Ce capteur de tension intégrative à base d’ADN, ou ITS, convertissant le signal de force en fluorescence permet localement l’imagerie directe de la force cellulaire par microscopie de fluorescence. ITS a une haute résolution spatiale et une sensibilité élevée. Le seuil d’activation est tunable, permettant l’image sélective de la tension d’intégrine à différents niveaux.
Après avoir reçu l’ADN mono-échoué personnalisé, ou SSDNA, d’intérêt, pour conjuguer le peptide RGD au quencher thiolated de ssDNA, ajoutez d’abord 100 microlitres de 0.5-molaire EDTA dans 400 microlitres d’eau à environ 450 microlitres de solution fraîchement préparée de TCEP. Ensuite, ajoutez 10 microlitres de la solution TCEP-EDTA à 20 microlitres d’ADN de thiol d’un millimlaire quencher dans PBS pour une incubation de 30 minutes à température ambiante. Pour conjuguer l’amine RGD avec du sulfo-SMCC, ajoutez 40 microlitres de sulfo-SMCC de 23 millimlaires fraîchement préparés à 100 microlitres de solution d’amine RGD fraîchement préparée de 11 millimolaires pour une incubation de 20 minutes à température ambiante.
Pour conjuguer rgd amine SMCC avec le quencher thiolated ssDNA, mélanger l’ensemble du volume de la solution thiolated ssDNA quencher avec l’ensemble du volume de la solution SMCC RGD amine pour une incubation d’une heure à température ambiante. À la fin de l’incubation, transférer la solution à un stockage de quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain matin, mélanger le chlorure de sodium trois molaire avec la solution d’ADN conjuguée au thiol et moins 20 degrés Celsius, réfrigéré, 100% éthanol à un rapport de 1 à 10 à 25, et placer la réaction à moins 20 degrés Celsius pendant environ 30 minutes.
Lorsque l’ADN s’est précipité, recueillir l’ADN par centrifugation et réutiliser la pastille dans PBS pour mesurer la concentration d’ADN sur un spectromètre. Pour le capteur de tension intégrative, ou ITS, synthèse, mélanger les solutions d’ADN du brin supérieur et inférieur à un rapport de 1,1 à un molaire, et incuber la réaction pendant la nuit à quatre degrés Celsius avant de placer aliquots du mélange à moins 20 degrés Celsius pour le stockage à long terme. Pour l’immobilisation its, enrober une boîte petri de 29 millimètres de diamètre à fond de verre de 200 microlitres de 0,1 milligramme par millilitre d’albumine de sérum bovin biotinylé, ou BSA-biotine, pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius.
Lorsque le BSA-biotine a physiquement adsorbé sur la surface de verre, laver le plat trois fois avec 200 microlitres de PBS frais par lavage, suivie de l’incubation avec 200 microlitres de 50 microgrammes par millilitre de protéines avides pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver le plat trois fois avec le PBS comme démontré, et ajouter 200 microlitres de 0,1 micromolaire ITS pour une autre incubation de 30 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, laver le plat trois fois avec du PBS, en laissant le dernier lavage dans le plat jusqu’au placage cellulaire.
Pour initier une culture de kératocyte de poisson, utilisez une pince à épiler à bout plat pour arracher un morceau d’écaille d’un poisson, et appuyez doucement sur la balance sur le puits d’une boîte petri à fond de verre non modifié, le côté intérieur de l’échelle contactant le verre. Attendez environ 30 secondes que l’écaille de poisson adhère à la surface vitrée du plat avant de couvrir l’écaille d’un millimètre de dulbecco modifié d’Iscove. Ensuite, incuber l’écaille dans une boîte sombre et humide pendant six à 48 heures à température ambiante.
Pour plaquer les kératocytes sur la surface ITS, remplacez le milieu du plat de culture des kératocytes par une solution de détachement cellulaire 1X pour une incubation de trois minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, remplacer la solution de détachement par un milieu complet frais et dissocier les cellules par un tuyautage doux. Ensuite, ajustez les cellules à la concentration appropriée pour le placage et ensemencez-les sur le plat enduit its pendant 30 minutes à température ambiante avant l’imagerie.
Pour l’imagerie par tension d’intégrine en temps quasi réel dans les cellules vivantes, transférez les cellules au stade d’un microscope à fluorescence et sélectionnez l’objectif 40 ou 100 fois. Dans le logiciel d’imagerie, réglez le temps d’exposition à une seconde et l’intervalle d’image de 20 secondes pour obtenir une vidéo des images ITS. Ensuite, utilisez un logiciel d’analyse d’image approprié pour soustraire un cadre précédent de la vidéo ITS à partir d’un cadre actuel pour calculer le signal ITS nouvellement produit dans le dernier intervalle d’image.
Le signal ITS nouvellement produit représente la tension intégrine générée dans le dernier intervalle d’image, signalant ainsi la force cellulaire de manière quasi-en temps réel. Ici, la cartographie de tension d’intégrine démontre l’induction de la tension d’intégrine à deux voies de force pendant la migration de keratocyte. La résolution de la carte des forces pourrait alors être calibrée pour être de 0,4 micromètre.
La tension élevée d’intégrine se concentre à la marge arrière dans les kératines motiles de poissons. Dans les cellules nonmotiles, un modèle spécifique de tension d’intégrine qui est tout à fait différent de celui observé dans le kératocyte migrant rapide est formé. Les adhérences focales et la tension intégrine des kératines de poissons peuvent être co-imaged pour évaluer la relation entre la tension d’intégrine et la structure cellulaire dans les cellules d’intérêt.
Avec l’ITS, la force d’adhérence cellulaire devient visible avec une résolution et une sensibilité comparables à l’imagerie structurale cellulaire. Cette technique ouvre la voie à l’étude d’une interaction force-structure dans les cellules.
