puller P-87</td><td>Sutter Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stemi 2000 stereo microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axiozoom V16, stereo zoom microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the study of regeneration in stentor

Les cellules doivent être capables de régénérer leurs pièces à récupérer des perturbations externes. Les unicellulaires ciliés Stentor coeruleus est un organisme d’excellent modèle pour étudier la cicatrisation et la régénération des cellules suivantes. Le génome de Stentor est devenu disponible récemment, ainsi que les méthodes de la biologie moléculaire moderne, tels que l’ARNi. Ces outils permettent d’étudier la régénération de cellules individuelles au niveau moléculaire. La première section du protocole couvre des cultures de cellules de Stentor établissant des cellules individuelles ou des fragments de cellules, ainsi que des directives générales pour le maintien des cultures de Stentor . Culture de Stentor en grande quantité permet l’utilisation des outils précieux comme la biochimie, séquençage et spectrométrie de masse. Les sections suivantes du protocole couvrent différentes approches pour induire la régénération à Stentor. Couper manuellement les cellules avec une aiguille de verre permet d’étudier la régénération des pièces de grandes cellules, tout en traitant les cellules avec saccharose ou urée permet d’étudier la régénération de structures spécifiques, situé à l’extrémité antérieure de la cellule. Une méthode d’imagerie des cellules régénératrices individuelles est fournie, ainsi qu’une rubrique pour la mise en scène et l’analyse de la dynamique de la régénération. L’ensemble du processus de régénération est divisé en trois étapes. En visualisant la dynamique de la progression d’une population de cellules à travers les étapes, l’hétérogénéité dans la distribution de la régénération est démontrée.

Cultures de Stentor ont été mis en place et maintenus à partir de cellules individuelles ou des fragments de cellules à l’aide de l’article 1 du protocole fiable. Un exemple représentatif d’une culture saine grand est sur la vidéo 1.
L’évolution temporelle de la régénération a été mesurée à Stentor , à l’aide de la méthode de traitement de saccharose pour lancer la régénération décrite à l’étape 3.1, combiné avec l’imagerie et la méthode d’analyse a examiné à la Section 4 (Figure 7). Ce diagramme indique qu’il y a un écart d’un heure-long dans le temps par la population de cellules pour atteindre n’importe quel stade particulier. Ce type d’analyse permet l’étude de l’hétérogénéité temporelle dans le processus de régénération dans une population de régénération des cellules.
Ce qui suit est un résumé des propos de régénération qui a été observée à ce jour après des dizaines de traitements de saccharose (Figure 4 et Figure 6). Étape 1 est quand des cellules de Stentor ressemblent teardrops sans n’importe quelle bande de membranellar (cette étape démarre immédiatement après le lavage de saccharose). Cette étape dure de 3 à 6 h. Stage 2 est quand une bande de membranellar apparaît et développe (3 à 6 h après traitement de saccharose). Cette étape dure de 3-4 h. stade 3 est quand un primordium orale apparaît à l’extrémité postérieure de la bande de membranellar (6-8 h après traitement de saccharose), et les deux structures sont déplacés vers l’extrémité antérieure de la cellule. Cette étape dure pendant 1-2 h. Lorsque les bandes membranellar et l’appareil oral atteint l’extrémité antérieure de la cellule, ceci indique la fin de la régénération. La cellule a adopté la forme caractéristique de trompette comme Stentor . Les cellules sont complètement régénérée 8-9 h après traitement de saccharose.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig1.jpg"> La figure 1. Instantané de Stentor. La bande de membranellar et de l’appareil par voie orale est indiqués à l’extrémité antérieure de la cellule. Le pied est à l’extrémité postérieure de la cellule. Macronucleus Stentor est nodulés. Un bien nourris, Stentor a verts alimentaire vacuoles contenant principalement Chlamydomonas. Barre d’échelle est 0,5 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig2.jpg"> Figure 2. Réglage de coupe Stentor . Coupe de la cellule est réalisée en manipulant manuellement une aiguille de verre tout en regardant la cellule à l’aide d’un microscope stéréo dissection disponible dans le commerce. Le papier de soie vise à fournir le fond blanc pour voir les cellules mieux. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig3.jpg"> La figure 3. Instantanés de 3 vidéo illustrant comment couper un Stentor avec une aiguille de verre. (A) A Stentor immédiatement avant que l’aiguille touche il. (B) un Stentor a légèrement coincé entre une lame de verre et l’aiguille. (C) A contracté de Stentor en réaction à la force de l’aiguille. (D) A Stentor à couper en appuyant doucement sur la cellule avec le côté de l’aiguille. (E) A Stentor maintenant coupé en deux, mais pas séparés. Deux fragments de Stentor (F). Barre d’échelle est 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2.jpg"> Figure 4. Visualisation schématique de l’article 3 et article 4 du protocole. Il s’agit d’un protocole illustré pour l’exécution de saccharose ou de traitement d’urée et d’observation de la régénération cellulaire. L’heure indiquée dans le panneau inférieur est mesurée depuis le début du cycle de lavage 1. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig4v2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig5.jpg"> Figure 5. Le programme d’installation pour l’observation d’imagerie et/ou directe de régénération avec un microscope vertical. Dans chaque goutte de 4 µL suspendus de la lamelle couvre-objet, il y a une cellule en cours de régénération. L’eau dans les puits de la plaque de verre spot limite l’évaporation des gouttelettes. Cette configuration permet à la suite de la régénération des cellules multiples en parallèle. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig6.jpg"> La figure 6. Instantanés de Stentor dans chaque étape de la bande de membranellar et la régénération de l’appareil buccale. (A) phase 1 se caractérise par une forme de larme cellule et l’absence de la bande de membranellar. (B) stade 2 se caractérise par l’apparition de la bande de membranellar, une structure axée sur les cils qui bat en permanence. Membranellar bandes sont marqués avec des lignes pointillées blanches en panneaux B - D. (C et D) étape 3 se caractérise par l’apparition du primordium orale (marqué d’une flèche). Primordium oral ressemble à une invagination à l’extrémité postérieure de la bande de membranellar. Le primordium orale sera ensuite vers le haut vers la partie antérieure de la cellule pour devenir l’appareil oral. (E) la régénération est terminée lorsque la cellule a adopté la caractéristique forme trompette Stentor et l’appareil oral (marqué d’une flèche) s’est élargi à l’extrémité antérieure de la cellule. Barre d’échelle est 0,25 mm. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57759/57759fig7.jpg"> Figure 7. Empilés affichage de boîte intrigue comment les proportions des cellules à tous les stades de la régénération après traitement de saccharose change au fil du temps. Le graphique montre l’hétérogénéité du calendrier des étapes de la régénération dans une population de cellules régénératrices. « Reg » indique l’achèvement de la régénération. Le nombre de cellules : 28. <a href="/files/ftp_upload/57759/57759fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Movie 1" src="/files/ftp_upload/57759/57759video1.jpg"> Vidéo 1. Exemple d’une culture de Stentor en bonne santé. En règle générale, si une culture est-ce concentré, fractionnement de la culture est recommandée. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video1.mp4" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>
<img alt="Movie 2" src="/files/ftp_upload/57759/57759video2.jpg"> Vidéo 2. Ralentissement de Stentor avec la méthylcellulose. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video2.mov" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>
<img alt="Movie 3" src="/files/ftp_upload/57759/57759video3.jpg"> Vidéo de 3. Coupe Stentor. Les cellules individuelles peuvent être coupés manuellement en plusieurs morceaux sous une stéréo binoculaire en appuyant sur une aiguille de verre à travers la cellule. <a href="/files/ftp_upload/57759/Video3.mov" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Problème avec la culture</td>
			<td>Recours possible</td>
			<td>Prévention possible</td>
		</tr>
<tr>
<td>La culture est submergée par les rotifères ou d’autres grands organismes.</td>
			<td>Eliminez autant de Stentor que possible dans une autre boite de culture. Puis laver les cellules trois fois.</td>
			<td>Laver soigneusement les Stentor lors de la réception, même quand leur achat auprès d’un fournisseur commercial.</td>
		</tr>
<tr>
<td>La culture est submergée par les champignons ou autres petits organismes.</td>
			<td>Identifier un coin où il y a le moins Stentor. Dans ce domaine, retirer autant que possible sans enlever beaucoup de Stentor et ajouter à nouveau PSW. Mélanger doucement, mais bien à distrubute les organismes envahisseurs. Ignorez la prochaine tétée et Stentor mangeront leur.</td>
			<td>Observez la culture régulièrement et retirer les petits contaminants en échangeant des médias aux frais PSW.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Stentor permettent de poser sur le dessus de l’autre.</td>
			<td>Diviser la culture afin que la concentration est inférieure à 20 cellules/mL.</td>
			<td>Diviser les cultures plus souvent.</td>
		</tr>
<tr>
<td>
Cellules de Stentor sont accouplement.</td>
			<td>Nourrir tous les 4 jours au lieu de tous les 5 jours.</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>La culture a beaucoup de déchets sombre.</td>
			<td>Enlevez autant de la matière sombre, déchets de Stentor , possible sans enlever les cellules. Si Stentor sont attachés à la matière sombre, Pipetter haut et en bas pour libérer les cellules de Stentor de leurs déchets et puis retirez le support avec les déchets sans supprimer les cellules. Ou, retirer ces Stentor et nourrir en conséquence moins.</td>
			<td>Alimentation de Stentor 1 mL moins de nourriture par 100 mL de la culture.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Aspect malsain (vacuolisés/gonflé ou arrondi) Stentor.
</td>
			<td>Retirer autant que possible sans enlever plusieurs cellules de Stentor et ajouter nouveau PSW.</td>
			<td>Échanger régulièrement les médias.</td>
		</tr>
</tbody></table>Le tableau 1. Guide de dépannage pour la culture de Stentor.

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Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Méthodes pour l’étude de la régénération de Stentor

Le géant cilié, Stentor coeruleus, est un excellent système pour étudier la régénération et la guérison des plaies. Nous présentons des procédures pour établir des cultures de cellules de Stentor de cellules individuelles ou des fragments de cellules, induisant la régénération de cellules de coupe, chimiquement induisant la régénération de la bande de membranellar et appareil oral, imagerie et analyse des cellules régénération.

Cells need to be able to regenerate their parts to recover from external perturbations. The unicellular ciliate Stentor coeruleus is an excellent model ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Methods for the Study of Regeneration in Stentor

11.7K vues.  University of California San Francisco. Le géant cilié, Stentor coeruleus, est un excellent système pour étudier la régénération et la guérison des plaies. Nous présentons des procédures pour établir des cultures de cellules de Stentor de cellules individuelles ou des fragments de cellules, induisant la régénération de cellules de coupe, chimiquement induisant la régénération de la bande de membranellar et appareil oral, imagerie et analyse des cellules régénération.

Vidéo: Methods for the Study of Regeneration in Stentor

Use of the TetON System to Study Molecular Mechanisms of Zebrafish Regeneration

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough understanding of the molecular and cellular mechanisms involved requires experimental tools that allow for inducible, tissue-specific manipulation of gene expression or signaling pathways. Therefore, we and others have recently adapted the TetON system for use in zebrafish. The TetON system facilitates temporally and spatially-controlled gene expression and we have recently used this tool to probe for tissue-specific functions of Wnt/beta&#8211;catenin signaling during zebrafish tail fin regeneration. Here we describe the workflow for using the TetON system to achieve inducible, tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin. This includes the generation of stable transgenic TetActivator and TetResponder lines, transgene induction and techniques for verification of tissue-specific gene expression in the fin regenerate. Thus, this protocol serves as blueprint for setting up a functional TetON system in zebrafish and its subsequent use, in particular for studying fin regeneration.

Here we outline the workflow for using the TetON system to achieve tissue-specific gene expression in the adult regenerating zebrafish tail fin.

Utilisation du système de Teton pour étudier les mécanismes moléculaires de la régénération du poisson zèbre

The zebrafish has become a very important model organism for studying vertebrate development, physiology, disease, and tissue regeneration. A thorough ...

Recherche

Biologie du développement

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched modern biological inquiry through the work of Trembley more than 250 years ago. Presently the study of regeneration has seen a resurgence using both &#34;classic&#34; regenerative organisms, such as the Hydra, planaria and Urodeles, as well as a widening spectrum of species spanning the range of metazoa, from sponges through mammals. Besides its intrinsic interest as a biological phenomenon, understanding how regeneration works in a variety of species will inform us about whether regenerative processes share common features and/or species or context-specific cellular and molecular mechanisms. The starlet sea anemone, Nematostella vectensis, is an emerging model organism for regeneration. Like Hydra, Nematostella is a member of the ancient phylum, cnidaria, but within the class anthozoa, a sister clade to the hydrozoa that is evolutionarily more basal. Thus aspects of regeneration in Nematostella will be interesting to compare and contrast with those of Hydra and other cnidarians. In this article, we present a method to bisect, observe and classify regeneration of the aboral end of the Nematostella adult, which is called the physa. The physa naturally undergoes fission as a means of asexual reproduction, and either natural fission or manual amputation of the physa triggers re-growth and reformation of complex morphologies. Here we have codified these simple morphological changes in a Nematostella Regeneration Staging System (the NRSS). We use the NRSS to test the effects of chloroquine, an inhibitor of lysosomal function that blocks autophagy. The results show that the regeneration of polyp structures, particularly the mesenteries, is abnormal when autophagy is inhibited.

Inducing Complete Polyp Regeneration from the Aboral Physa of the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis

Here we demonstrate how to induce and monitor regeneration in the Starlet Sea Anemone Nematostella vectensis, a model cnidarian anthozoan. We demonstrate how to amputate and categorize regeneration using a morphological staging system, and we use this system to reveal a requirement for autophagy in regenerating polyp structures.

Induire complète Polyp Régénération du aboral Physa de la mer Anémone Starlet<em&gt; Nematostella vectensis</em

Cnidarians, and specifically Hydra, were the first animals shown to regenerate damaged or severed structures, and indeed such studies arguably launched ...

A Murine Model of Stent Implantation in the Carotid Artery for the Study of Restenosis

Despite the considerable progress made in the stent development in the last decades, cardiovascular diseases remain the main cause of death in western countries. Beside the benefits offered by the development of different drug-eluting stents, the coronary revascularization bears also the life-threatening risks of in-stent thrombosis and restenosis. Research on new therapeutic strategies is impaired by the lack of appropriate methods to study stent implantation and restenosis processes. Here, we describe a rapid and accessible procedure of stent implantation in mouse carotid artery, which offers the possibility to study in a convenient way the molecular mechanisms of vessel remodeling and the effects of different drug coatings.

A model of stent implantation in mouse carotid artery is described. Compared to other similar methods, this procedure is very rapid, simple and accessible, offering the possibility to study in a convenient way the vascular wall reaction to different drug-eluting stents and the molecular mechanisms of restenosis.

Un modèle murin d&#39;implantation d&#39;une endoprothèse dans l&#39;artère carotide pour l&#39;étude de la resténose

Despite  the considerable progress made in the stent development in the last decades,  cardiovascular diseases remain the main cause of death in western ...

Médecine

Investigating Functional Regeneration in Organotypic Spinal Cord Co-cultures Grown on Multi-electrode Arrays

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a promising target for intervention to improve functional regeneration. So far, no in vitro model exists that grants the possibility to examine functional recovery of propriospinal fibers. Therefore, a representative model that is based on two organotypic spinal cord sections of embryonic rat, cultured next to each other on multi-electrode arrays (MEAs) was developed. These slices grow and, within a few days in vitro, fuse along the sides facing each other. The design of the used MEAs permits the performance of lesions with a scalpel blade through this fusion site without inflicting damage on the MEAs. The slices show spontaneous activity, usually organized in network activity bursts, and spatial and temporal activity parameters such as the location of burst origins, speed and direction of their propagation and latencies between bursts can be characterized. Using these features, it is also possible to assess functional connection of the slices by calculating the amount of synchronized bursts between the two sides. Furthermore, the slices can be morphologically analyzed by performing immunohistochemical stainings after the recordings. 
Several advantages of the used techniques are combined in this model: the slices largely preserve the original tissue architecture with intact local synaptic circuitry, the tissue is easily and repeatedly accessible and neuronal activity can be detected simultaneously and non-invasively in a large number of spots at high temporal resolution. These features allow the investigation of functional regeneration of intraspinal connections in isolation in vitro in a sophisticated and efficient way.

Here we present a protocol that is based on spinal cord slices cultured on multi-electrode arrays to study functional regeneration of propriospinal connections in vitro.

Enquêter Régénération fonctionnelle en organotypiques médullaires Co-cultures Cultivé sur des tableaux multi-électrodes

Adult higher vertebrates have a limited potential to recover from spinal cord injury. Recently, evidence emerged that propriospinal connections are a ...

Neurosciences

Planarian Immobilization, Partial Irradiation, and Tissue Transplantation

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian regeneration of any missing or damaged tissues is made possible by adult stem cells termed neoblasts3. Although these stem cells have been definitively shown to be pluripotent and singularly capable of reconstituting an entire animal4, the heterogeneity within the stem cell population and the dynamics of their cellular behaviors remain largely unresolved. Due to the large number and wide distribution of stem cells throughout the planarian body plan, advanced methods for manipulating subpopulations of stem cells for molecular and functional study in vivo are needed.
Tissue transplantation and partial irradiation are two methods by which a subpopulation of planarian stem cells can be isolated for further study. Each technique has distinct advantages. Tissue transplantation allows for the introduction of stem cells, into a na&iuml;ve host, that are either inherently genetically distinct or have been previously treated pharmacologically. Alternatively, partial irradiation allows for the isolation of stem cells within a host, juxtaposed to tissue devoid of stem cells, without the introduction of a wound or any breech in tissue integrity. Using these two methods, one can investigate the cell autonomous and non-autonomous factors that control stem cell functions, such as proliferation, differentiation, and migration.
Both tissue transplantation5,6 and partial irradiation7 have been used historically in defining many of the questions about planarian regeneration that remain under study today. However, these techniques have remained underused due to the laborious and inconsistent nature of previous methods. The protocols presented here represent a large step forward in decreasing the time and effort necessary to reproducibly generate large numbers of grafted or partially irradiated animals with efficacies approaching 100 percent. We cover the culture of large animals, immobilization, preparation for partial irradiation, tissue transplantation, and the optimization of animal recovery. Furthermore, the work described here demonstrates the first application of the partial irradiation method for use with the most widely studied planarian, Schmidtea mediterranea. Additionally, efficient tissue grafting in planaria opens the door for the functional testing of subpopulations of na&iuml;ve or treated stem cells in repopulation assays, which has long been the gold-standard method of assaying adult stem cell potential in mammals8. Broad adoption of these techniques will no doubt lead to a better understanding of the cellular behaviors of adult stem cells during tissue homeostasis and regeneration.

An effective method for grafting tissue of defined and consistent size between planaria is described. Also included is a description of how the immobilization technique used for transplantation can be adapted, in conjunction with lead shields, for the partial irradiation of live animals.

Immobilisation planaire, l&#39;irradiation partielle, et la transplantation de tissus

The planarian, a freshwater flatworm, has proven to be a powerful system for dissecting metazoan regeneration and stem cell biology1,2. Planarian ...

Biologie

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, repairing broken cell membrane before the cellular contents leak out. The giant unicellular organism Stentor coeruleus, in which cells can be more than one millimeter in size, have been a classical model organism for studying wound healing in single cells. Stentor cells can be cut in half without loss of viability, and can even be cut and grafted together. But this high tolerance to cutting raises the question of why the cytoplasm does not simply flow out from the size of the cut. Here we present a method for cutting Stentor cells while simultaneously imaging the movement of cytoplasm in the vicinity of the cut at high spatial and temporal resolution. The key to our method is to use a &#34;double decker&#34; microscope configuration in which the surgery is performed under a dissecting microscope focused on a chamber that is simultaneously viewed from below at high resolution using an inverted microscope with a high NA lens. This setup allows a high level of control over the surgical procedure while still permitting high resolution tracking of cytoplasm.

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

The giant ciliate Stentor coeruleus is a classical system for studying regeneration and wound healing in single cells.&#160;By imaging Stentor cells simultaneously at low and high magnification it is possible to measure cytoplasmic flows before, during, and after wounding.

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

An Assay for Lateral Line Regeneration in Adult Zebrafish

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line development and regeneration. The zebrafish is particularly attractive for such studies because of its rapid development time and its high regenerative capacity. To date, zebrafish studies of lateral line regeneration have mainly utilized fish of the embryonic and larval stages because of the lower number of neuromasts at these stages. This has made quantitative analysis of lateral line regeneration/and or development easier in the earlier developmental stages. Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish and not in the embryo/larvae, we focused on developing a quantitative lateral line regenerative assay in adult zebrafish so that an assay was available that could be applied to current adult zebrafish disease models. Building on previous studies by Van Trump et al.17&#160;that described procedures for ablation of hair cells in adult Mexican blind cave fish and zebrafish (Danio rerio), our assay was designed to allow quantitative comparison between control and experimental groups. This was accomplished by developing a regenerative neuromast standard curve based on the percent of neuromast reappearance over a 24 hr time period following gentamicin-induced necrosis of hair cells in a defined region of the lateral line. The assay was also designed to allow extension of the analysis to the individual hair cell level when a higher level of resolution is required.

Because many zebrafish models of neurological and non-neurological diseases are studied in the adult fish rather than the embryo/larvae, we developed a quantitative lateral line regenerative assay that can be applied to adult zebrafish disease models. The assay involved resolution at the 1) neuromast and 2) individual hair cell levels.

Un test pour ligne latérale de régénération à l&#39;âge adulte de poisson zèbre

Due to the clinical importance of hearing and balance disorders in man, model organisms such as the zebrafish have been used to study lateral line ...

A Standardized Murine Model of Extracorporeal Shockwave Therapy Induced Soft Tissue Regeneration

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly understood. Angiogenesis, a process of new blood vessel formation is a leading driver of regeneration in softer tissues as well as a recently discovered effect of SWT. How the mechanical stimulus of SWT induces angiogenesis and regeneration and which pathways are involved is not fully understood. To further improve the clinical use of SWT and gain valuable information about how mechanical stimulation can affect tissue and tissue regeneration, a standardized model of SWT is needed. We, hereby, describe a standardized, easy to implement murine model of shockwave therapy induced regeneration, utilizing the hind-limb ischemia model.

This article describes a standardized murine model of tissue regeneration via shockwave treatment.

Shockwave therapy (SWT) shows promising regenerative effects in several different tissues. However, the underlying molecular mechanisms are poorly ...

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that has emerged as an essential model for regeneration studies. Little is known about how revascularization occurs in the context of regeneration in these animals. Here we report a simple method for visualization of the vasculature in axolotl via perfusion of 1,1&#8217;-Dioctadecy-3,3,3&#8217;,3&#8217;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI is a lipophilic carbocyanine dye that inserts into the plasma membrane of endothelial cells instantaneously. Perfusion is done using a peristaltic pump such that DiI enters the circulation through the aorta. During perfusion, dye flows through the axolotl&#8217;s blood vessels and incorporates into the lipid bilayer of vascular endothelial cells upon contact. The perfusion procedure takes approximately one hour for an eight-inch axolotl. Immediately after perfusion with DiI, the axolotl can be visualized with a confocal fluorescent microscope. The DiI emits light in the red-orange range when excited with a green fluorescent filter. This DiI perfusion procedure can be used to visualize the vascular structure of axolotls or to demonstrate patterns of revascularization in regenerating tissues.

DiI Perfusion as a Method for Vascular Visualization in Ambystoma mexicanum

Using a lipophilic 1,1&#39;-Dioctadecy-3,3,3&#39;,3&#39;-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) staining technique, Ambystoma mexicanum can undergo vascular perfusion to allow for easy visualization of the vasculature.

La perfusion DiI comme méthode de visualisation vasculaire dans<em&gt; Ambystoma mexicanum</em

Perfusion techniques have been used for centuries to visualize the circulation of tissues. Axolotl (Ambystoma mexicanum) is a species of salamander that ...

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds of genes&#8212;many not associated with the oral apparatus (OA)&#8212;that are differentially regulated in phases throughout the regeneration process. It was hypothesized that this systemic reorganization and mobilization of cellular resources towards growth of a new OA will lead to observable changes in movement and behavior corresponding in time to the phases of differential gene expression. However, the morphological complexity of S. coeruleus necessitated the development of an assay to capture the statistics and timescale. A custom script was used to track cells in short videos, and statistics were compiled over a large population (N ~100). Upon loss of the OA, S. coeruleus initially loses the ability for directed motion; then starting at ~4 h, it exhibits a significant drop in speed until ~8 h. This assay provides a useful tool for the screening of motility phenotypes and can be adapted for the investigation of other organisms.

Analysis of Motility Patterns of Stentor During and After Oral Apparatus Regeneration Using Cell Tracking

We present a protocol for the characterization of motility and behavior of a population of hundred micron- to millimeter-sized cells using brightfield microscopy and cell tracking. This assay reveals that Stentor coeruleus transitions through four behaviorally distinct phases when regenerating a lost oral apparatus.

Analyse des modèles de motilité du stentor pendant et après la régénération de l’appareil buccal à l’aide du suivi cellulaire

Stentor coeruleus is a well-known model organism for the study of unicellular regeneration. Transcriptomic analysis of individual cells revealed hundreds ...

Méthodes pour l’étude de la régénération de Stentor

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