Notre technique permet l’imagerie précise des cellules immunitaires humaines accumulées dans des conditions inflammatoires in vivo fournissant des aperçus passionnants dans le processus de l’homing pulmonaire à cellule T. Ce protocole soutient la recherche translationnelle sur l’homing pulmonaire à cellules T et peut ainsi aider à l’identification de nouvelles cibles pour une thérapie optimisée des maladies pulmonaires inflammatoires ou allergiques. En particulier, la capacité de considérer l’influence des propriétés de cellules immunitaires spécifiques à la maladie, l’organisation des tissus pulmonaires, et le milieu inflammatoire sur l’homing pulmonaire à cellule T rend cette méthode très avantageuse.
Dans l’ensemble, notre technique est de grande valeur pour la recherche immunologique dans le domaine des maladies pulmonaires inflammatoires chroniques, qui sont souvent entraînées par une accumulation massive de tissus de cellules immunitaires activées. Après avoir confirmé un manque de réponse au pincement des orteils chez une souris C57 noire 6J d’au moins 16 grammes et de six semaines, utilisez un micropipet pour livrer lentement 10 microlitres de solution de papain fraîchement préparée dans une narine de la souris une fois par jour pendant trois jours consécutifs. Le lendemain de la dernière administration de papain, couche 10 millilitres de milieu ficoll sous le sang périphérique humain d’un volontaire sain pré-dilué à un rapport d’un à deux dans PBS pour la séparation de gradient de densité par centrifugation.
Transférer la cellule sanguine mononucléaire périphérique ou la couche interphase PBMC dans un nouveau tube de 50 millilitres et recueillir les cellules par centrifugation. Ensuite, effectuer l’isolement microbille magnétique des cellules CD4 positives selon le protocole du fabricant. La re-suspension de la perle a isolé les lymphocytes T CD4 positifs jusqu’à une fois dix à sept lymphocytes T pour au moins 500 microlitres de concentration de PBS.
Étiquetez les cellules avec un colorant approprié de prolifération de cellules excitables de lumière rouge pendant 10 minutes à 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, arrêter la réaction d’étiquetage avec cinq volumes de rpmi moyen complété avec 10%FBS pendant cinq minutes sur la glace suivie de trois lavages à moyen. Pour le transfert adoptif des lymphocytes T positifs CD4 humains chez des souris receveurs exposées à la papain, suspendre à nouveau les cellules T étiquetées fluorescentes à une concentration d’une fois 10 à la septième cellule par millilitre dans PBS et charger 100 microlitres de cellules dans une seringue d’un millilitre munie d’une aiguille de calibre 30 par animal receveur, puis injecter tout le volume de cellules d’une seringue dans la veine de la queue un animal traité à la papaine qui maintient la pointe de l’aiguille dans la veine pour un supplément cinq secondes après l’accouchement cellulaire pour empêcher la décharge de la suspension cellulaire.
Trois heures après le transfert de cellules adoptives, perforer le ventricule droit de chaque souris euthanasié avec une canule de calibre 21 reliée à un cathéter et faire une incision dans le ventricule gauche. Parfusez lentement le poumon avec 20 millilitres de PBS glacé complété par cinq millimolar EDTA suivis de deux millilitres de paraformaldéhyde glacé de 4%. Lorsque tout le fixatif a été rincé à travers le tissu, enlever les glandes salivaires et couper le muscle hyoïde sternal pour permettre à un forceps d’être glissé sous la trachée pour exposer le tissu airtube.
Effectuez une ponction initiale de la trachée exposée à l’aide d’une aiguille de calibre 30 avant de remplacer l’aiguille par un cathéter contondant de calibre 30 afin d’éviter d’autres dommages au tissu. Utilisez un porte-aiguille pour sceller la jonction entre le cathéter inséré et la trachée, et remplissez soigneusement les voies respiratoires avec environ 37 degrés Celsius 0,75% agarose jusqu’à ce que le déroulement complet du poumon. Une jonction étroite entre le cathéter et la trachée est essentielle pour étendre le poumon à sa taille physiologique et maintenir l’architecture tissulaire pour l’imagerie.
Lorsque l’agarose s’est complètement solidifiée, retirez le cathéter et transférez soigneusement le poumon dans un tube sombre de deux millilitres rempli de 4 % de paraformaldehdye. Ensuite, déshydratez le tissu avec des incubations séquentielles d’éthanol sous rotation continue à 31 rotations par minute et quatre degrés Celsius comme indiqué pendant quatre heures par incubation. Après une déshydratation complète, transférer l’échantillon dans un cinnamate éthylique pour une incubation d’une nuit à température ambiante jusqu’à ce que le tissu semble translucide.
Pour une microscopie fluorescente à feuilles lumineuses, utilisez une petite goutte de colle stable au solvant organique pour coller le poumon au porte-échantillon du microscope et placez le lobe pulmonaire sur le support en position verticale. Placez le porte-échantillon dans sa chambre et sélectionnez les lasers appropriés pour l’expérience dans le logiciel d’instrument. Ensuite, utilisez les curseurs sous Optique pour définir une largeur de feuille qui aperture numérique qui révèlent uniformément l’organe entier ou une section spécifique d’intérêt.
Utilisez le curseur pour définir l’intensité laser sous contrôle de transmission laser pour chaque laser sélectionné et cliquez sur Appliquer. Utilisez des paramètres de mesure avancés pour fusionner les feuilles de lumière gauche et droite pour créer une image homogènement éclairée. Définissez les positions de début et de fin de la pile Z à mesurer sous la plage d’analyse et définissez la taille de l’étape à cinq micromètres, puis sélectionnez autosave pour enregistrer les fichiers automatiquement et commencer la mesure pour capturer les images.
Lorsque toutes les images ont été acquises, activez le bouton Surpass dans le logiciel d’analyse post-imagerie 3D et chargez la première image à partir d’une pile Z pour lancer la reconstruction 3D d’ouverture et automatique de toutes les autres images de la pile Z sélectionnée, puis sous réglage d’affichage, ajustez l’intensité, le niveau noir et le contraste pour chaque canal. Pour comparer l’accumulation de cellules humaines dans le tissu pulmonaire à travers différents échantillons, sélectionnez Modifier et Crop 3D pour définir un cube pulmonaire avec un volume spécifique. Pour quantifier les cellules étiquetées dans le cube pulmonaire défini, ouvrez Ajouter de nouvelles taches dans la barre d’outils, cliquez sur Sauter la création automatique, modifier manuellement et sélectionnez le canal de 640 nanomètres.
Réglez l’échelle de rayon à 10,00 microns, cliquez sur Sélectionnez, et sous Modifier, Cliquez sur Déplacer avec le bouton de la souris gauche pour marquer individuellement chaque cellule de fluoration avec un point. Le nombre total de cellules comptées sera affiché dans les statistiques. Pour capturer une image, utilisez l’outil instantané et utilisez l’outil d’animation pour capturer une vidéo.
L’enrichissement cellulaire à base de microbilles et l’étiquetage subséquent de fluorescence tel que démontré entraînent généralement une pureté positive cd4 d’au moins 95 % et un étiquetage réussi de ces cellules tel que déterminé par cytométrie d’écoulement. La compensation des tissus à base de cinnamate éthylique atteint un niveau élevé de transparence des organes indiquant un appariement réussi de l’indice réfractif. Le signal auto-fluorescent du tissu pulmonaire offre un outil utile pour imager la structure anatomique du poumon par microscopie à feuilles lumineuses qui peut être affichée comme une projection d’intensité moyenne ou en mode surface.
Par rapport à la microscopie conventionnelle, la microscopie à feuilles de lumière offre l’avantage de l’imagerie des organes entiers et de la reconstruction 3D subséquente permettant l’identification et la visualisation de lymphocytes T humains étiquetés par colorant de prolifération dans le contexte de l’ensemble de l’organe, en outre, la préférence des lymphocytes T humains transférés pour l’accumulation sélective dans le tissu pulmonaire enflammé des animaux exposés à la papaine est encore soutenue par le fait que les lymphocytes T positifs CD4 humains ne peuvent pas être récupérés de la muqueuse intestinale des animaux receveurs. Pour la quantification et la comparaison de l’accumulation pulmonaire des lymphocytes T positifs CD4 humains entre différentes conditions, les cellules étiquetées peuvent également être comptées dans plusieurs cubes pulmonaires de volume défini tel que démontré. Une préparation minutieuse des tissus, y compris la perfusion pulmonaire, l’inflation et le dégagement des tissus, est très importante pour une génération optimisée d’images microscopiques à haute résolution.
Pour confirmer davantage la diapedésie réussie des lymphocytes humains transférés, ce protocole peut facilement être combiné avec la quantification cytométrique d’écoulement des lymphocytes humains dans le lavage bronchoalveolar murine. La capacité de surveiller les cellules immunitaires dérivées de patients individuels dans des conditions in vivo soutient l’identification des altérations fonctionnelles des cellules immunitaires imprimées par une maladie ou une thérapie particulière.
