Ce travail a été soutenu par une bourse d’étude de parc recherche (JR) Norwich, l’ingénierie commune et les Sciences physiques recherche Conseil/issus de la biotechnologie et les Biological Sciences Research Council BBSRC OpenPlant synthétique Biology Research Centre, financé par subventions (BB / L014130/1) (M.J.S., A.O.) ; a John Innes Centre d’échange de connaissances et de la commercialisation accordent (BB/KEC1740/1) (B.B.) ; et l’octroi de Programme stratégique BBSRC Institute « Molécules de Nature » (BB/P012523/1) et le John Innes Foundation (e.a.). Nous tenons à remercier George Lomonossoff pour fournir les vecteurs pEAQ et Andrew Davis pour la photographie.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Haut-par-put infiltration sous vide permet de ce protocole à être utilisés en routine dans notre laboratoire de production préparative de triterpène composés d’intérêt pour diverses applications en aval. L’appareil d’infiltration sous vide décrit ici est reproduit facilement. Ajout du réservoir vide est conseillé pour diminuer le temps nécessaire pour tirer le vide nécessaire, cependant il est possible de simplement réutiliser une étuve à vide non modifiée comme la chambre de l’infiltration. Protection de la pompe à vide via l’ajout d’un condensateur adapté est théoriquement sensé, mais dans notre laboratoire, nous avons trouvé cela inutile.
Couverture de l’infiltration est compromise si les feuilles ne sont pas complètement immergés dans la suspension de l’infiltration. Ce problème est réduit en s’assurant que le niveau de la suspension atteint la surface supérieure du titulaire de la plante, et que le titulaire de la plante est un ajustement serré pour le bain d’infiltration. Figure 2, Notez que la surface supérieure du titulaire de la plante est en retrait dans à la baignoire de l’infiltration dans cette position. Ceci est réalisé en panneaux sur les bords moyens du titulaire qui constituent le point d’ancrage au dessus de la baignoire de l’infiltration. La suspension d’infiltration exigera des ajouts périodiques pour maintenir le niveau de la suspension. Ceci est mieux réalisé par addition de suspension infiltration excessive pour empêcher la réduction progressive de l' OD600 au cours d’une infiltration avec grand. Toutefois, dans nos mains, substitution de l’eau ne semble pas avoir un effet notable sur les rendements attendus à l’échelle préparative, bien que cela n’a pas été quantitativement étudiée. Combien de plantes peut être infiltré d’un lot de suspension de l’infiltration est toujours une question ouverte. Nous infiltrent régulièrement entre 100 et 200 plantes avec un lot unique de suspension de l’infiltration. En outre, il est normal que certains sols de lixivier dans la suspension d’infiltration au cours du processus d’infiltration. Cela n’a pas été trouvé pour avoir un effet notable sur l’efficacité de l’infiltration.
Au cours de la récolte, il est conseillé (mais pas critique) à récolter uniquement les feuilles qui ont été infiltrés (quelques feuilles aura atteint après infiltrations). La récolte sélective empêche la dilution avec tissu improductif, qui serait sinon augmenter le taux d’impuretés endogènes par rapport au composé d’intérêt. Cela a un impact nominal sur la facilité de la purification en aval et augmente l’échelle de ces processus. Lorsque vous utilisez tHMGR pour alimentation en précurseur de Poussée, un phénotype nécrosée est souvent observé à développer au cours de la période de croissance après infiltration. Ceci est normal et en fait du sida récolte sélective et le processus de séchage en aval. La poudre de feuilles séchées peut généralement être stockée dans un conteneur scellé dans un endroit frais, sec et sombre, mais idéalement dans un dessicateur sous vide. Cela dépend de la stabilité du composé d’intérêt. Soyez prudent si vous choisissez de stocker dans un congélateur à-80 ° C. Veiller à ce que les séché les feuilles sont dans un conteneur étanche et le déstockage, permettre ce conteneur se réchauffer à température ambiante avant ouverture. Faute de quoi se traduira par la réhumidification des feuilles, qui entravent le traitement en aval.
Les étapes après la récolte dans le présent protocole sont fournies à titre indicatif, et afin d’aider les chercheurs qui ont une chimie pratique limitée d’expérience. Ils peuvent se substituer à plusieurs autres techniques d’extraction/purification de produits naturels. Comme indiqué dans l’introduction, PSE présente de nombreux avantages, cependant l’amortissement des appareils disponibles dans le commerce de PSE peut être prohibitif et il n’est pas essentiel. Traitement de résine échangeuse d’ions base est une méthode très pratique pour remplacer la saponification traditionnelle suivie par séparation liquide/liquide. Toutefois, il ne convient pas pour les produits contenant de l’acide carboxylique groupes ou groupes fonctionnels qui serait être hydrolysés dans des conditions basiques, tels que les esters. Ces produits devrait être conservée sur l’échangeur de base. Toutefois, il est possible d’utiliser ce dernier pour une capture et de libérer la procédure (non documentée ici). Lorsque la saponification traditionnelle serait appropriée, traitement de résine échangeuse d’ions base sert une alternative commode. La méthode de chromatographie décrite à l’étape 9, s’est avéré pour être généralisables pour les composés décrits à la Figure 3. Toutefois, les composés de polarité accrue peuvent nécessiter une longue période d’élution 100 % pour l’acétate d’éthyle. En ce qui concerne l’étape 9.2, purification fine en aval est entièrement composé spécifique et est aussi dépendante de l’échelle. Rondes répétées de chromatographie flash plus petite échelle avec des gradients optimisées, est habituellement suffisante pour atteindre une pureté appropriée pour analyse par RMN. Sur des échelles plus larges, la cristallisation est souvent une alternative commode. Dans les cas difficiles, préparative ou semi-préparative chromatographie liquide haute performance (CLHP) peut être employée selon la quantité désirée de composé isolé. Exemples de procédés de purification en aval pour une gamme de composés représentatifs peuvent être trouvés ailleurs8.
Le protocole actuel, tel que présenté ici, est utilisé régulièrement dans notre laboratoire et a prouvé utilitaire. Cependant, il y a encore importante portée pour l’optimisation de la plate-forme d’expression supplémentaire. Travaux sont en cours dans notre laboratoire pour étudier comment autre génie de voie et différentielle contrôle des niveaux d’expression de protéine pourrait améliorer la production de triterpène davantage, tandis que la médiation de toxicité pour les cellules de l’hôte. Il y a aussi potentiel d’enquêter sur la manipulation des systèmes de transport intracellulaire20,21et la direction d’enzymes pour différents compartiments cellulaires22,23, les avenues qui pourraient améliorer l’efficacité de plusieurs événements de l’oxydation. Les avantages potentiels à la modification de la morphologie sous-jacente des organelles clés pourraient également être explorées. Par exemple, la surexpression du domaine membranaire de Arabidopsis thaliana HMGR a été observée pour induire une hypertrophie du réticulum endoplasmique dans les plantes24; un site clé pour l’activité CYP450. Ce protocole est idéal pour la production de milligramme de quantités de produits de triterpène gramme et peut être utilisé dans un contexte de recherche pour accéder aux composés pour étude en aval (par exemple, l’exploration systématique de structure-activité relations et enquête préliminaire dans les propriétés pharmacodynamiques et pharmacocinétiques de plomb composés d’intérêt clinique). Toutefois, la plate-forme est linéairement et fiable évolutif simplement en augmentant le nombre des plantes utilisées et l’aspect pratique d’expression transitoire via agroinfiltration a été démontré à l’échelle industrielle pour la production de protéines pharmaceutiques 14, donc il est possible pour cette plate-forme pour être prolongée pour la production commerciale de triterpènes de grande valeur. Alternativement, il est aussi possible d’envisager la production de transformants stables transportant la voie de biosynthèse multigénique désir finalisés, permettant la culture de masse et continue « agriculture » de transgéniques N. benthamiana souches production de différents composés d’une valeur commerciale.

Les triterpènes sont parmi les plus importantes et la plupart des structures diverses familles des produits naturels. Malgré leur immense diversité, tous les produits naturels de triterpène sont censés provenir de la même précurseur linéaire 2,3-oxidosqualene, un produit de la voie du mévalonate dans les plantes. La cyclisation des 2, 3-oxidosqualene est initiée et contrôlée par une famille d’enzymes appelées oxidosqualene cyclases (OSC). Cette étape de cyclisation représente le premier niveau de diversification, avec des centaines de triterpène différents échafaudages ayant été signalés dans la nature1. Ces échafaudages sont plus diversifiés en adaptant les enzymes y compris, mais non limité à, cytochrome p450s (CYP450s)1,2. Ces voies de biosynthèse peuvent conduire à immense complexité, entraînant parfois des produits finis qui sont à peine reconnaissables depuis le triterpène de parent. Par exemple, la structure complexe de la puissant insecticide et antiappétant limonoïde azadirachtin est censée provenir d’un triterpène tétracyclique des tirucallane type3.
Nombreux dérivés triterpéniques produits naturels, même ceux avec les échafaudages parent relativement non modifiés, ont démontré en médecine des activités biologiques4,5,6,7. Toutefois, jusqu'à présent ce potentiel n’est pas traduite par une pléthore de médicaments dérivés triterpéniques à la clinique. Il s’agit sans aucun doute (au moins partiellement) une conséquence de l’accès limité de synthèse pratique pour cette classe de composés, un problème qui peut étouffer l’exploration des relations structure-activité et mise au point de conduire candidats par traditionnel médicinales workflows de chimie.
Expression transitoire des enzymes biosynthétiques triterpène d’autres espèces végétales dans les feuilles de N. benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de haute valeur triterpène (Figure 1). Ce processus peut servir à caractériser sur le plan fonctionnel les enzymes candidat et reconstruire les voies de biosynthèse des métabolites naturels importants. De même, il peut également être exploitée dans des approches de biosynthèse combinatoires triterpène de nouveaux produits, une stratégie qui peut se traduire par des bibliothèques des analogues de structure apparentées, permettant une exploration systématique des relations structure-activité de plomb biologiquement actif composés de8,9.
Agroinfiltration est un moyen simple et efficace de réaliser l’expression transitoire dans les feuilles de N. benthamiana . Le processus implique l’infiltration des feuilles avec une suspension de a. tumefaciens transportant les exigences d’une expression binaire d’intérêt. Ceci est réalisé via l’application d’une pression qui force le liquide à travers les stomates, déplacement de l’air dans l’espace intercellulaire et son remplacement par la suspension d’a. tumefaciens . Les bactéries transférer l’ADN-T respectifs à l’intérieur des cellules végétales, aboutissant à l’expression de la protéine passagères et localisée dans les tissus foliaires infiltrés.
Tout en n’importe quel vecteur binaire adapté pour générer des plantes transgéniques peut-être être employée pour l’expression transitoire, nous utilisons le niébé Mosaic Virus CPMV dérivé Hypertranslational (HT) protein expression système10, 11. dans ce système, le gène d’intérêt est flanqué de régions non traduites (UTR) de l’ARN-2 CPMV. La 5' UTR contient des modifications entraînant des niveaux très élevés de la traduction des protéines avec aucun recours à la réplication virale,12. Cette technique a été développée dans la série de vecteur binaire Easy-et-rapide (ÉPQL) qui comprend la recombinaison site-spécifique clonage Protocole compatible constructions (ÉPQL -HT- DEST)10,11. La plupart des vecteurs pEAQ contiennent aussi une tomate bushy stunt virus dérivés P19 silencieux suppresseur gène13 dans la partie de l’ADN-T de la cassette d’expression, qui contourne qu’il fallait coinfiltrate une souche P19 porteurs distincte et offre très expression de la protéine de haut niveau chez l’hôte plant cell10,11.
Utilisation de N. benthamiana comme un hôte d’expressions présente des avantages particuliers lorsqu’il travaille avec voies de biosynthèse de plante. L’architecture cellulaire intrinsèquement prend en charge que les ARNm approprié et transformation de la protéine et cloisonnement approprié, en plus de posséder les enzymes nécessaires de co, réductases (pour CYP450s) et précurseurs métaboliques. La source de carbone est la photosynthèse ; ainsi, les plantes peuvent simplement être cultivées dans le compost de bonne qualité, nécessitant uniquement eau, CO2 (à partir de l’air) et le soleil comme entrées. La plateforme est également très pratique pour la co-expression de différentes combinaisons de protéines, comme cela peut se faire simpliste par l’infiltration Co de différentes souches de a. tumefaciens, niant la nécessité de construire la grande expression multigénique cassettes. En outre, le processus peut linéairement et sûrement évoluer simplement en augmentant le nombre de plantes utilisées pour l’expérience.
Des travaux précédents dans notre laboratoire a démontré l’utilité de cette plateforme pour des expériences à échelle préparative. Ceci inclus la préparation de nouveaux triterpènes pour essais de bioactivité et échelle vers le haut pour atteindre les quantités de gramme de produit isolé. En outre, l’accumulation de produits hétérogènes triterpène peut être augmentée plusieurs fois par la co-expression de forme N-terminal-tronqué, indépendante de la rétroaction de l’hydroxy-3, 3-methyglutary-coenzyme A réductase (tHMGR), une limitation de vitesse en amont enzyme dans la voie de mevalonate8.
Clé de telles expériences échelle préparative est la capacité de bien haut de gamme le processus d’infiltration. Dans une expérience typique, des dizaines ou des centaines de plantes peuvent être nécessaire pour atteindre la quantité cible de produit isolé. S’infiltrer dans des feuilles individuelles à la main (à l’aide d’une seringue inutile) est exigeante sur le plan opérationnel et souvent trop longues, rendant cette méthode impraticable pour l’intensification systématique. Infiltration sous vide offre des avantages par infiltration de la main, car il ne dépend pas du niveau de compétence de l’opérateur et permet l’infiltration d’une surface plus grande de la surface foliaire. Cette procédure est utilisée commercialement pour la production à grande échelle des protéines pharmaceutiques14. Ce protocole utilise un appareil facile à reproduire infiltration sous vide, qui peut être construit à partir des pièces disponibles dans le commerce. Cela permet l’infiltration simultanée de jusqu'à 4 plantes, offrant rapide et pratique avec infiltration de centaines de plantes dans un court laps de temps (Figure 2 a -2 b). L’appareil d’infiltration sous vide est constitué d’un four sous vide qui constitue la chambre de l’infiltration (Figure 2f). Le four est relié à une pompe via un réservoir vide. Ceci réduit considérablement le temps nécessaire pour atteindre le vide désiré dans la chambre de l’infiltration. Plantes sont sécurisés dans un support sur mesure et inversés dans un bain d’eau en acier inoxydable de 10 L rempli d’a. tumefaciens suspension (Figure 2 a -2C). Immersion complète des parties aériennes des plantes est importante pour l’infiltration efficace. L’eau du bain est alors placé dans la chambre de l’infiltration (Figure 2d -2e) et le vide appliqué pour dessiner l’air dans les espaces interstitiels de la feuille. Une fois que la pression a été réduite de 880 mbar (un processus qui prend environ 1 min) la chambre de l’infiltration est ramenée rapidement à la pression atmosphérique 20-30 s en ouvrant la vanne d’entrée du four, après quoi l’infiltration est terminée.
Cinq jours après l’infiltration le matériel végétal est prêt pour l’extraction ultérieure et de récolte et d’isolation du produit désiré. De ce point, le processus est tout simplement un des produit naturel extraction et purification de matériel foliaire, un flux de travail qui est familière à un chimiste de produit naturel. 15il existe différentes méthodes pour l’extraction initiale et purification ultérieure. Le choix le plus approprié des méthodes et les conditions exactes utilisées dépend fortement les propriétés chimiques particulières du composé d’intérêt, en plus de la disponibilité de compétences et/ou de matériel. Il n’est pas possible d’inclure dans le présent protocole, une méthode totalement généralisable, étape par étape pour la transformation en aval de matériel foliaire des plantes récoltées au produit isolé qui pourrait être suivi aveuglément pour n’importe quel produit de triterpène d’intérêt, ne serait pas approprié tenter de le faire. Toutefois, ce protocole donnera un aperçu du flux de base utilisé dans notre laboratoire et certaines méthodes pour les premiers stades du processus, qui, selon notre expérience, sont sont avérés généralisables pour produits de triterpène aglycone plus oxygénés. Cela inclut deux techniques relativement rares, nommément Pressurized Solvent Extraction (PSE) et une méthode en phase hétérogène commode pour l’enlèvement de la chlorophylle à l’aide d’une résine échangeuse d’ions fortement basiques.
PSE est une technique très efficace pour l’extraction de petites molécules organiques des matrices solides. Les extractions sont effectuées sous pression (env. 100-200 bar), le principal avantage est la possibilité d’utiliser allégé des températures excédant l’ébullition point du solvant d’extraction. Cela peut réduire considérablement le temps et la quantité de solvant nécessaire pour obtenir une extraction exhaustive, par rapport aux autres techniques de solvants chauds comme simple reflux ou Soxhlet extractions16. Instruments de PSE-comptoir commerciales sont disponibles, qui utilisent des cellules interchangeables extraction et solvant automatisé de manipulation, de chauffage et surveillance. Ce qui rend cette technique extrêmement pratique. C’est aussi sans doute moins dangereux, en particulier pour les opérateurs ayant une expérience de chimie pratique limitée.
Saponification des extraits de feuilles brutes sous reflux suivie de séparation liquide/liquide est une technique courante pour les prélèvements massifs des chlorophylles avant purification ultérieure ou d’analyse. Toutefois, cela peut souvent être opérationnel exigeant sur plus grandes échelles. En outre, la détection de l’interface, ou la perte de produit dû à la formation d’émulsions peut être problématique. L’utilisation de résines échangeuses d’ions fortement basiques pour effectuer l’hydrolyse phase hétérogène peut constituer une alternative commode. La partie pigmentée de la chlorophylle hydrolysée reste collée à la résine et peut être simplement éliminée par filtration. Ce protocole utilise une adaptation de l’échelle préparative d’une procédure analytique précédemment rapporté17 qui utilise une résine échangeuse d’ions base disponible dans le commerce.
Ci-dessous, nous décrivons un protocole détaillé et rapid pour la production de l’échelle préparative de triterpènes utilisant cette plate-forme à base de plantes. Ce protocole est utilisé régulièrement dans notre laboratoire pour préparer des dizaines ou des centaines de milligrammes de produit triterpéniques isolés pour applications une telle caractérisation par spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN), et/ou approfondir dans fonctionnel dosages.

<table><tbody><tr><td>GC-MS instrument</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler suitable for performing PCR reactions</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Gel electrophoresis apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Adjustable air displacement micropipettes (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Wide top liquid nitrogen carrier (size: 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop microcentrifuge (Capacity: 24 x 1.5/2mL, Max. speed: =/&gt; 15000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Benchtop centrifuge (Capacity: 20 x 50 mL, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Large Floor-standing centrifuge (Capacity: 4 x 1L, Max. speed: =/&gt; 4000 rpm)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Standing incubator</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator (Flask Clamp sizes: 10 mL, 50 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge bottles (1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum infiltration apparatus</td><td>bespoke</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>9 x 9 cm plant pots</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Freeze drying apparatus (=/&gt; 8 litre condenser capacity)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Buchi SpeedExtractor 914 with 120 mL extraction cells (PSE instrument)</td><td>Buchi</td><td>SpeedExtractor E-914</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator apparatus</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Evaporation flasks (Sizes: 100 mL, 500 mL, 1 L, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Duran bottles (Sizes: 1 L, 10 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Conical flasks (Sizes 100 mL, 2 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Spatulas (assorted sizes)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance (5 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Balance (2 figures)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Measuring cylinders (10 mL, 100 mL, 1 L)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>A -80 freezer</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage Isolera instrument with 250 mL collection rack and bottles (automated flash chromatography instrument</td><td>Biotage</td><td>ISO-1EW</td><td></td></tr><tr><td>Safety glasses</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Lab coat</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micropipette tips (Sizes : 1000 &amp;micro;L, 200 &amp;micro;L, 100 &amp;micro;L, 20 &amp;micro;L, 10 &amp;micro;L, and 2 &amp;micro;L )</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes (Size: 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes (Sizes: 15 mL, 50 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable Transfer pipettes (size 2 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Petri dishes (Size: 100 mL)</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Biotage&amp;reg; SNAP KP-SIL 100 g flash cartridges</td><td>Biotage</td><td>FSK0-1107-0100</td><td></td></tr><tr><td>HPLC vials (1 mL), vial inserts and caps</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Disposable purple nitrile gloves</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Top filter for E-914, cellulose</td><td>Buchi</td><td>51249</td><td></td></tr><tr><td>Bottom filter for E-916 / 914, glass fiber</td><td>Buchi</td><td>11055932</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quartz sand, 0.3 - 0.9 mm</td><td>Buchi</td><td>37689</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (diatomaceous earth)</td><td>Simga-Alrich</td><td>22140-1KG-F</td><td></td></tr><tr><td>Silica gel 60 (0.040 -0.0063 mm)</td><td>Merck</td><td>1.09385.5000</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)-ethanesulphonic acid</td><td>Melford</td><td>B2002</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Simga-Alrich</td><td>208337-100G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Simga-Alrich</td><td>60377-1KG</td><td></td></tr><tr><td>3&amp;rsquo;5&amp;rsquo;-dimethoxy-4&amp;rsquo;-acetophenone (acetosyringone)</td><td>Simga-Alrich</td><td>D134406-1G</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60836</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin sulfate</td><td>Gibco</td><td>11815-032</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Simga-Alrich</td><td>S6501-100G</td><td></td></tr><tr><td>Gentamycin</td><td>MP biomedicals</td><td>190057</td><td></td></tr><tr><td>Agarose LE gel</td><td>Melford</td><td>MB1203</td><td></td></tr><tr><td>LB broth Millar</td><td>Simga-Alrich</td><td>L3522-250G</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Simga-Alrich</td><td>A5306-250G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>S5886-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Simga-Alrich</td><td>P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Alrich</td><td>M2773-500G</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Alrich</td><td>G7021-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ambersep&amp;reg;&amp;nbsp;900 hydroxide (basic ion exchange resin)</td><td>Sigma-Alrich</td><td>06476-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher</td><td>H/0406/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl acetate</td><td>Fisher</td><td>E/0900/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>Fisher</td><td>D/1852/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher</td><td>M/4056/PB17</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Alrich</td><td>E7637-1G</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>20821-330</td><td></td></tr><tr><td>Milli-Q water</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F1 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>Levington F2 Compost</td><td>any</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit (Plasmid purification kit).</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>NEB 5-alpha Competent E. coli</td><td>Supplier New England Biolabs Ltd</td><td>C2987I</td><td></td></tr><tr><td>pEAQ-HT-DEST1 vector</td><td>Lomonossoff laboratory John Innes Center</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>pDONR207</td><td>Thermo-Fisher</td><td>pDONR207</td><td></td></tr><tr><td>A. tumefaciens LBA4404</td><td>Thermo-Fisher</td><td>18313015</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY LR CLONASE(tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11791020</td><td></td></tr><tr><td>GATEWAY BP CLONASE (tm) II ENZYME MIX (site-specific recombination cloning protocol)</td><td>Thermo-Fisher</td><td>11789020</td><td></td></tr><tr><td>GO TAQ G2 GREEN MASTER MIX</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M7822</td><td></td></tr><tr><td>PHUSION HIGH FIDELITY DNA POLYMERASE</td><td>New England Biolabs Ltd</td><td>M0530S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP SET 100mm</td><td>Thermo-Fisher</td><td>10297018</td><td></td></tr><tr><td>RNEASY PLANT MINI KIT</td><td>Qiagen Ltd</td><td>74904</td><td></td></tr><tr><td>RQ1 RNASE-FREE DNASE</td><td>Promega UK Ltd</td><td>M6101</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen SuperScript III First-Strand Synthesis System</td><td>Fisher</td><td>10308632</td><td></td></tr><tr><td>Trytone</td><td>Sigma-Alrich</td><td>T7293-250G</td><td></td></tr><tr><td>Nicotiana benthamiana seeds</td><td>any reputable supplier</td><td>n/a</td><td></td></tr></tbody></table>

transient expression in nicotiana benthamiana leaves for triterpene production at a preparative scale

Les triterpènes sont parmi les plus importantes et la plupart des structures diverses familles des produits naturels. De nombreux dérivés triterpéniques montrent possèdent une activité biologique en médecine pertinente. Toutefois, jusqu'à présent ce potentiel n’est pas traduite par une pléthore de médicaments dérivés triterpéniques à la clinique. Il s’agit sans aucun doute (au moins partiellement) une conséquence de l’accès limité de synthèse pratique pour cette classe de composés, un problème qui peut étouffer l’exploration des relations structure-activité et mise au point de conduire candidats par traditionnel médicinales workflows de chimie. Malgré leur immense diversité, triterpènes sont tous dérivés d’un seul précurseur linéaire, 2, 3-oxidosqualene. L’expression hétérologue transitoire des enzymes biosynthétiques dans N. benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de triterpène de grande valeur qui ne sont pas naturellement produites par cet hôte. Il y a un moyen simple et efficace de réaliser l’expression transitoire dans N. benthamianaagro-infiltration. Le processus implique l’infiltration des feuilles de la plante avec une suspension d' Agrobacterium tumefaciens transportant les exigences d’expression d’intérêt. Co l’infiltration d’une supplémentaire a. tumefaciens souche transportant une construction expression codant une enzyme qui augmente la fourniture précurseur sensiblement augmente les rendements. Après une période de cinq jours, le matériel infiltrés feuilles peut être récolté et transformé pour extraire et isoler l’ou les produits qui en résultent triterpène. Il s’agit d’un processus qui est fiable et linéairement évolutif, simplement en augmentant le nombre de plantes utilisées pour l’expérience. Ici est décrit un protocole pour la production rapide d’échelle préparative des triterpènes utilisant cette plate-forme à base de plantes. Le protocole utilise un appareil facile à reproduire infiltration sous vide, qui permet l’infiltration simultanée de jusqu'à quatre usines, ce qui permet une infiltration avec des centaines de plantes dans un court laps de temps.

Les rendements isolés typiques dépendent de la combinaison d’enzyme/enzymes sous enquête, la stabilité chimique du composé cible et comment contester le processus de purification a été. Nous avons déjà rapporté des rendements isolés de β-amyrine dérivés de nos expériences de biosynthèse combinatoire variant de 0,12 à 3,87 mg par gramme de poudre de feuilles de N. benthamiana à sec. Ces composés variaient grandement dans le niveau d’oxydation et inclus des combinaisons non naturels d’enzymes (Figure 3)8. Ce protocole est utilisé régulièrement dans notre laboratoire pour produire des dizaines ou des centaines de milligrammes de produit purifié pour la caractérisation par spectroscopie RMN et essais fonctionnels en aval. Nous avons aussi démontré l’utilité préparative de cette plate-forme de production de 0,8 g de l’échafaudage de triterpène β-amyrine à une pureté supérieure à 98 %. Cette expérience utilisé 459 plantes et représente un rendement isolé de 3,3 mg par gramme de sec N. benthamiana feuille poudre8.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig1.jpg"> Figure 1 : Résumé schématique. Représentation schématique du processus exploitant l’expression transitoire des enzymes biosynthétiques dans N. benthamiana feuille de détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production préparative de nouveaux produits de haute valeur triterpène. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig2.jpg"> Figure 2 : vide construction infiltré et processus. un) Ad hoc plante porte une aile détachée. b) Bespoke plante porte aile. c) Inversion et la submersion des plantes. d) d’Insertion de la baignoire de l’infiltration. e) Infiltration bain en place au sein de la chambre de l’infiltration. f) Complete infiltré sous vide : pompe à vide (1) (2) raccordement de pompe à vide à vanne aspiration réservoir vide (3) réservoir (4) la connexion entre le réservoir vide et la soupape d’admission infiltration chambre Air (5) Manomètre (6) (7) Réservoir de vide infiltration chambre (8). g) représentant les feuilles d’une plante infiltrée par une construction de l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) après cinq jours après l’infiltration de croissance. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58169/58169fig3.jpg"> Figure 3 : signalé auparavant des résultats représentatifs pour la production préparative de β-amyrine dérivés utilisant ce protocole8. Ce tableau est trié par rendements isolés. Les colonnes sont conditionnellement formatés avec indication de la couleur de la valeur relative. Rouge = haut, vert = low (jaune bien intermédiaire). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58169/58169fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

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Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

Expression transitoire de Nicotiana Benthamiana quitte pour triterpène Production à l’échelle préparative

L’expression hétérologue transitoire des enzymes biosynthétiques dans les feuilles de Nicotiana benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de haute valeur triterpène. Ici est décrit un protocole détaillé pour la production à l’échelle préparative rapide (5 jours) de triterpènes et analogues utilisant cette plate-forme puissante à base de plantes.

The triterpenes are one of the largest and most structurally diverse families of plant natural products. Many triterpene derivatives have been shown to ...

transient-expression-nicotiana-benthamiana-leaves-for-triterpene

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Transient Expression in Nicotiana Benthamiana Leaves for Triterpene Production at a Preparative Scale

17.2K vues.  John Innes Centre. L’expression hétérologue transitoire des enzymes biosynthétiques dans les feuilles de Nicotiana benthamiana peut détourner les fournitures endogènes de 2,3-oxidosqualene vers la production de nouveaux produits de haute valeur triterpène. Ici est décrit un protocole détaillé pour la production à l’échelle préparative rapide (5 jours) de triterpènes et analogues utilisant cette plate-forme puissante à base de plantes.

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Transient Gene Expression in Tobacco using Gibson Assembly and the Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately using complex regulatory strategies including differential promoters and/or signal sequences. Metabolic engineers and synthetic biologists interested in targeting enzymes to a particular organelle are faced with a challenge: For a protein that is to be localized to more than one organelle, the engineer must clone the same gene multiple times. This work presents a solution to this strategy: harnessing alternative splicing of mRNA. This technology takes advantage of established chloroplast and peroxisome targeting sequences and combines them into a single mRNA that is alternatively spliced. Some splice variants are sent to the chloroplast, some to the peroxisome, and some to the cytosol. Here the system is designed for multiple-organelle targeting with alternative splicing. In this work, GFP was expected to be expressed in the chloroplast, cytosol, and peroxisome by a series of rationally designed 5&#8217; mRNA tags. These tags have the potential to reduce the amount of cloning required when heterologous genes need to be expressed in multiple subcellular organelles. The constructs were designed in previous work11, and were cloned using Gibson assembly, a ligation independent cloning method that does not require restriction enzymes. The resultant plasmids were introduced into Nicotiana benthamiana epidermal leaf cells with a modified Gene Gun protocol. Finally, transformed leaves were observed with confocal microscopy.

This work describes a novel method for selectively targeting subcellular organelles in plants, assayed using the BioRad Gene Gun.

Transient expression des gènes dans le tabac en utilisant Assemblée Gibson et le Gene Gun

In order to target a single protein to multiple subcellular organelles, plants typically duplicate the relevant genes, and express each gene separately ...

Recherche

Environnement

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture organisms, such as hyphae-building fungi and anaerobic bacteria, has hastened the use of recombinant technologies in this field. Plant expression methods are a desirable system for large-scale production of enzymes and other industrially useful proteins. Herein, methods for the transient expression of a fungal endoglucanase, Trichoderma reesei Cel5A, in Nicotiana tabacum are demonstrated. Successful protein expression is shown, monitored by fluorescence using an mCherry-enzyme fusion protein. Additionally, a set of basic tests are used to examine the activity of transiently expressed T. reesei Cel5A, including SDS-PAGE, Western blotting, zymography, as well as&#160;fluorescence and dye-based substrate degradation assays. The system described here can be used to produce an active cellulase in a short time period, so as to assess the potential for further production in plants through constitutive or inducible expression systems.

Expression of Recombinant Cellulase Cel5A from Trichoderma reesei in Tobacco Plants

Tobacco plants were used to produce a fungal cellulase, TrCel5A, via a transient expression system. The expression could be monitored using a fluorescent fusion protein, and the protein activity was characterized post-expression.

Expression de recombinant cellulase Cel5A de<em&gt; Trichoderma reesei</em&gt; Dans les usines de tabac

Cellulose degrading enzymes, cellulases, are targets of both research and industrial interests. The preponderance of these enzymes in difficult-to-culture ...

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug used to treat depression and anxiety by binding to the serotonin transporter with high-affinity, blocking serotonin reuptake. Here we report an efficient procedure and a set of tools to stabilize, express, purify, and crystallize serotonin transporter-antibody complexes bound to S-citalopram and other antidepressants. Mutations which stabilize the serotonin transporter were identified using an S-citalopram binding assay. Serotonin transporter expressed in baculovirus-transduced HEK293S GnTI- cells, was reconstituted into proteoliposomes and used to raise high-affinity antibodies. We have developed a strategy to discover antibodies that are useful for structural studies. A straightforward approach for the expression of antibody fragments in Sf9 cells has also been established. Transporter-antibody complexes purified using this procedure are well-behaved and readily crystallize, producing complexes with S-citalopram that diffract X-rays to 3-4 &#197; resolution. The strategies developed here can be utilized to determine the structure of other challenging membrane proteins.

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

This manuscript describes how to screen for thermostabilizing mutations, purify the human serotonin transporter, generate high affinity antibodies, and crystallize the serotonin transporter-antibody complex bound to the antidepressant drug S-citalopram. This protocol can be adapted to the study of other challenging membrane transporters, receptors, and channels.

Thermostabilisation, Expression, purification et cristallisation du Serotonin Human Transporter Bound to<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Biochimie

A Customizable Approach for the Enzymatic Production and Purification of Diterpenoid Natural Products

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological functions in developmental processes, interorganismal interactions, and environmental adaptation. Due to these various bioactivities, many diterpenoids are also of economic importance as pharmaceuticals, food additives, biofuels, and other bioproducts. Advanced genomics and biochemical approaches have enabled a rapid increase in the knowledge of diterpenoid-metabolic genes, enzymes, and pathways. However, the structural complexity of diterpenoids and the narrow taxonomic distribution of individual compounds in often only a single species remain constraining factors for their efficient production. Availability of a broader range of metabolic enzymes now provide resources for producing diterpenoids in sufficient titers and purity to facilitate a deeper investigation of this important metabolite group. Drawing on established tools for microbial and plant-based enzyme co-expression, we present an easily operated and customizable protocol for the enzymatic production of diterpenoids in either Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, and the purification of desired products via silica chromatography and semi-preparative HPLC. Using the group of maize (Zea mays) dolabralexin diterpenoids as an example, we highlight how modular combinations of diterpene synthase (diTPS) and cytochrome P450 monooxygenase (P450) enzymes can be used to generate different diterpenoid scaffolds. Purified compounds can be used in various downstream applications, such as metabolite structural analyses, enzyme structure-function studies, and in vitro and in planta bioactivity experiments.

Here we present easy to use protocols for producing and purifying diterpenoid metabolites through the combinatorial expression of biosynthetic enzymes in Escherichia coli or Nicotiana benthamiana, followed by chromatographic product purification. The resulting metabolites are suitable for various studies including molecular structure characterization, enzyme functional studies, and bioactivity assays.

Une approche personnalisable pour la production et la purification enzymatiques des produits naturels Diterpenoid

Diterpenoids form a diverse class of small molecule natural products that are widely distributed across the kingdoms of life and have critical biological ...

Efficient Agroinfiltration of Plants for High-level Transient Expression of Recombinant Proteins

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing worldwide demand for pharmaceuticals due to its limited scalability and high cost. Plants have shown to be one of the most promising alternative pharmaceutical production platforms that are robust, scalable, low-cost and safe. The recent development of virus-based vectors has allowed rapid and high-level transient expression of recombinant proteins in plants. To further optimize the utility of the transient expression system, we demonstrate a simple, efficient and scalable methodology to introduce target-gene containing Agrobacterium into plant tissue in this study. Our results indicate that agroinfiltration with both syringe and vacuum methods have resulted in the efficient introduction of Agrobacterium into leaves and robust production of two fluorescent proteins; GFP and DsRed. Furthermore, we demonstrate the unique advantages offered by both methods. Syringe infiltration is simple and does not need expensive equipment. It also allows the flexibility to either infiltrate the entire leave with one target gene, or to introduce genes of multiple targets on one leaf. Thus, it can be used for laboratory scale expression of recombinant proteins as well as for comparing different proteins or vectors for yield or expression kinetics. The simplicity of syringe infiltration also suggests its utility in high school and college education for the subject of biotechnology. In contrast, vacuum infiltration is more robust and can be scaled-up for commercial manufacture of pharmaceutical proteins. It also offers the advantage of being able to agroinfiltrate plant species that are not amenable for syringe infiltration such as lettuce and Arabidopsis. Overall, the combination of syringe and vacuum agroinfiltration provides researchers and educators a simple, efficient, and robust methodology for transient protein expression. It will greatly facilitate the development of pharmaceutical proteins and promote science education.

Plants offer a novel system for the production of pharmaceutical proteins on a commercial scale that is more scalable, cost-efficient and safe than current expression paradigms. In this study, we report a simple and convenient, yet scalable approach to introduce target-gene containing Agrobacterium tumefaciens into plants for protein transient expression.

Agroinfiltration efficace des plantes pour l&#39;expression transitoire de haut niveau de protéines recombinantes

Mammalian cell culture is the major platform for commercial production of human vaccines and therapeutic proteins. However, it cannot meet the increasing ...

Biologie

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short period of time. However, this technology is only just beginning to be applied to large-scale production as many technological obstacles to scale up are now being overcome. Here, we demonstrate a simple and reproducible method for industrial-scale transient protein production based on vacuum infiltration of Nicotiana plants with Agrobacteria carrying launch vectors. Optimization of Agrobacterium cultivation in AB medium allows direct dilution of the bacterial culture in Milli-Q water, simplifying the infiltration process. Among three tested species of Nicotiana, N. excelsiana (N. benthamiana &#215; N. excelsior) was selected as the most promising host due to the ease of infiltration, high level of reporter protein production, and about two-fold higher biomass production under controlled environmental conditions. Induction of Agrobacterium harboring pBID4-GFP (Tobacco mosaic virus-based) using chemicals such as acetosyringone and monosaccharide had no effect on the protein production level. Infiltrating plant under 50 to 100 mbar for 30 or 60 sec resulted in about 95% infiltration of plant leaf tissues. Infiltration with Agrobacterium laboratory strain GV3101 showed the highest protein production compared to Agrobacteria laboratory strains LBA4404 and C58C1 and wild-type Agrobacteria strains at6, at10, at77 and A4. Co-expression of a viral RNA silencing suppressor, p23 or p19, in N. benthamiana resulted in earlier accumulation and increased production (15-25%) of target protein (influenza virus hemagglutinin).

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Transient protein production in Nicotiana plants based on vacuum infiltration with Agrobacteria carrying launch vectors (Tobacco mosaic virus-based) is a rapid and economic approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins. We simplified the procedure and improved target accumulation by optimizing conditions of bacteria cultivation, selecting host species, and co-introducing RNA silencing suppressors.

Optimisation et l&#39;utilisation des<em&gt; Agrobacterium</em&gt; Médiée par la production de protéines transitoire dans<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

A Comparative Analysis of Recombinant Protein Expression in Different Biofactories: Bacteria, Insect Cells and Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the flexible, low-cost production of high-quality, bioactive products.
In this study, we compared the expression of a target human recombinant protein in traditional fermenter-based cell cultures (bacterial and insect) with plant-based expression systems, both transient and stable.
For each platform, we described the set-up, optimization and length of the production process, the final product quality and the yields and we evaluated provisional production costs, specific for the selected target recombinant protein.
Overall, our results indicate that bacteria are unsuitable for the production of the target protein due to its accumulation within insoluble inclusion bodies. On the other hand, plant-based systems are versatile platforms that allow the production of the selected protein at lower-costs than Baculovirus/insect cell system. In particular, stable transgenic lines displayed the highest-yield of the final product and transient expressing plants the fastest process development. However, not all recombinant proteins may benefit from plant-based systems but the best production platform should be determined empirically with a case-by-case approach, as described here.

In this study the expression of a target human recombinant protein in different production platforms was compared. We focused on traditional fermenter-based cultures and on plants, describing the set-up of each system and highlighting, on the basis of the reported results, the inherent limits and advantages for each platform.

Une analyse comparative des recombinant expression des protéines dans différents bio-usines: bactéries, cellules d&#39;insectes et Plant Systems

Plant-based systems are considered a valuable platform for the production of recombinant proteins as a result of their well-documented potential for the ...

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel protein-protein interaction pairs and monitoring protein interaction dynamics are of particular interest for revealing how plants respond to environmental factors and/or developmental signals. A plethora of approaches have been developed to examine protein-protein interactions, either in vitro or in vivo. Among them, the recently established luciferase complementation imaging (LCI) assay is the simplest and fastest method for demonstrating in vivo protein-protein interactions. In this assay, protein A or protein B is fused with the amino-terminal or carboxyl-terminal half of luciferase, respectively. When protein A interacts with protein B, the two halves of luciferase will be reconstituted to form a functional and active luciferase enzyme. Luciferase activity can be recorded with a luminometer or CCD-camera. Compared with other approaches, the LCI assay shows protein-protein interactions both qualitatively and quantitatively. Agrobacterium infiltration in Nicotiana benthamiana leaves is a widely used system for transient protein expression. With the combination of LCI and transient expression, these approaches show that the physical interaction between COP1 and SPA1 was gradually reduced after jasmonate treatment.

Luciferase Complementation Imaging Assay in Nicotiana benthamiana Leaves for Transiently Determining Protein-protein Interaction Dynamics

This manuscript describes an easy and rapid experimental procedure for determining protein-protein interactions based on the measurement of luciferase activity.

Analyse de l’imagerie de la complémentation de luciférase dans les feuilles de Nicotiana benthamiana pour transitoirement déterminant la dynamique Interaction protéine-protéine

Protein-protein interactions are fundamental mechanisms for relaying signal transduction in most cellular processes; therefore, identification of novel ...

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing need in developing efficient methods for recombinant antibody production. As of 2019, there were more than 70 FDA-approved monoclonal antibodies, and there is exponential growth potential. Despite their promise, limiting factors for widespread use are manufacturing costs and complexity. Potentially, plants offer low-cost, safe, and easily scalable protein manufacturing&#160;strategies. Plants like Nicotiana benthamiana not only can correctly fold and assemble complex mammalian proteins but also can add critical post-translational modifications similar to those offered by mammalian cell cultures. In this work, by using native GFP and an acid-stable variant of green fluorescent protein (GFP) fused to human monoclonal antibodies, we were able to visualize the entire transient antibody expression and purification process from N. benthamiana plants. Depending on the experiment&#39;s purpose, native GFP fusion can ensure easier visualization during the expression phase in the plants, while acid-stable GFP fusion allows for visualization during downstream processing. This scalable and straightforward procedure can be performed by a single researcher to produce milligram quantities of highly pure antibody or antibody fusion proteins in a matter of days using only a few small plants. Such a technique can be extended to the visualization of any type of antibody purification process and potentially many other proteins, both in plant and other expression systems. Moreover, these techniques can benefit virtual instructions and be executed in a teaching laboratory by undergraduate students possessing minimal prior experience with molecular biology techniques, providing a foundation for project-based exploration with real-world applications.

Production of IgG Fusion Proteins Transiently Expressed in Nicotiana benthamiana

We describe here a simple method for expression, extraction, and purification of recombinant human IgG fused to GFP in Nicotiana benthamiana. This protocol can be extended to purification and visualization of numerous proteins that utilize column chromatography. Moreover, the protocol is adaptable to the in-person and virtual college teaching laboratory, providing project-based exploration.

Production de protéines de fusion IgG exprimées transitoirement à Nicotiana benthamiana

High demand for antibodies as therapeutic interventions for various infectious, metabolic, autoimmune, neoplastic, and other diseases creates a growing ...

Extraction et purification efficaces de GFP-His à partir de feuilles de N. benthamiana

Apoplast-Extraction Based Method to Improve the Purity of Plant Produced Recombinant Protein

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from plants is one of the most critical steps in the production process. Typically, proteins were purified from total soluble proteins (TSP), and the presence of miscellaneous intracellular proteins and cytochromes poses challenges for subsequent protein purification steps. Moreover, most therapeutic proteins like antigens and antibodies are secreted to obtain proper glycosylation, and the presence of incompletely modified proteins leads to inconsistent antigen or antibody structures. This work introduces a more effective method to obtain highly purified recombinant proteins from the plant apoplastic space. The recombinant Green fluorescent protein (GFP) is engineered to be secreted into the apoplast of Nicotiana benthamiana and is then extracted using an infiltration-centrifugation method. The GFP-His from the extracted apoplast is then purified by nickel affinity chromatography. In contrast to the traditional methods from TSP, purification from the apoplast produces highly purified recombinant proteins. This represents an important technological improvement for plant production systems.

Pleins feux sur l’auteur : Optimisation de l’extraction de la protéine d’apoplaste pour une récupération efficace des protéines recombinantes à partir de cellules végétales

The purification of recombinant proteins from plant systems is usually challenged by plant proteins. This work provides a method to effectively extract and purify a secreted recombinant protein from the apoplast of Nicotiana benthamiana.

Méthode basée sur l’extraction Apoplast pour améliorer la pureté d’une protéine recombinante produite par une plante  

Plants are a newly developing eukaryotic expression system being explored to produce therapeutic proteins. Purification of recombinant proteins from ...

Expression transitoire de Nicotiana Benthamiana quitte pour triterpène Production à l’échelle préparative

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