La lignée cellulaire P19 est connue pour se différencier en neurones. Cependant, le protocole pour la différenciation neuronale de la lignée cellulaire P19 est parfois compliqué. Cette méthode nous permet d’effectuer l’expérience névrogène d’une manière conviviale et d’élargir la possibilité de l’utilisation de la lignée cellulaire P19 pour l’avenir.
Pour commencer, maintenir les cellules P19 dans le milieu d’entretien, composé de DMEM, avec 4,5 grammes par litre de glucose, complétée par 10% sérum bovin fœtal, 100 unités par pénicilline millilitre, et 100 unités par streptomiycine millilitre. Incuber la culture cellulaire dans un environnement de 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone jusqu’à ce que les cellules soient environ 80% confluent. Retirez le milieu usé du flacon de culture cellulaire et lavez les cellules avec deux millilitres de calcium et de PBS sans magnésium.
Ajouter un millilitre de 0,25% trypsine-EDTA pour couvrir complètement la monomeuse des cellules et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à trois minutes. Au microscope, vérifiez si toutes les cellules sont détachées. Resuspendez les cellules en neuf millilitres de support d’entretien afin de neutraliser la trypsine.
Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse à 200 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes pour pelleter les cellules. Ensuite, aspirez le surnatant sans déranger la pastille. Resuspendez la pastille en 10 millilitres de milieu d’entretien frais et utilisez un compteur cellulaire pour déterminer le numéro de cellule selon les instructions du fabricant.
Grainez 20 000 cellules par centimètre carré dans un nouveau flacon T-25 et ajoutez jusqu’à 10 millilitres de milieu d’entretien. Incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à trois jours. Pour commencer la digestion de la trypsine, aspirez d’abord lentement le supernatant et lavez les cellules avec deux millilitres de calcium et de PBS sans magnésium.
Ensuite, ajoutez un millilitre de 0,25% trypsine EDTA aux cellules et incubez-les à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à trois minutes. Après l’incubation, pour neutraliser la trypsine, resuspendre les cellules en neuf millilitres de milieu de différenciation, composé de DMEM avec un taux élevé de glucose et complété par 5% sérum bovin fœtal, 100 unités par pénicilline millilitre, et 100 unités par streptomie millilitre. Transférer les cellules dans un tube de 15 millilitres et une centrifugeuse à 200 fois G et à température ambiante pendant cinq minutes pour pelleter les cellules.
Ensuite, aspirez lentement le supernatant et réutilisez la pastille en un millilitre de milieu de différenciation frais sans RA. Utilisez un compteur cellulaire pour déterminer le numéro de cellule selon les instructions du fabricant. Pour la génération globale, commencez par ajouter 10 millilitres de milieu de différenciation, complétés par cinq microlitres de PR à un plat de culture non traité de 100 millilitres. Ensemencer un million de cellules dans le plat de culture et incuber à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux jours afin de favoriser la formation d’agrégats.
Après l’incubation, avec une pipette de 10 millilitres, aspirez le milieu contenant les agrégats et transférez-le dans un tube de 15 millilitres à température ambiante. Attendez 1,5 minute que les agrégats s’installent au fond, puis jetez le surnatant. Ajouter 10 millilitres de milieu de différenciation fraîche complété par 0,5 micromolaire RA. Ensemencer délicatement les agrégats dans un nouveau plat de culture non traité de 100 millimètres et incuber à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant deux jours.
Pour commencer, utilisez une pipette de 10 millilitres pour transférer les agrégats cellulaires dans un tube de 15 millilitres. Attendez 1,5 minute à température ambiante pour que les agrégats se déposent au fond, puis jetez le surnatant. Laver les agrégats avec du sérum et du DMEM sans antibiotiques.
Attendez que les agrégats cellulaires s’installent au fond, jetez le supernatant et ajoutez deux millilitres de 0,25% trypsine EDTA. Incuber le tube dans un bain d’eau à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes, en tapant toutes les deux minutes pour garder les cellules en suspension. Ensuite, ajoutez quatre millilitres de milieu d’entretien afin d’arrêter l’activité de la trypsine et pipette de haut en bas 20 fois à l’aide d’une pipette d’un millilitre.
Enfin, centrifuger les cellules à 200 fois G et température ambiante pendant cinq minutes. Retirez le supernatant et resuspendez la pastille cellulaire en cinq millilitres de milieu d’entretien. Utilisez un compteur cellulaire pour déterminer le numéro de cellule et procéder au placage des cellules.
Pour plaquer les cellules, ajoutez d’abord trois millilitres par puits de milieu d’entretien à une plaque de culture de six puits. Ensuite, ensemencer les cellules à une densité de 500 000 par puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Ensemencer les cellules sur des verres de couverture dans une plaque de culture de six puits. Quand ils atteignent 20% de confluence, procéder à l’immunostaining avec anticorps Anti-MAP2. Puis, isoler l’ARN, et effectuer la transcription inverse PCR pour MAP2, NueN, OCT4, NANOG, et un GAPDH.
Dans cette étude, une méthode simplifiée de différenciation neuronale est introduite. La lignée cellulaire P19 est cultivé dans un plat de culture non traité avec 5%FBS et 0,5 micromolar RA. Après quatre jours, les agrégats cellulaires sont dissociés avec de la trypsine et ensemencés sur une plaque de culture cellulaire adhérente pendant les quatre prochains jours. L’efficacité de cette méthode est évaluée par la comparaison entre l’analyse rtpcr de la lignée cellulaire P19 dans un état indifférencié et pendant la neurogenèse.
Les résultats montrent une diminution rapide de l’expression des gènes de pluripotence, tels que Oct4 et NANOG, et une augmentation de la réglementation des gènes marqueurs neurnomaux, tels que MAP2 et NeuN. Nous croyons que la méthode développée dans cette étude est simple et jouera un rôle dans l’élucidation des mécanismes moléculaires de la neurogenèse, ainsi que la maladie neurodégénérative.
