Il est nécessaire d’avoir une méthode de débit précis et élevé pour mesurer les anticorps neutralisant le VRS, comme un marqueur important de protection contre le virus respiratoire syncytial. Cette méthode est hautement reproductible avec des variations inter-analyse pour l’antiséum de référence étant inférieur à 10%Nous croyons que cet essai peut être facilement établi dans de nombreux laboratoires dans le monde entier à un coût relativement faible. Nous décrivons ici un test de micro-neutralisation basé sur l’imagerie qui a été testé sur le sous-groupe A du VRS, et qui peut également être adapté pour le sous-groupe B du VRS et différents types d’échantillons.
Reuben Tse, membre de l’équipe de recherche du MCRI, démontrera la procédure. Pour semer des plaques le premier jour, résidé d’abord les cellules A549 dans les médias du DMEM, avec 10% de FCS et 1000 unités de mélange pénicilline-streptomycine à une concentration de 400 000 cellules par millilitre. Puis grainez 96 plaques stériles à fond plat avec 40 000 cellules A459 à une densité de 100 microlitres par puits.
Incuber la plaque à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5 % pendant la nuit. Pour préparer la dilution sérique le deuxième jour, décongelez d’abord les échantillons humains de sérum de référence et d’essai de sérum de RSV à température ambiante. Ensuite, placez-les dans un bain d’eau à 56 degrés Celsius pendant 30 minutes pour les chauffer et les activer.
Ensuite, préparez plus de 110 microlitres d’une à 100 dilution du sérum de référence en mélangeant 1,5 microlitres du sérum de référence avec des supports DMEM sans FCS avec le mélange Penicillin-Streptomycine à un volume final de 150 microlitres. Pipette 110 microlitres de cette dilution dans le puits A12 d’une plaque stérile à fond U de 96 puits. Pour faire une à deux dilutions en série dans la plaque, ajoutez d’abord 55 microlitres de supports DMEM sans FCS avec le mélange pénicilline-streptomycine aux puits B12 à H12.
Puis avec un nouveau transfert de pointe 55 microlitres du puits A12 au puits B12. Pipette de haut en bas cinq fois pour mélanger la solution, et continuer jusqu’à ce que vous atteignez bien H12. Pipette sur l’excès de 55 microlitres de la solution du puits H12.
Ensuite, préparez une à 100 dilutions d’échantillons d’essais sériques et ajoutez 110 microlitres de chaque dilution aux puits correspondants A1 à A9 et E1 à E9 de la plaque stérile de 96 puits. Ajouter ensuite 55 microlitres de supports DMEM sans FCS avec le mélange pénicilline-streptomycine aux puits dans les colonnes un à neuf. Faire série une à deux dilutions de la rangée A à la rangée D et de la rangée E à la rangée H comme décrit précédemment.
Ajouter 55 microlitres de supports DMEM sans FCS avec le mélange pénicilline-streptomycine aux puits dans les colonnes 10 et 11. Pour préparer le stock de virus, mettez d’abord un flacon congelé de VRS dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pour le décongeler rapidement, puis placez le flacon sur la glace. Ensuite, ajoutez le virus au média DMEM contenant du mélange pénicilline-streptomycine à environ 200 PFU par puits pour faire un volume total de 55 millilitres pour 100 puits.
Pour préparer le mélange de sérum de virus, ajoutez d’abord 55 microlitres du virus dilué à tous les puits de colonnes un à neuf et des puits des rangées E à H des colonnes 10 et 11. Ajoutez ensuite 55 microlitres de supports DMEM exempts de FCS avec mélange pénicilline-streptomycine à tous les puits des rangées A à D des colonnes 10 et 11, et incubez la plaque à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5 % pendant une heure. Avant l’inoculation des cellules A549 avec RSV, examinez la plaque cellulaire sous un microscope léger pour confirmer que les monocouches cellulaires A549 sont confluentes à 80 %.
Puis inverser délicatement la plaque pour jeter le média, et éponger légèrement la plaque sur une serviette en papier absorbante stérile. Après chacun, laver avec pbs stérile filtré. Ajouter ensuite 100 microlitres par puits du mélange de sérum de virus aux puits correspondants sur la plaque cellulaire A549 selon le modèle de plaque fourni dans le manuscrit, et incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5% pendant une heure.
À la fin de l’incubation, utiliser une pipette pour enlever 90 microlitres par puits, et ajouter 100 microlitres des supports contenant 1XM199, 1,5% CMC, et 2%FCS dans le mélange pénicilline-streptomycine. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius en dioxyde de carbone de 5 % pendant trois jours. Pour fixer et développer une plaque d’essai, inversez d’abord doucement la plaque cellulaire A549 infectée par le VRS pour jeter les supports contenant le mélange M199, CMC, 2 %FCS et Penicillin-Streptomycine.
Ajouter ensuite lentement 200 microlitres de fixation tampon à chaque puits. Incuber la plaque à moins 20 degrés Celsius pendant 20 minutes. Jetez ensuite le tampon de fixation et épongez doucement sur une serviette en papier absorbante.
Laisser sécher la plaque face contre terre pendant 10 minutes. Ensuite, avec le tampon PBS filtré contenant 05 polysorbate 20, faire 5% solution de blocage du lait. Ajouter 200 microlitres de la solution de blocage à chaque puits et incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes.
À la fin de l’incubation, inverser délicatement la plaque pour jeter la solution et éponger sur une serviette en papier absorbante. Pour fabriquer l’anticorps primaire, diluer un à 500 anticorps XRSV de chèvre dans la solution de blocage. Ajouter 50 microlitres à chaque puits et incuber la plaque à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Lavez la plaque trois fois avec du PBS-polysorbate filtré. Ensuite, faire l’anticorps secondaire en diluant un à 5000 Alexa Fluor âne anti-chèvre immunoglobuline G dans la solution de blocage. Ajouter 50 microlitres à chaque puits et incuber à 37 degrés Celsius pendant une heure.
Lavez la plaque cinq fois avec du PBS-polysorbate filtré. Pour compter les plaques avec un lecteur de spots automatisé, utilisez d’abord une plaque de culture inutilisée de 96 puits pour collaborer à l’instrument en entrant les paramètres de comptage dans le canal FITC. Lisez ensuite la plaque cellulaire, enveloppez-la dans du papier d’aluminium et rangez-la à quatre degrés Celsius.
Ensuite, vérifiez les images des puits à la recherche de plaques artifactual ou de monocouches cellulaires perturbées, et excluez les puits avec des monocouches cellulaires perturbées. Le nombre moyen de plaques des puits de contrôle sans sérum a été calculé et utilisé pour déterminer la coupure de neutralisation de 50 % qui entraînerait une inhibition de 50 % de l’activité virale. La dilution réciproque du sérum a été tracée sur l’axe x et le nombre de plaques sur l’axe y d’un graphique semi-log à partir d’une ligne tracée entre les deux points.
Les titres de neutralisation de 50 % des échantillons de sérum d’essai étaient des dilutions rouges et sériques dont le dénombrement était immédiatement supérieur ou inférieur à la valeur de 50 % des puits de contrôle sans sérum. Les analyses de RSVAPRN dans deux cohortes adultes différentes de Gambie et les volontaires en bonne santé à Melbourne ont eu comme conséquence les adultes gambiens ayant un titre moyen inférieur de NAB comparé aux adultes de Melbourne. Le sérum humain de référence RSV montré démontre une très faible variabilité avec le coefficient de variation de 6,82%Cet essai amélioré de neutralisation de la neutralisation de la réduction de la plaque RSV à haut débit peut être facilement mis en œuvre dans de nombreux laboratoires, et soutiendra l’effort international d’harmonisation de l’OMS pour neutraliser les analyses d’anticorps RSV.
Ce sera essentiel pour l’évaluation des nouveaux candidats vaccins contre le VRS à l’avenir.
