Ce protocole est une alternative facile et peu coûteuse à l’utilisation du bromure d’éthidium pour la détection de l’ADN pendant l’électrophorèse. En enlevant le bromure d’éthidium, la lumière UV ou la lumière bleue peuvent être utilisées pour la détection. La lumière bleue n’est pas dommageable pour l’ADN, ce qui améliore les chances de succès pour les expériences en aval.
C’est vraiment facile d’essayer cela. Vous n’avez qu’à remplacer le bromure d’éthidium dans vos gels par de l’orange thiazole. Pour commencer, préparez 1% de mini-gels en mélangeant environ 0,7 gramme d’agarose dans 70 millilitres de tampons tris-acétate-EDTA ou tris-borate.
Ensuite, dissoudre l’orange thiazole dans DMSO pour faire une solution de stock de 10 000 X. Bien qu’il ne soit pas particulièrement sensible à la lumière, conservez le thiazole orange dans l’obscurité lorsqu’il n’est pas utilisé. Pour un stockage à long terme, faire des aliquots du mélange thiazole orange-DMSO et les congeler.
Ensuite, ajouter l’orange thiazole à une concentration finale de 1,3 microgramme par millilitre, et micro-ondes le mélange de tampon d’agarose et d’orange thiazole pour dissoudre l’agarose pendant environ 60 secondes. Verser le mélange d’agarose dans un appareil de coulée de gel contenant un peigne approprié, et permettre à la solution agarose de se solidifier en gel. Pour charger le gel, placez d’abord le gel dans l’appareil électrophoresis, s’il n’est pas déjà présent.
Ajoutez ensuite tae ou TBE tampon en cours d’exécution pour couvrir la surface du gel. Ensuite, à l’aide d’un colorant de chargement, chargez 10 microlitres d’un échantillon d’ADN. Inclure une échelle de dimensionnement de l’ADN pour référence.
Fixez le couvercle et les électrodes, et exécutez le mini-gel à 100 volts jusqu’à ce que le colorant de chargement se déplace environ quatre à sept centimètres pour un mini-gel. Si l’orange thiazole n’a pas été appliquée avant la coulée de gel, tacher le gel en l’immergeant dans le tampon contenant de l’orange thiazole avec une agitation douce pendant environ 20 minutes ou jusqu’à ce que les bandes soient complètement détectées. Pour visualiser le gel à l’aide d’un transilluminateur UV, retirez le gel de l’appareil électrophoresis et placez-le sur le transilluminateur UV.
Pour visualiser le gel à l’aide d’un transilluminateur de lumière bleue ou d’une lampe de poche, placez le gel sur le transilluminateur de lumière bleue ou dirigez la lampe de poche LED bleue sur le gel d’en haut ou d’en bas. Utilisez un filtre d’émission d’ambre pour filtrer la lumière bleue, permettant la visualisation de la fluorescence des complexes orange thiazole d’ADN et pour protéger les colorants. Pour faciliter la digestion ou la ligature, découpez les bandes d’ADN désirées du gel et procédez à l’extraction de l’ADN à l’aide d’un kit ou d’un protocole facilement disponible.
Sélectionnez les paramètres d’excitation et d’émission appropriés dans l’appareil d’imagerie par gel. En l’absence d’un système d’imagerie avec des filtres appropriés, placez un filtre ambrée entre la caméra et la source d’excitation gel blue-light. Les limites de détection sont similaires entre le bromure d’éthidium, l’orange thiazole et un colorant commercial commun à adn détectable par la lumière bleue, la limite de détection pour les trois colorants étant d’un à deux nanogrammes par voie dans un mini-gel.
Le gel d’agarose taché d’orange thiazole d’un digest de restriction est détectable quand il est excité avec un UV ou un transilluminateur de lumière bleue ou avec une lampe de poche bleue de lumière. Bien que l’orange thiazole semble être moins dangereuse que le bromure d’éthidium, l’équipement de protection individuelle standard comme les gants et les lunettes doit encore être porté.
