Nous utilisons ce protocole pour rechercher de nouveaux vaccins candidats contre la tuberculose, mais je peux être appliqué à d’autres maladies infectieuses. Par rapport aux modèles mammifères, cette méthode fournit une procédure rentable pour le dépistage préliminaire des nouveaux vaccins à base d’ADN. Hannaleena Piippo, technicienne de notre laboratoire, démontrera la procédure.
Pour commencer, placez le capillaire en verre dans la rainure en V dans la barre polaire et serrez légèrement le bouton de serrage. Déplacez le support à côté du filament et poussez doucement le capillaire à travers le filament et dans la barre polaire de l’autre côté du filament. Ensuite, serrez les boutons de serrage, réglez le verre de sécurité et appuyez sur le bouton de traction.
Après cela, placez les aiguilles sur un morceau d’adhésif réutilisable à l’intérieur d’une boîte de Pétri pour protéger les extrémités de l’aiguille. Tout d’abord, préparer le mélange d’injection à l’aide de 0,5 à 12 microgrammes de plasmide par dose. Préparer le volume approprié de mélange principal pour le nombre de poissons dans le groupe.
Placez l’aiguille capillaire sur le côté collant d’un morceau de ruban adhésif sur le support approprié. Ensuite, gouttelettes pipette de doses plasmides sur un morceau de film de laboratoire. Après cela, utilisez une pointe de chargement pour transférer les gouttes plasmides du film dans l’aiguille.
Pipette lentement et soigneusement pour éviter de pipetting bulles d’air dans l’aiguille. Placez le micro manipulateur et une source de lumière. Ensuite, passez le robinet de pression d’air à la position ouverte.
Sur le panneau avant du micro-injecteur, réglez la longueur de l’impulsion à 10 secondes en mode temps. Ensuite, peaufinez la longueur de l’impulsion avec le cadran de 10 virages. Ensuite, placez l’aiguille sur le support de micro pipette du micro manipulateur.
Utilisez une pince à épiler pour couper la pointe de l’aiguille pour permettre au liquide d’être poussé et utilisez un microscope pour évaluer la position de l’aiguille. Appuyez sur l’interrupteur à distance une fois pour vérifier qu’une impulsion d’une seconde pousse une petite gouttelette hors de l’aiguille. Réglez ensuite les réglages de l’électroporateur et connectez les pinces à épiler à l’électroporateur.
Pour garder le poisson en position fixe pendant l’injection, utilisez un morceau d’éponge avec une rainure coupée au milieu comme rembourrage. Tremper l’éponge à fond dans l’eau du système et la mettre dans une boîte de Pétri. À l’aide d’une cuillère en plastique, transférer un poisson zèbre anesthésié à l’éponge humide avec le côté ventral du poisson vers le bas dans la rainure.
Sous le microscope placer l’aiguille à un angle de 45 degrés près du muscle dorsal du poisson zèbre, puis trouver la petite tache sans écailles en face de la nageoire dorsale et pousser l’aiguille dans le muscle. Si une résistance est ressentie essayez un endroit adjacent. Utilisez le commutateur de pied pour injecter graduellement la solution plasmide dans le muscle.
Sous le microscope, le phénol rouge doit être visible à mesure qu’il pénètre dans le tissu musculaire. Électroporer le poisson immédiatement après l’injection en plaçant les électrodes de type pince à épiler de chaque côté du site d’injection. Appuyez sur le bouton de démarrage sur l’électroporateur et donnez-lui six impulsions de 40 volts de 50 millisecondes.
Ensuite, transférez doucement le poisson dans un réservoir de récupération. Enfin, après avoir anaethisizing le poisson selon le protocole de texte, utilisez une lumière UV pour voir l’expression EGFP près du site d’injection. Dans ce protocole, les antigènes d’ADN ont été clonés à côté de GFP dans le vecteur d’expression.
Le poisson zèbre a été injecté avec les plasmides d’antigène d’ADN intramusculairement avec un micro injecteur, et le site d’injection a été électroporé pour améliorer la prise des plasmides dans les cellules. Pour l’imagerie, l’expression antigène peut être visualisée par microscopie par fluorescence. Dans ce cas, l’expression des trois protéines de fusion d’antigène GFP a été détectée près du site d’injection, bien que leur intensité ait varié.
Cinq semaines après la vaccination contre les antigènes mycobactériens, le poisson zèbre a été infecté par mycobactérie marinum. QPCR a été utilisé pour déterminer la charge bactérienne chez chaque poisson quatre semaines après l’infection. Comparé au groupe témoin, les poissons vaccinés avec l’antigène un ont montré une charge bactérienne diminuée après infection avec M.marinum.
Tout en exécutant cette méthode, il est important de concevoir la construction plasmide avec soin, valider l’expression de l’antigène, et la pratique de la technique d’injection avant des expériences à grande échelle. Cette technique peut ouvrir la voie à un dépistage préclinique rentable des nouveaux vaccins candidats à base d’ADN chez le poisson zèbre adulte. N’oubliez pas que le bien-être des animaux est très important, et une anesthésie adéquate est essentielle lors de l’exécution de cette procédure.
