Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans l’évaluation des effets thérapeutiques des médicaments dans le domaine de l’endométriose, tels que les effets des composés anti-androgènes sur la taille des lésions endométriotiques. Le principal avantage de cette technique est que les effets des médicaments spécifiques peuvent être évalués dans des modèles animaux d’endométriose en temps réel, plutôt qu’au point final. Jessica Martinez, technicienne de mon laboratoire, ainsi que Viviana Bisbal et Nerea Marin, vétérinaires du Centro de Investigacion Principe Felipe, sont des collaborateurs proches de notre équipe.
Deux à trois jours avant la chirurgie de l’implant, transférez des fragments de biopsie de tissu endométrial sain rincés en une boîte de Pétri de 10 centimètres contenant un milieu complet, et utilisez des scalpels pour hacher le tissu en morceaux en cubes de cinq à dix millimètres. À l’aide d’une micropipette, ajouter de 30 à 50 gouttes de microlitres de DMEM au fond d’un nouveau plat de culture de 10 centimètres, laissant suffisamment d’espace entre chaque goutte afin qu’elles n’entrent pas en contact les unes avec les autres. Lorsque toutes les gouttes ont été placées, utilisez une aiguille de seringue pour placer un seul morceau de fragment de tissu de biopsie dans chaque goutte.
Ensuite, ajoutez 100 à 200 microlitres d’adéno-mCherry fraîchement préparé à un puits d’une plaque de puits de 96 par fragment de tissu, plus trois puits avec DMEM sans adénovirus comme contrôle négatif. Ensuite, utilisez l’aiguille pour transférer un échantillon de tissu dans chaque puits de solution adéno-mChéry pour une incubation d’une nuit à 37 degrés Celsius et 5% de CO2. Le lendemain matin, placez la plaque sur un stade de microscope à fluorescence et utilisez un laser de 568 nanomètres pour vérifier les fragments pour un étiquetage optimal.
L’utilisation de la dilution appropriée de l’infection de l’adénovirus mCherry est essentielle pour une étiquetage efficace du tissu. Donc, pour déterminer la concentration appropriée, plusieurs pour la dilution mCherry, pour chaque expérience individuelle, doivent être évalués. Ensuite, transférez les fragments les plus brillants dans les puits individuels d’une nouvelle plaque de puits 96 contenant un milieu frais et complet.
Au moins sept jours après l’oophorectomie, décanter les fragments de tissu endométrial dans une boîte de Pétri, et confirmer un manque de réponse à la pincement des orteils chez un animal anesthésié et oophorectomisé. Avec la souris dans la position supine désinfecter la zone ventrale et faire une incision longitudinale de 1,5 centimètre dans l’abdomen. Séparez la peau du muscle et faites une deuxième incision de 1,5 centimètre dans le muscle pour accéder à la cavité péritonéale.
Tenant le bord gauche de la paroi musculaire abdominale avec des mini-forceps, pliez le muscle pour exposer la face intérieure du péritoine à l’extérieur de l’animal. Utilisez des mini-pinces à épiler pour tremper brièvement un implant endométrial dans l’adhésif cyanoacrylate n-butyl ester et fixer le fragment au péritoine. Lorsque l’adhésif est séché, placez un deuxième implant sur le côté contralatéral du péritoine comme il vient de le démontrer.
Utilisez une suture absorbable 6-0 pour fermer la couche musculaire et une suture 6-0 non absorbable pour fermer la peau. Nettoyez ensuite l’incision cutanée avec une solution antiseptique et placez l’animal dans la zone de récupération avec surveillance jusqu’à ce qu’il soit complètement couché. Pour l’imagerie fluorescente in vivo des fragments de tissu implantés, 24 à 48 heures après l’implantation, allumez le système d’imagerie in vivo, initialisez le logiciel et laissez la caméra CCD refroidir pendant quelques minutes.
Une fois l’instrument prêt, placez la première souris anesthésiée dans la cage du système d’imagerie in vivo, en position supine, avec la tête à l’intérieur d’un tubule relié à la machine d’anesthésie, et fermez le couvercle. Cliquez ensuite sur acquérir et enregistrer les cinq images qui en résultent. Pour quantifier la fluorescence in vivo, dans le logiciel d’analyse d’image approprié cliquez sur parcourir et sélectionnez le fichier d’intérêt non mélangé à analyser.
Une nouvelle fenêtre apparaîtra. Cliquez sur ajouter à la liste pour inclure tous les fichiers non mélangés de chaque animal à différents points de temps et cliquez sur la charge en groupe. Toutes les images doivent apparaître en une seule séquence.
Dans la fenêtre de palette d’outils, désélectionner la case à cocher à l’échelle individuelle pour ajuster toutes les images à la même échelle, et double clic sur une image de la séquence. Pour créer une région d’intérêt, dans la région des outils d’intérêt sélectionnez le contour et l’auto une options, et cliquez sur la forme du cercle pour placer le cercle au centre du signal fluorescent. Cliquez sur créer pour créer la région d’intérêt et copier et coller la région d’intérêt sur un fond où il n’y a pas de signal.
Cliquez ensuite sur mesurer les régions d’intérêt et sélectionnez toutes pour afficher les valeurs de l’intensité de fluorescence de chaque région et copier et coller ces valeurs dans une feuille de calcul. L’étiquetage des fragments endométrials est réalisé par infection par l’adénovirus conçu pour exprimer mCherry, une protéine qui émet la fluorescence dans la section proche infrarouge qui est sensiblement plus robuste que l’autofluorescence non infectée de tissu endométrial. Pendant la surveillance, en plus de la longueur d’onde de référence pour mCherry, des images fluorescentes sont prises avec différentes paires de filtres à longueur d’onde d’émission d’excitation.
Pour définir les profils caractéristiques d’émission des tissus fluorescents des lésions de l’arrière-plan, et l’autofluorescence émise par les tissus hôtes, les images de surveillance contenant la fluorescence brute émise par les animaux à chaque point de temps sont réunies, non normalisées, dans un seul fichier. Ensuite, la fluorescence n’est pas mélangée, normalisée et représentée comme une image de fausse couleur, et les régions d’intérêts correspondant à des signaux spécifiques de légion et d’arrière-plan sont automatiquement reconnues par le programme et quantifiées. La région d’arrière-plan de la signalisation d’intérêt est soustrayée de la région de la légion de signalisation d’intérêt.
Et les résultats de l’intensité à chaque point de temps sont normalisés par rapport au moment où l’intensité est maximale. Après plusieurs semaines de surveillance, les implants viables peuvent être récupérés pour une analyse plus approfondie en aval. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de sélectionner la concentration d’Ad-mCherry qui fournit le signal le plus brillant sans compromettre la viabilité du tissu.
Après cette procédure, les lésions peuvent être récupérées et utilisées pour étudier des paramètres distinctifs supplémentaires. Cette procédure est optimisée pour la surveillance non invasive des lésions humaines de xénogreffe d’endométriose. Cependant, il peut être facilement adapté pour évaluer les effets d’un médicaments spécifiques d’intérêt sur les sites d’une xénogreffe en temps réel.
