Ce travail a été financé par la Fondation Bill et Melinda Gates Foundation (prix du Grand Défi d&#39;exploration SBG), les National Institutes for Health Research (INDH), Centre de recherche biomédicale sur les maladies microbiennes, et l&#39;INDH Réseau global de recherche locale. Nous reconnaissons l&#39;NWDA de soutien aux infrastructures. Nous remercions le Professeur J. N Weiser, Université de Pennsylvanie et le professeur P Hermans, Université de Nijmegen pour les isolats de pneumocoques. Merci au comité de sécurité EHPC pour leur soutien et de conseils, à tous nos bénévoles pour leur participation et à Mathieu Bangert pour prendre les photos.

1. Sélection et présélection des bénévoles <ol><li> Volontaires sains sont recrutés par le biais d&#39;affiches et de publicités sur le site de l&#39;Université en fonction de la recherche du NHS et d&#39;éthique d&#39;orientation. </li><li> Les critères d&#39;inclusion pour la participation sont les suivantes: <ol><li> Adultes de 18-60 ans. </li><li> Il parle couramment l&#39;anglais et est capable de communiquer facilement à la fois par téléphone mobile et la messagerie texte. </li></ol></li><li> Les critères d&#39;exclusion de la participation sont les suivantes: <ol><li> Le contact étroit avec les personnes à risque (enfants, adultes immunodéprimés, personnes âgées, santé maladie chronique). </li><li> Courant des antécédents de tabagisme fumeur ou significative (&gt; 10 paquets-années). </li><li> L&#39;asthme ou autre maladie respiratoire. </li><li> Grossesse. </li><li> Allergie à la pénicilline ou amoxicilline. </li><li> Participation actuelle à un autre essai clinique à moins que l&#39;observation ou la non-intervention de phase. </li><li> Impossible de donner un consentement éclairé. </li></ol></li><li>Une visite de sélection initiale, environ une semaine avant l&#39;inoculation, comprend une histoire centrée clinique et un examen clinique ciblé. </li><li> Si un non constatés antérieurement anomalie est détectée, le volontaire seront exclus de l&#39;étude et enquête appropriée sera organisé par les soins primaires. </li><li> Au cours de l&#39;examen initial visiter un hémogramme complet est obtenu à veiller à ce que le nombre de globules blancs est dans la plage normale avant l&#39;inoculation visite. Un lavage nasal est effectué pour exclure les transporteurs pneumocoque naturelles (voir 6.1). </li><li> Avant l&#39;inoculation, les bénévoles reçoivent une formation sur les risques inhérents à la participation à l&#39;étude et sont fournis avec une notice destinée aux patients d&#39;urgence, thermomètre numérique, des numéros de téléphone d&#39;urgence et 3 jours de cours de l&#39;amoxicilline. </li></ol> 2. Préparation des stocks d&#39;inoculation <ol><li> Préparation des stocks d&#39;inoculation doit être faite dans un environnement propre. Les pipettes utilisées ne doit être utiliserpour la préparation d &#39;inoculum. Tout verrerie et les articles en plastique doivent être stériles. Nous recommandons que les stocks d&#39;inoculation être préparé dans une salle dédiée, en utilisant une hotte dédiée et un incubateur. </li><li> Souches de pneumocoques sont ensemencées sur une gélose au sang. Les plaques sont incubées à 37 ° C dans 5% de CO 2 pendant la nuit. Le lendemain de toutes les bactéries est raclée de la gélose au sang et inoculé dans un système de préservation des stocks de perles. Ces stocks perles sont utilisées pour l&#39;inoculation préparation de la pâte. Testez les stocks de perles pour la contamination et l&#39;uniformité colonie avant de préparer un stock inoculation. </li><li> Pour préparer le bouillon inoculation, inoculer une gélose au sang de deux perles du sérotype pneumococcique stock souhaité perle qui s&#39;étirent pour couvrir la totalité de la plaque. Incuber les plaques à 37 ° C dans 5% de CO2 pendant la nuit. Toutes les incubations d&#39;autres utiliseront ces mêmes conditions. Aussi incuber les médias Vegitone nuit pour assurer la stérilité. </li><li> L&#39;écouvillon lendemain matinla moitié de la plaque, en prenant soin de ne pas enlever la gélose au sang, et ajouter à 12 ml de bouillon Vegitone préchauffé. Répéter en utilisant l&#39;autre moitié de la plaque. Laisser les 12 deux flacons ml à 37 ° C pendant 2 heures ou jusqu&#39;à ce qu&#39;un changement de turbidité apparaît, selon la première éventualité. </li><li> Ajouter le ml 12 à 40 ml de bouillon Vegitone préchauffé et bien mélanger. Répétez l&#39;opération pour l&#39;autre flacon de 12 ml. Il s&#39;agit point dans le temps = 0. Prélever 100 ul de lire la densité optique (DO) à 600 nm. Retirer 20 ul pour la quantification des bactéries par unité formant colonie (UFC) Nombre moyen d&#39;une variante de la méthode de Miles et Misra (M &amp; M) 7. Incuber les deux flacons. <ol><li> Pour le M &amp; M, diviser une gélose au sang en six sections. Ajouter 180 ul de PBS stérile à six puits d&#39;une plaque de 96 puits à fond en U (). Ajouter 20 ul de bouillon pour le bien haut et bien mélanger. Diluer en série des échantillons 01h10 six fois et jeter 20 pl du puits sixième. Placer trois gouttes 10 pl du puits haut dans la première section de l&#39;gélose au sang. Répétez l&#39;opération pour les cinq autres puits. S&#39;assurer que la plaque est sèche avant qu&#39;il ne soit renversé et mis à incuber. </li><li> Le lendemain, compter le nombre de colonies visibles dans chaque section de dilution et d&#39;enregistrement. Utilisation de la section de dilution avec un nombre entre 30 et 300, il faut diviser le nombre de colonies visibles par trois pour obtenir une moyenne. </li><li> Multipliez le nombre moyen de colonies par le facteur de dilution, puis divisez par 10 (le montant de la baisse de 10 pi). Cela donne UFC / ul. </li><li> Multipliez ce nombre par 1000 pour obtenir UFC / ml. </li></ol></li><li> Effectuer DO 600 lectures et la quantification des bactéries par M &amp; M méthode chaque heure avant le début de phase semi-logarithmique est atteint, une DO de 0,25. </li><li> Une fois cette DO est atteint, ajouter 10% de glycérol stérile à un flacon et préparer aliquotes de 1 ml. Boutique aliquotes à -80 ° C. </li><li> Pour un stock plus concentré, centrifuger la fiole autre à 3345 xg pendant 15 min et éliminer le surnageant. Reprendre le culot dans 22,5 ml d&#39;Vegitone moyen et ajouter 10% de glycérol. Préparer des aliquotes de 1 ml et conserver à -80 ° C. </li><li> Laisser les stocks à -80 ° C pendant au moins 48 heures avant la décongélation et la quantification. </li><li> Quantifier le stock congelé bactérienne par la méthode M &amp; M. Testez trois tubes actions individuellement pour assurer la reproductibilité. Utilisez la valeur obtenue pour diluer le stock à la concentration désirée d&#39;inoculum dans une solution saline, comme décrit ci-dessous. </li><li> Pour l&#39;inoculation, la quantité de pneumocoques dans l&#39;inoculum est calculée avant et après l&#39;inoculation. Cette quantification des bactéries par la méthode M &amp; M est utilisé pour déterminer le nombre moyen de pneumocoques dans l&#39;inoculum qui représente le temps qu&#39;il faut pour terminer la procédure. <ol><li> Préparer un inoculum, diluer à la concentration voulue, et d&#39;effectuer la quantification par la méthode M &amp; M pour la &quot;pré-inoculation&quot; count. </li><li> Dans notre centre de recherche clinique prend l&#39;équipe de 30 min pour terminer la procédure d&#39;inoculation entier. Pnsuspensions eumococcal dans une solution saline se montrent habituellement une diminution du nombre dans cet intervalle. Pour tenir compte de cela, nous laissez l&#39;inoculum dilué à température ambiante pendant 30 min, puis effectuer un &quot;post-inoculation&quot; quantification des bactéries par la méthode M &amp; M. </li><li> Prendre la moyenne de l&#39;avant et après afin de déterminer la concentration finale inoculé. Réglez la «séance» le temps en fonction de votre protocole clinique mais gardez l&#39;intervalle aussi bref que possible. </li></ol></li><li> Tous les nouveaux stocks doivent être envoyés à un laboratoire de référence pour la confirmation de la pureté des stocks et d&#39;identité. </li></ol> 3. Préparation d&#39;inoculum <ol><li> Préparation de l&#39;inoculum doit commencer 30 minutes avant le rendez-inoculation volontaire prévue. </li><li> Prenez l&#39;un des tubes d&#39;actions déjà effectués sur le congélateur à -80 ° C, le décongeler et faire tourner le tube dans la microcentrifugeuse à 17.000 xg pendant 3 min. </li><li> Gélose au sang chaud dans l&#39;incubateur à 37 ° C. Préparerune plaque à 96 puits pour la quantification bactérienne par la méthode M &amp; M et préparer les tubes de dilution en fonction de la dose souhaitée. </li><li> Retirer le surnageant de bouillon du tube centrifugé et remettre en suspension le culot dans 1 ml de solution saline. Cette étape supprime le bouillon de l&#39;inoculum. </li><li> Répétez l&#39;étape de centrifugation. </li><li> Retirer le surnageant saline et reprendre le culot dans 1 ml de solution saline. </li><li> Effectuez ensemble taux de dilution de la concentration d&#39;inoculum désiré et quantifier par M &amp; M méthode. </li><li> Prenez l&#39;inoculum à la nomination des bénévoles et des volontaires après l&#39;inoculation, répéter la quantification au laboratoire. Etiqueter le tube avec la date et la dose de l&#39;inoculum et conserver à -80 ° C. </li><li> Pour assurer la cohérence de l&#39;inoculation à l&#39;inoculation, il est important d&#39;utiliser les mêmes pipettes et matériel de laboratoire dédié à chaque fois. </li></ol> 4. Inoculation <ol><li> Les bénévoles doivent être assis confortablement dans une position semi-allongée. </li><li&gt; En utilisant une pipette P200 et pointes à filtre stériles établir 100 pi de l&#39;inoculum et insérez la pointe juste à l&#39;intérieur de la cavité nasale. </li><li> Lentement expulser l&#39;inoculum sur la muqueuse nasale en utilisant un mouvement circulaire. </li><li> Il est essentiel que la pointe de pipette n&#39;entre pas en contact avec la muqueuse nasale comme une rupture dans l&#39;intégrité de l&#39;épithélium pourrait se traduire par des bactéries dans la circulation sanguine. </li><li> Il est également essentiel que l&#39;inoculum n&#39;est pas placé trop loin ou elle se déroulera dans la gorge, il doit se trouver à l&#39;intérieur de la cavité nasale. </li><li> Répétez l&#39;opération pour la narine autre. </li><li> Ayez le bénévolat rester dans la position semi-couchée pendant 10 min sans renifler ou se moucher. Cette alternance permet aux bactéries de se disperser à travers la muqueuse. </li></ol> 5. Surveillance <ol><li> Les bénévoles sont surveillés par jour après l&#39;inoculation. Cela inclut un message texte envoyé par le quotidien bénévole aux enquêteurs avant 14 heures. </li><li> Si le texte que jen&#39;est pas reçue par 14 heures le volontaire sera contacté pour assurer sa / son bien-être. Si il / elle ne répond pas, la prochaine alloué parent sera contacté pour assurer le volontaire du bien-être. </li><li> Les bénévoles sont invités à rendre compte des symptômes des voies respiratoires supérieures à tous les rendez-vous. Le personnel clinique demandez au volontaire de décrire ses symptômes et ses / assurera le suivi des plaintes. </li><li> Les antibiotiques donnés aux volontaires ne doivent être prises dans trois circonstances: dans le cas où ils sont malades et sont chargés de les prendre par l&#39;équipe de recherche, s&#39;ils sont porteurs pneumocoque à la fin de l&#39;étude, ou si elles sont mal et incapable de communiquer avec l&#39;équipe de recherche. Le volontaire est encouragé à maintenir cette trousse de secours avec eux pendant toute la durée de l&#39;étude et est prié de contacter l&#39;équipe de recherche sur une base quotidienne pour les 7 prochains jours. </li><li> Notre équipe est disponible 24/7 avec contact infirmière pendant les heures de travail et de deux médecins disponibles sur des hours. Toutes les requêtes sont traitées par appel téléphonique et / ou un examen immédiat. Dispositions sont disponibles pour immédiate, admission directe dans un service des maladies infectieuses, en cas de besoin. </li></ol> 6. Lavage nasal (NW) Procédure <ol><li> Lavages nasaux (NO) sont effectuées lors d&#39;une visite de dépistage initial, ainsi que 48 heures, 7 et 14 jours après l&#39;inoculation. La méthode utilisée NO est tiré de Naclerio et al. 8 volontaires naturellement colonisés par S. pneumoniae sont exclus de l&#39;inoculation et le suivi. </li><li> Le volontaire doit être confortablement assis et la tête est inclinée vers l&#39;arrière à 30 ° de la verticale. </li><li> Demandez au volontaire de prendre une profonde inspiration et retiennent leur souffle tout en poussant leur langue et vers l&#39;arrière contre le toit de la bouche. Alors que dans cette position, le volontaire est invité à indiquer qu&#39;ils sont prêts. </li><li> Une seringue remplie avec 20 ml de solution saline est inséré dans l&#39;espace nasal antérieur et 5 ml de solution saline est expulsé. Le volunteepuis se penche en avant r immédiatement et expulse le fluide en expirant par le nez rapidement dans un bol en aluminium. </li><li> Répétez cette procédure 3 fois plus de sorte que chaque narine a été lavées deux fois et la totalité des 20 ml a été utilisée. </li><li> Piscine tous les échantillons ensemble dans un tube de centrifugeuse et l&#39;envoyer au laboratoire à température ambiante pendant le traitement. </li></ol> 7. Nasal Wash traitement <ol><li> Centrifuger les échantillons pendant 10 min à 3345 x g. </li><li> Enlever le surnageant et conserver en aliquotes de 1 ml dans des tubes Eppendorf étiquetés à -80 ° C. </li><li> Ajouter 100 ul de milieu 9 StGG au culot et mélanger soigneusement. Assurez-vous que le volume total dans le tube à ce stade est déterminé. Cette dilution sera utilisé dans le calcul de l&#39;UFC d&#39;un chariot positif NO. </li><li> Plaque une baisse de 20 ul de la StGG contenant l&#39;extrait concentré sur une gélose au sang contenant de la gentamicine et de série de la plaque. <ol><li> Si le NO est post-inoculation, 10 pl retirer de la StGG contenant le culot remis en suspension et l&#39;utilisation pour la quantification bactérienne par M &amp; M méthode. </li></ol></li><li> Ajouter une autre de 800 ul StGG au tube NO et bien mélanger. </li><li> Plaque de 25 pi sur une plaque de gélose au sang et 25 pi sur une plaque de gélose chocolat, rayures toute la plaque. </li><li> Divisez les bactéries en suspension dans l&#39;montants restants StGG moyenne en 2 cryotubes et conserver à -80 ° C. </li><li> Incuber les plaques à 37 ° C pendant la nuit dans 5% de CO 2. </li><li> Examiner les plaques le lendemain pour le pneumocoque et d&#39;autres pathogènes respiratoires potentiels. </li><li> Les pneumocoques sont identifiés sur des plaques par la morphologie des colonies. Colonies hémolytiques alpha ayant une morphologie dessinateur sont repiqués sur gélose au sang avec un disque optochine et incubées pendant la nuit. </li><li> Les colonies suspectes pneumocoque qui sont sensibles sont optochine coloration de Gram pour confirmer diplocoques à Gram positif et le sérotypage en utilisant le Statens Serum Institut Pneumotest-Latex kit. </li></ol>

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	<li>Ferreira, D. M., Jambo, K. C., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+human+pneumococcal+carriage+models+for+vaccine+research.">Experimental human pneumococcal carriage models for vaccine research.</a> Trends in Microbiology. 19, 464-470 (2011).</li><li>Mera, R., Miller, L. A., Fritsche, T. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+and+multiple+resistance+in+Streptococcus+pneumoniae+after+the+introduction+of+the+conjugate+pneumococcal+vaccine.">Serotype replacement and multiple resistance in Streptococcus pneumoniae after the introduction of the conjugate pneumococcal vaccine.</a> Microbial Drug Resistance. 14, 101-107 (2008).</li><li>Tocheva, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declining+serotype+coverage+of+new+pneumococcal+conjugate+vaccines+relating+to+the+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae+in+young+children.">Declining serotype coverage of new pneumococcal conjugate vaccines relating to the carriage of Streptococcus pneumoniae in young children.</a> Vaccine. 29, 4400-4404 (2011).</li><li>Weinberger, D. M., Malley, R., Lipsitch, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotype+replacement+in+disease+after+pneumococcal+vaccination.">Serotype replacement in disease after pneumococcal vaccination.</a> Lancet. 378 (10), 1962-1973 (2011).</li><li>Wu, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+Streptococcus+pneumoniae+nasopharyngeal+colonization+model+in+adult+mice.">Establishment of a Streptococcus pneumoniae nasopharyngeal colonization model in adult mice.</a> Microb. Pathog. 23, 127-137 (1997).</li><li>Wright, A. K. A., Ferreira, D. M., Gritzfeld, J. F., Wright, A. D., Armitage, K., Jambo, K. C., Bate, E., Batrawy, S. E. l., Collins, A., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Nasal+Challenge+with+Streptococcus+pneumoniae+is+Immunising+in+the+Absence+of+Carriage.">Human Nasal Challenge with Streptococcus pneumoniae is Immunising in the Absence of Carriage.</a> PloS Pathogens. 8 (4), e1002622 (2012).</li><li>Miles, A. A., Misra, S. S., Irwin, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+estimation+of+the+bactericidal+power+of+the+blood.">The estimation of the bactericidal power of the blood.</a> The Journal of Hygiene. 38, 732-749 (1938).</li><li>Naclerio, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mediator+release+after+nasal+airway+challenge+with+allergen.">Mediator release after nasal airway challenge with allergen.</a> Am. Rev. Respir. Dis. 128, 597-602 (1983).</li><li>O'Brien, K. L., Nohynek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Report+from+a+WHO+working+group:+standard+method+for+detecting+upper+respiratory+carriage+of+Streptococcus+pneumoniae.">Report from a WHO working group: standard method for detecting upper respiratory carriage of Streptococcus pneumoniae.</a> Pediatr. Infect. Dis J. 22, 133-140 (2003).</li><li>Gritzfeld, J. F., Roberts, P., Roche, L., Batrawy, S. E. l., Gordon, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+between+nasopharyngeal+swab+and+nasal+wash,+using+culture+and+PCR,+in+the+detection+of+potential+respiratory+pathogens.">Comparison between nasopharyngeal swab and nasal wash, using culture and PCR, in the detection of potential respiratory pathogens.</a> BMC Research Notes. 4, 122 (2011).</li><li>McCool, T. L., Cate, T. R., Moy, G., Weiser, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+immune+response+to+pneumococcal+proteins+during+experimental+human+carriage.">The immune response to pneumococcal proteins during experimental human carriage.</a> J. Exp. Med. 195, 359-365 (2002).</li></ol>

Aucun conflit d&#39;intérêt déclaré.

La plate-forme EHPC a un certain nombre d&#39;utilisations possibles, y compris l&#39;utilisation comme un modèle vaccin muqueux et comme substitut de protection pour tester des vaccins de protéines nouvelles. La méthode dépend d&#39;une technique d&#39;inoculation uniforme et une haute qualité NO. La reproductibilité peut être un problème avec l&#39;inoculum. En raison de la nature variable des aliquotes congelées bactériennes, il peut être difficile de reproduire la dose souhaitée. Une réduction de moitié ou doubler la dose désirée est considéré à sa portée. Il est essentiel que la quantification bactérienne se faire immédiatement avant et suivant l&#39;inoculation, afin de déterminer avec précision la quantification des bactéries en UFC compte. Pour cette raison, il peut être utile si les nominations de bénévoles se produire simultanément de sorte que seul un inoculum besoin d&#39;être préparé et le placage quantification réalisée avant et après l&#39;inoculation se passe pas plus de 30 minutes d&#39;intervalle. Procédé NO nécessite la coopéraration du volontaire et ne serait pas une méthode idéale chez les enfants. Si le rendement est inférieur à 5 ml, la procédure peut être répétée jusqu&#39;à l&#39;utilisation d&#39;une remise de 20 ml. Port de prothèses dentaires peuvent réduire le rendement NW. Si le bénévole a une bloqué / nez bouché et la solution saline est compté antérieurement après l&#39;insertion, de se moucher, insérez la seringue un peu plus loin en arrière, et incliner la tête en arrière plus si nécessaire. Le NO est une technique qui s&#39;améliore avec la pratique. Certains volumes seront généralement perdu tant l&#39;objectif est un rendement d&#39;au moins 10 ml. Si le volontaire peut déguster une solution saline pendant le NO, la connexion entre le nasopharynx et de l&#39;oropharynx postérieur n&#39;a pas été suffisamment fermé par la langue du volontaire. Si la plupart des bénévoles avale de la solution saline, expliquer la procédure, en insistant sur la poussée de la langue contre le palais de la bouche. Ensuite, répétez la procédure pour augmenter le volume retourné. Si le NO contient une substantial montant de mucus, il est préférable de l&#39;enlever avant la centrifugation. Vortex de l&#39;échantillon de façon à desserrer tout ce qui pourrait être lié au mucus, puis enlever autant de grands morceaux que possible tout en retirant une solution saline peu que possible. Une étude précédente EHPC aux Etats-Unis a été effectué en toute sécurité et a eu aucun événement indésirable 11. Pour assurer la sécurité permanente de la plate-forme EHPC, nous avons mis en place un protocole d&#39;urgence qui est basé sur un accès 24 h à l&#39;équipe de recherche. Les bénévoles reçoivent les coordonnées, leur permettant d&#39;accéder à l&#39;équipe de recherche de 24 heures par jour. Tous les soins médicaux nécessaires est fournie à l&#39;Hôpital Royal Liverpool University. Comme mesure supplémentaire de protection, un comité de sécurité composé de cliniciens et de scientifiques provenant de l&#39;extérieur du groupe de recherche reçoit un rapport de sécurité hebdomadaire. Le rapport contient la dose bactérienne chaque bénévole a reçu et si des symptômes de la maladie ont été signalés. Ce rapport permet la sécurité des èmee étude à l&#39;extérieur critiqué sans parti pris. Le comité de sécurité sont également disponibles 24 heures par jour dans le cas improbable d&#39;une urgence.

<table border="1"><tbody><tr><td> Nom </td><td> Entreprise </td><td> Cat # </td></tr><tr><td> Glycérol </td><td> Pêcheur </td><td> G/0650/08 </td></tr><tr><td> Chlorure de sodium à 0,9% </td><td> B. Braun </td><td> 3627667 </td></tr><tr><td> Poudre de lait écrémé </td><td> Fluka </td><td> 70166 </td></tr><tr><td> Bouillon tryptone soja </td><td> Becton Dickinson </td><td> 211768 </td></tr><tr><td> Glucose </td><td> BDH </td><td> 284504S </td></tr><tr><td> Gélose Columbia au sang de cheval chocolaté </td><td> Oxoid </td><td> PB0124 </td></tr><tr><td> Pneumotest-latex kit </td><td> Statens Serum Institut </td><td> 51823 </td></tr></tbody></table>

experimental human pneumococcal carriage

Expérimentale chariot pneumocoque humaine (EHPC) est scientifiquement important parce que le portage nasopharyngé de Streptococcus pneumoniae est à la fois la principale source de transmission et la condition sine qua non de la maladie invasive. Un modèle de transport permettra de déterminer avec précision les indicateurs immunologiques de la protection, l&#39;effet immunisant du transport et de l&#39;effet de la pression d&#39;accueil de l&#39;agent pathogène dans le créneau du nasopharynx. En outre, les méthodes de détection de chariot utiles dans les études épidémiologiques, y compris les études sur les vaccins, peuvent être comparés. Objectif Nous visons à développer une plate-forme EHPC qui est une méthode sûre et reproductible utile qui pourrait être utilisé pour le bas-sélection des candidats vaccins contre le pneumocoque à la prévention de nouvelles de transport comme un substitut de l&#39;immunité induite par le vaccin. Il travaillera à l&#39;essai de vaccins candidats et les descriptions des mécanismes sous-jacents EHPC et la protection vaccinale de Carriage 1. Les vaccins conjugués contre le pneumocoque actuelles protéger les enfants contre les maladies invasives bien de nouveaux vaccins sont nécessaires d&#39;urgence que le vaccin actuel ne confère pas une protection optimale contre la pneumonie non bactériémique et il ya eu des preuves de remplacement des sérotypes de sérotypes non vaccinaux 2-4. Méthode Nous inoculer avec S. pneumoniae en suspension dans 100 ul de solution saline. La sécurité est un facteur majeur dans le développement du modèle EHPC et est réalisé grâce à un dépistage volontaire et de leur contrôle. Un comité de sécurité composé de cliniciens et de scientifiques qui sont indépendantes de l&#39;étude fournit des informations objectives sur une base hebdomadaire. L&#39;inoculum bactérien est normalisé et exige qu&#39;aucune produits animaux sont inoculés dans des bénévoles (à base de légumes médias et salines). Les doses requises pour la colonisation (10 4 -10 5) sont beaucoup plus faibles than ceux qui sont utilisés dans des modèles animaux (10 7) 5. Détection chariot pneumocoque est renforcée par un volume élevé (idéalement&gt; 10 ml) de lavage nasal de mucus qui est relativement libre. Ce protocole traitera des aspects les plus importants du protocole à son tour. Il s&#39;agit de la sélection des bénévoles (a), (b) préparation de l&#39;inoculum à pneumocoque, (c) l&#39;inoculation, (d) le suivi et la détection de chariot (e). Résultats Notre protocole actuel a été en sécurité dans plus de 100 bénévoles à une gamme de doses en utilisant deux différents sérotypes bactériens 6. Une étude dose-ranging utilisant S. pneumoniae 6B et 23F est actuellement menée afin de déterminer la dose optimale d&#39;inoculation pour le transport de 50%. Un taux prévu de 50% du transport permettra le modèle EHPC d&#39;avoir une grande sensibilité pour l&#39;efficacité du vaccin avec un nombre d&#39;études de petite taille.

Nous avons l&#39;expérience inoculer 159 personnes, dont 35 ont effectué le pneumocoque. La dose la plus faible nous avons atteint chariot avec l&#39;aide de sérotype 6B était 11.100 pi par narine UFC/100, la dose la plus élevée était de 313 000 UFC/100 ul par narine. La dose la plus faible nous avons atteint chariot avec l&#39;aide de sérotype 23F est 9000 UFC/100 ul par narine, la dose la plus élevée était de 84 500 pi par narine UFC/100. Notre méthode d&#39;évaluation chariot est un lavage nasal, choisi parce qu&#39;une étude récente 10 a montré que 91% des volontaires ont trouvé lavage nasal à être plus à l&#39;aise que écouvillonnage du nasopharynx, le lavage nasal était également plus susceptibles de détecter des agents pathogènes en utilisant la culture microbiologique. La flore microbienne récupérés sur des plaques de gélose au sang inoculés avec NO peut être variable et difficile à lire. La gentamicine est utilisé sur la gélose au sang d&#39;abord sélectionner pour le pneumocoque. La gélose chocolat et la plaque de gélose sang deuxième sont utilisés pour détecter d&#39;autres parcours respiratoire potentielOgens qui peuvent aider ou entraver la colonisation pneumococcique. Un exemple d&#39;une plaque de gélose au sang inoculé avec NO qui est facile à lire est illustré à la figure 1a; une plaque difficile contenant de nombreux types de flore est montré dans la figure 1b. À tous les bénévoles de rendez-vous a été demandé de décrire les symptômes des voies respiratoires supérieures, s&#39;il est présent, et les comparaisons entre les transporteurs et les non-porteurs ont été mis en évidence. Sur les 145 personnes récemment inoculés avec le pneumocoque, 28 se plaignaient de symptômes (tableau 1). Huit d&#39;entre eux étaient porteurs, vingt étaient pas. Les symptômes les plus fréquents étaient des symptômes non spécifiques nasales (tableau 1). Parmi les cas pour lesquels il a été signalé des symptômes systémiques, y compris la fièvre et / ou de malaise, aucune des enquêtes menées ont montré des signes de maladie à pneumocoques et les symptômes étaient compatibles avec une infection virale concomitante sauf dans un cas d&#39;amygdalite. Deux pneumocoque positivvolontaires ont été e traitée avec des antibiotiques. L&#39;un se plaignait de maux de gorge et des maux d&#39;oreille et, après avoir rencontré le médecin de l&#39;étude, a été conseillé de prendre des antibiotiques à titre préventif. L&#39;autre volontaire a été diagnostiqué cliniquement avec une amygdalite. Tous les bénévoles ont eu une résolution rapide des symptômes. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/50115/50115fig1.jpg" /> Figure 1. Gélose au sang inoculé avec NO. Géloses inoculées avec du sang NO peut être difficile à lire. 1a est un exemple d&#39;une plaque qui est facile à lire avec des pneumocoques clairement visible. 1b est une plaque avec beaucoup de co-colonisateurs flore rendant plus difficile à détecter si les pneumocoques est présent. <table border="1"><tbody><tr><td> Symptômes </td><td></td><td> Chariot (n = 32) </td><td> Pas de transport (n = 112) </td></tr><tr><td> Toussymptômes </td><td></td><td> 24% </td><td> 18% </td></tr><tr><td> Systémique </td><td> Fièvre </td><td> 3% </td><td> 4% </td></tr><tr><td></td><td> * Malaise </td><td> 9% </td><td> 4% </td></tr><tr><td> Local </td><td> Ouïe </td><td> 9% </td><td> 3% </td></tr><tr><td></td><td> Nez </td><td> 0 </td><td> 10% </td></tr><tr><td></td><td> Gorge </td><td> 12% </td><td> 3% </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Caractérisation des bénévoles ont signalé des symptômes après S. pneumoniae 6B inoculation. Toutes les plaintes ont été examinées par le comité de sécurité externe et, à la suite des enquêtes approfondies, aucun symptôme n&#39;a été attribués à la maladie pneumococcique. Les symptômes les plus communs sont le mal de gorge, nez et farcies syndrome pseudo-grippal.

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Experimental Human Pneumococcal Carriage

Expérimentale chariot pneumocoque humain offre un modèle naturel de transport et un modèle potentiel pour une utilisation dans le développement de vaccins. Cette technique est utile mais complexe et implique un risque clinique par l&#39;introduction d&#39;un agent pathogène dans un être humain. Nous avons développé un protocole détaillé.

Expérimentale transport pneumocoque humaines

Experimental human pneumococcal carriage (EHPC) is scientifically important because nasopharyngeal carriage of Streptococcus pneumoniae is both the major ...

Research

JoVE Journal

Medicine

15.3K vues.  Liverpool School of Tropical Medicine. Expérimentale chariot pneumocoque humain offre un modèle naturel de transport et un modèle potentiel pour une utilisation dans le développement de vaccins. Cette technique est utile mais complexe et implique un risque clinique par l'introduction d'un agent pathogène dans un être humain. Nous avons développé un protocole détaillé.

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Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

Assay Métastases expérimentales

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Recherche

Médecine

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts (CAFs) from Human Mammary Fibroblasts

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of extracellular matrix (ECM) and a variety of mesenchymal cells, including fibroblasts, myofibroblasts, endothelial cells, pericytes and leukocytes 1-3.
The tumour-associated stroma is responsive to substantial paracrine signals released by neighbouring carcinoma cells. During the disease process, the stroma often becomes populated by carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) including large numbers of myofibroblasts. These cells have previously been extracted from many different types of human carcinomas for their in vitro culture. A subpopulation of CAFs is distinguishable through their up-regulation of &alpha;-smooth muscle actin (&alpha;-SMA) expression4,5. These cells are a hallmark of 'activated fibroblasts' that share similar properties with myofibroblasts commonly observed in injured and fibrotic tissues 6. The presence of this myofibroblastic CAF subset is highly related to high-grade malignancies and associated with poor prognoses in patients.
Many laboratories, including our own, have shown that CAFs, when injected with carcinoma cells into immunodeficient mice, are capable of substantially promoting tumourigenesis 7-10. CAFs prepared from carcinoma patients, however, frequently undergo senescence during propagation in culture limiting the extensiveness of their use throughout ongoing experimentation. To overcome this difficulty, we developed a novel technique to experimentally generate immortalised human mammary CAF cell lines (exp-CAFs) from human mammary fibroblasts, using a coimplantation breast tumour xenograft model.
In order to generate exp-CAFs, parental human mammary fibroblasts, obtained from the reduction mammoplasty tissue, were first immortalised with hTERT, the catalytic subunit of the telomerase holoenzyme, and engineered to express GFP and a puromycin resistance gene. These cells were coimplanted with MCF-7 human breast carcinoma cells expressing an activated ras oncogene (MCF-7-ras cells) into a mouse xenograft. After a period of incubation in vivo, the initially injected human mammary fibroblasts were extracted from the tumour xenografts on the basis of their puromycin resistance 11.
We observed that the resident human mammary fibroblasts have differentiated, adopting a myofibroblastic phenotype and acquired tumour-promoting properties during the course of tumour progression. Importantly, these cells, defined as exp-CAFs, closely mimic the tumour-promoting myofibroblastic phenotype of CAFs isolated from breast carcinomas dissected from patients. Our tumour xenograft-derived exp-CAFs therefore provide an effective model to study the biology of CAFs in human breast carcinomas. The described protocol may also be extended for generating and characterising various CAF populations derived from other types of human carcinomas.

Experimental Generation of Carcinoma-Associated Fibroblasts CAFs from Human Mammary Fibroblasts

Carcinoma-associated fibroblasts (CAFs) rich in myofibroblasts present within the tumour stroma, play a major role in driving tumour progression. We developed a coimplantation tumour xengraft model for experimentally generating CAFs from human mammary fibroblasts. The protocol describes how to establish CAF myofibroblasts that acquire an ability to promote tumourigenesis.

Génération expérimentale de carcinome Associated fibroblastes (CAF) à partir des fibroblastes mammaires

Carcinomas are complex tissues comprised of neoplastic cells and a non-cancerous compartment referred to as the 'stroma'. The stroma consists of ...

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and finding new sources for implantable cells are the focus of recent research4,5. Investigating the effectiveness of cell therapies is not an easy task and new tools are needed to investigate the mechanisms involved in the treatment process6. We designed an experimental protocol of ischemia/reperfusion in order to allow the observation of cellular connections and even subcellular mechanisms during ischemia/reperfusion injury and after stem cell transplantation and to evaluate the efficacy of cell therapy. H9c2 cardiomyoblast cells were placed onto cell culture plates7,8. Ischemia was simulated with 150 minutes in a glucose free medium with oxygen level below 0.5%. Then, normal media and oxygen levels were reintroduced to simulate reperfusion. After oxygen glucose deprivation, the damaged cells were treated with transplantation of labeled human bone marrow derived mesenchymal stem cells by adding them to the culture. Mesenchymal stem cells are preferred in clinical trials because they are easily accessible with minimal invasive surgery, easily expandable and autologous. After 24 hours of co-cultivation, cells were stained with calcein and ethidium-homodimer to differentiate between live and dead cells. This setup allowed us to investigate the intercellular connections using confocal fluorescent microscopy and to quantify the survival rate of postischemic cells by flow cytometry. Confocal microscopy showed the interactions of the two cell populations such as cell fusion and formation of intercellular nanotubes. Flow cytometry analysis revealed 3 clusters of damaged cells which can be plotted on a graph and analyzed statistically. These populations can be investigated separately and conclusions can be drawn on these data on the effectiveness of the simulated therapeutical approach.

Stem Cell Transplantation in an in vitro Simulated Ischemia/Reperfusion Model

We demonstrate how to set up an in vitro ischemia/reperfusion model and how to evaluate the effect of stem cell therapy on postischemic cardiac cells.

Transplantation de cellules souches dans un In vitro Simulation d&#39;ischémie / reperfusion modèle

Stem cell transplantation protocols are finding their way into clinical practice1,2,3. Getting better results, making the protocols more robust, and ...

Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

L&#39;isolement et la caractérisation fonctionnelle de Human ventriculaire cardiomyocytes à partir des échantillons chirurgicaux frais

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal hyperplasia (IH) that eventually leads to vessel occlusion and graft failure. Mechanical forces, particularly low shear stress and high wall tension, are thought to initiate and to sustain these cellular and molecular changes, but their exact contribution remains to be unraveled. To selectively evaluate the role of pressure and shear stress on the biology of IH, an ex&#160;vivo perfusion system (EVPS) was created to perfuse segments of human saphenous veins under arterial regimen (high shear stress and high pressure). Further technical innovations allowed the simultaneous perfusion of two segments from the same vein, one reinforced with an external mesh. Veins were harvested using a no-touch technique and immediately transferred to the laboratory for assembly in the EVPS. One segment of the freshly isolated vein was not perfused (control, day 0). The two others segments were perfused for up to 7 days, one being completely sheltered with a 4 mm (diameter) external mesh. The pressure, flow velocity, and pulse rate were continuously monitored and adjusted to mimic the hemodynamic conditions prevailing in the femoral artery. Upon completion of the perfusion, veins were dismounted and used for histological and molecular analysis. Under ex&#160;vivo conditions, high pressure perfusion (arterial, mean = 100 mm Hg) is sufficient to generate IH and remodeling of human veins. These alterations are reduced in the presence of an external polyester mesh.

Procedure for Human Saphenous Veins Ex Vivo Perfusion and External Reinforcement

The mechanisms leading to the development of intimal hyperplasia (IH) and vein graft failure are still poorly understood. This study describes an ex&#160;vivo system to perfuse human veins under controlled flow and pressure. Furthermore the efficiency of external mesh reinforcement to limit the development of IH was evaluated.

Procédure pour saphènes humaines veines<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Perfusion et renforcement externe

The mainstay of contemporary therapies for extensive occlusive arterial disease is venous bypass graft. However, its durability is threatened by intimal ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial cells tend to lose hormone receptor expression. Widely used hormone receptor positive breast cancer cell lines are of limited relevance to the in vivo situation. Here, we describe an ex vivo model to study hormone action in the human breast. Fresh human breast tissue specimens from surgical discard material such as reduction mammoplasties or mammectomies are mechanically and enzymatically digested to obtain tissue fragments containing ducts and lobules and multiple stromal cell types. These tissue microstructures kept in basal medium without growth factors preserve their intercellular contacts, the tissue architecture, and remain hormone responsive for several days. They are readily processed for RNA and protein extraction, histological analysis or stored in freezing medium. Fluorescence activated cell sorting (FACS) can be used to enrich for specific cell populations. This protocol provides a straightforward, standard approach for translational studies with highly complex, varied human specimens.

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

We have developed a novel ex vivo model to study hormone action in the human breast. It is based on tissue microstructures isolated from surgical breast tissue specimens which preserve tissue architecture, intercellular interactions, and paracrine signaling.

Une<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modèle pour étudier action hormone dans le sein humain

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Tissue Characterization after a New Disaggregation Method for Skin Micro-Grafts Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one step treatments for acute and chronic skin lesions. Moreover, the management of chronic but also acute wounds resulting from trauma, diabetes, infections and other causes, remains challenging. In this study we describe a new method to create autologous micro-grafts from cutaneous tissue of a single patient and their clinical application. Moreover, in vitro biological characterization of cutaneous tissue derived from skin, de-epidermized dermis (Ded) and dermis of multi-organ and/or multi-tissue donors was also performed. All tissues were disaggregated by this new protocol, allowing us to obtain viable micro-grafts. In particular, we reported that this innovative protocol is able to create bio-complexes composed by autologous micro-grafts and collagen sponges ready to be applied on skin lesions. The clinical application of autologous bio-complexes on a leg lesion was also reported, showing an improvement of both re-epitalization process and softness of the lesion. Additionally, our in vitro model showed that cell viability after mechanical disaggregation with this system is maintained over time for up to seven (7) days of culture. We also observed, by flow cytometry analysis, that the pool of cells obtained from disaggregation is composed of several cell types, including mesenchymal stem cells, that exert a key role in the processes of tissue regeneration and repair, for their high regenerative potential. Finally, we demonstrated in vitro that this procedure maintains the sterility of micro-grafts when cultured in Agar dishes. In summary, we conclude that this new regenerative approach can be a promising tool for clinicians to obtain in one step viable, sterile and ready to use micro-grafts that can be applied alone or in combination with most common biological scaffolds.

The protocol describes a new method to disaggregate human tissues and to create autologous micro-grafts that, combined with collagen sponges, give rise to human bio-complexes ready to use in the treatment of skin lesions. Further, this system preserves cell viability of micro-grafts at different times after mechanical disaggregation.

Caractérisation des tissus après une nouvelle méthode de désagrégation pour la peau Micro-Greffes Generation

Several new methods have been developed in the field of biotechnology to obtain autologous cellular suspensions during surgery, in order to provide one ...

Three-dimensional Alginate-bead Culture of Human Pituitary Adenoma Cells

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from brown sea algae. Briefly, the tumor tissue is cut into small pieces and submitted to an enzymatic digestion with collagenase and trypsin. Next, a cell suspension is obtained. The tumor cell suspension is mixed with 1.2% sodium alginate and dropped into a CaCl2 solution, and the alginate/cell suspension is gelled on contact with the CaCl2 to form spherical beads. The cells embedded in the alginate beads are supplied with nutrients provided by the culture media enriched with 20% FBS. Three-dimensional culture in alginate beads maintains the viability of adenoma cells for long periods of time, up to four months. Moreover, the cells can be liberated from the alginate by washing the beads with sodium citrate and seeded on glass coverslips for further immunocytochemical analyses. The use of a cell culture model allows for the fixation and visualization of the actin cytoskeleton with minimal disorganization. In summary, alginate beads provide a reliable culture system for the maintenance of pituitary adenoma cells.

Three-dimensional culture in alginate beads, due to its simplicity and reproducibility, was chosen to maintain the pituitary adenoma cells. The procedures included an initial enzymatic digestion and mechanical dissociation of the tumor tissue, and the subsequent cell suspension was encapsulated in alginate beads.

Tridimensionnelle Alginate-perle culture de cellules humaines adénome hypophysaire

A three-dimensional culture method is described in which primary pituitary adenoma cells are grown in alginate beads. Alginate is a polymer derived from ...

Ultrasonography in Experimental Reproductive Investigations on Rats

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in reproductive medicine. In the past, the study of reproductive system development in rodents has been based on one-time histological examination of excised tissues. Recently, with the development of high-resolution transabdominal ultrasound, high-quality sonography can now be performed to evaluate the reproductive organs of rats, allowing a new method for studying the reproductive system. Images were obtained using a high-resolution ultrasonographic system. Gynecological ultrasonography was performed on 28 eight-week-old non-pregnant rats and 5 pregnant Sprague-Dawley rats. We describe how to recognize organs of the reproductive system and associated structures in typical views during different phases of the estrus cycle. Color flow Doppler was used to measure uterine artery blood flow and evaluate uterine blood flow pattern changes during different stages of pregnancy. We have demonstrated that ultrasound exploration is a useful method for evaluating changes in internal reproductive organs. Its use raises the possibility of conducting additional experiments, including medical or surgical procedures, and provides the ability to monitor sonographic changes to internal organs without sacrificing animals.

This manuscript describes the utility of ultrasound performed on female rats to design experimental models for reproductive and gynecological investigation. A step-by-step explanation of how to perform ultrasonographic evaluation is shown.

Échographie dans des enquêtes de reproduction expérimentales chez le rat

With the development of assisted reproductive technology and the ethical limitations of research on humans, rat animal models have been widely used in ...

Advanced Imaging of Lung Homing Human Lymphocytes in an Experimental In Vivo Model of Allergic Inflammation Based on Light-sheet Microscopy

Overwhelming tissue accumulation of highly activated immune cells represents a hallmark of various chronic inflammatory diseases and emerged as an attractive therapeutic target in the clinical management of affected patients. In order to further optimize strategies aiming at therapeutic regulation of pathologically imbalanced tissue infiltration of pro-inflammatory immune cells, it will be of particular importance to achieve improved insights into disease- and organ-specific homing properties of peripheral lymphocytes. The here described experimental protocol allows to monitor lung accumulation of fluorescently labeled and adoptively transferred human lymphocytes in the context of papain-induced pulmonary inflammation. In contrast to standard in vitro assays frequently used for the analysis of immune cell migration and chemotaxis, the now introduced in vivo setting takes into account lung-specific aspects of tissue organization and the influence of the complex inflammatory scenario taking place in the living murine organism. Moreover, three-dimensional cross-sectional light-sheet fluorescence microscopic imaging does not only provide quantitative data on infiltrating immune cells, but also depicts the pattern of immune cell localization within the inflamed lung. Overall, we are able to introduce an innovative technique of high value for immunological research in the field of chronic inflammatory lung diseases, which can be easily applied by following the provided step-by-step protocol.

The here introduced protocol allows characterization of the lung homing capacity of primary human lymphocytes under in vivo inflammatory conditions. Pulmonary infiltration of adoptively transferred human immune cells in a mouse model of allergic inflammation can be imaged and quantified by light-sheet fluorescence microscopy of chemically cleared lung tissue.

Avancée d’imagerie du poumon Homing des Lymphocytes humains dans un modèle In Vivo de l’Inflammation allergique, issue des feuilles lumière microscopie expérimentale