L’angiogenèse joue un rôle important dans la métastase et la progression tumorales. Dans ce protocole, nous utiliserons la méthode d’imagerie de bioluminescence double pour surveiller la progression dynamique de tumeur et l’angiogenèse dans un modèle de souris du cancer du sein. Dans ce modèle, nous pouvons suivre la croissance de tumeur et l’angiogenèse simultanément dans la souris simple par luciferase de Firefly et imagerie de luciferase de Renilla, respectivement.
Ce modèle peut être largement appliqué dans le dépistage des médicaments antitumorals et la recherche en oncologie. Ce modèle de double bioluminescence peut être utilisé pour suivre la progression tumorale et la régression et pour détecter les processus moléculaires liés aux tumeurs en réponse aux stratégies thérapeutiques. L’angiogenèse est un processus crucial de progression tumorale.
Par conséquent, la surveillance de la progression tumorale et de l’angiogenèse d’une manière visuelle et sensible est nécessaire pour développer des traitements tumoraux efficaces. Les procédures seront démontrées par Kaiyue Zhang, Chen Wang et Shang Chen, étudiants de notre laboratoire. Pour l’emballage du lentivirus et les semences de production une fois 10 à la sixième des 293T cellules en deux millilitres de DMEM complétées par 10% de sérum bovin fœtal par puits dans une plaque de six puits pour la culture de nuit dans un incubateur humidifié à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le lendemain matin, mélangez 7,5 microlitres de liposome avec 250 microlitres de minimal essential medium dans deux tubes séparés de 1,5 millilitre pour une incubation de cinq minutes à température ambiante. Pour préparer les solutions d’ADN, ajoutez le vecteur RR du lentivirus plasmide et les plasmides d’aide à 250 microlitres de minimal essential medium dans des tubes individuels de 1,5 millilitre comme indiqué dans le tableau. À la fin de l’incubation, ajouter délicatement les solutions RR d’ADN aux suspensions liposome d’une manière goutte-sage et permettre à l’ADN de se lier aux membranes lipidiques pendant 20 minutes à température ambiante.
Pendant que le mélange est en incubation, remplacez le supernatant de la culture cellulaire 293T par un millilitre de milieu de culture frais, et ajoutez doucement 0,5 millilitres du mélange d’ADN liposome approprié à chaque puits. Retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant 12 à 16 heures avant de remplacer le supernatant dans chaque puits par un millilitre de milieu de culture frais complété par des antibiotiques. Après 36 heures supplémentaires d’incubation, mettre les supernatants en un tube conique par souche de lentivirus pour sédimenter les cellules 293T par centrifugation.
Transférez ensuite les supernatants contenant du RR de lentivirus dans des tubes de stockage stériles de polypropylène de 1,5 millilitre pour le stockage à moins 80 degrés Celsius. Pour la transduction lentiviral pour l’expression de gène dans les cellules mammaires de tumeur 4T1, remplacez le supernatant dans chaque puits d’une plaque de culture cellulaire de 4T1 de six puits avec un millilitre de milieu frais de culture cellulaire RPMI-basé complété avec le sérum bovin foetal et un millilitre du stock lentiviral. Ajouter ensuite huit microgrammes par millilitre de polybrene à chaque puits, et pipette doucement à quelques reprises pour mélanger.
Centrifuger la plaque pour aider à augmenter l’efficacité de transduction, et retourner les cellules à l’incubateur de culture cellulaire pendant quatre à 12 heures. À la fin de l’incubation, remplacer le supernatant dans chaque puits par un milieu de culture frais complété par du sérum et des antibiotiques pour éliminer les particules lentivirales et le polybrene. Pour sélectionner les cellules induites par le lentivirus, passer les cultures cellulaires 4T1 transduced à un rapport un à trois à un à un à quatre avec le milieu de sélection, en changeant le milieu tous les deux à trois jours.
Après sept jours de sélection de culture moyenne, visualisez les cultures cellulaires transduced sous un microscope inversé de contraste de phase de fluorescence et comptez le nombre de cellules protéiques fluorescentes rouges positives ou RFP-4T1 et toutes les cellules 4T1 dans trois champs de vision pour estimer le rapport RFP-positif. Pour mettre en place un modèle de souris porteuse de tumeurs, lavez les cultures cellulaires transduced à 80 % confluentes avec PBS avant de détacher les cellules de deux millilitres de trypsine-EDTA par plaque de culture de 60 millimètres. Lorsque les cellules se sont levées du fond de la plaque arrêter la réaction avec cinq à 10 millilitres de sérum complété milieu par plaque.
Et transférer les cultures dans des tubes de centrifugeuse individuels de 15 millilitres pour le comptage. Diluer les cellules à une fois 10 à la sixième cellule pour 100 microlitres de milieu de culture sans concentration sérique. Et injecter sous-cutanément 100 microlitres de la lignée cellulaire 4T1-RR dans l’épaule gauche d’une souris modèle tumorale anesthésiée, et 100 microlitres de la lignée cellulaire 4T1-RRT dans l’épaule droite de la même souris.
Après les injections, placez chaque souris dans une zone de récupération appropriée avec un support thermique jusqu’à ce qu’elle soit complètement récupérée. Palpez les masses tumorales tous les jours pendant sept jours pour confirmer que les souris portent une tumeur. Au septième jour post-implantation, injecter intraperitoneally 50 microgrammes par kilogramme de Ganciclovir dans chaque souris tumeur-roulement deux fois par jour jusqu’à la fin de l’expérience.
Pour la croissance tumorale, ouvrez le système d’imagerie vivante. Initialisez le logiciel Living Imaging et initialisez le système. Pendant que le système est en train d’initialiser, utilisez une seringue à insuline pour injecter chaque souris pour être photographiée avec le volume approprié de coelenterazine dans la rétrobulbar.
Placez les souris injectées dans la chambre de la caméra et obtenez immédiatement plusieurs photos de la souris dorsalement pour acquérir les signaux renilla luciferase des cellules 4T1 jusqu’à ce que les signaux bioluminescents disparaissent. 10 minutes après l’imagerie renilla luciferase, utilisez une seringue à insuline pour injecter intraperitoneally le volume approprié de D-luciferin dans chaque animal. 10 minutes après l’injection de D-luciferin, placez les souris dans la chambre de la caméra et obtenez plusieurs images de la dorsale de la souris pour acquérir les signaux luciferase Firefly de l’angiogenèse.
Après la transduction de lentivirus, plus de 99% des cellules sont RFP-positives sans différences dans la morphologie de culture cellulaire observée entre les deux lignées cellulaires transduced. Par la suite, l’imagerie par bioluminescence des cellules transduced révèle que les deux lignées cellulaires émettent de forts signaux bioluminescents d’une force similaire. Après injection sous-cutanée des lignées cellulaires transduites dans un modèle transgénique de souris porteuses de tumeurs, la croissance tumorale induite par l’angiogenèse peut être évaluée par des signaux luciferase Firefly en présence de D-luciferin chez le même animal.
À sept jours après implantation, l’administration de Ganciclovir induit la mort dans les cellules 4T1-RRT ayant pour résultat une réduction dramatique du signal de luciferase de Renilla dans les tumeurs établies par ces cellules. Les signaux luciferase firefly augmentent également en conjonction avec une augmentation de l’expression et de la diminution de Renilla luciferase après le déclin de luciferase. Pris ensemble, ces résultats suggèrent qu’il y ait une corrélation directe entre l’angiogenèse de tumeur et la croissance de tumeur.
En effet, la mort de cellule de tumeur ganciclovir-induite peut mener à une inhibition de l’angiogenèse de tumeur. En outre, l’immunostaining pour le récepteur de facteur de croissance endothélial anti-vasculaire II, comme marqueur de l’angiogenèse, indique une structure microvasculaire plus significativement établie dans les sections de tissu de tumeur de 4T1-RR que dans les sections des tumeurs de 4T1-RRT, compatibles au déclin du signal luciferase de Firefly observé après administration de Ganciclovir. L’étape la plus critique du protocole est l’utilisation de deux types de luciferase, tels que FLuc et RLuc pour le suivi simultané des cellules et de l’angiogenèse.
Cette technologie pourrait être utilisée pour traiter les cellules cancéreuses à différents endroits, et elle peut être largement utilisée dans les modèles de cancer du virus. Ce modèle de souris permettant la croissance tumorale et les effets anti-tumoraux du système de suivi HSV-ttk/GCV à visualiser dynamiquement chez un animal vivant. Une installation de niveau II de biosécurité est nécessaire pour prévenir une transfection par lentivirus, car le média contient des particules de lentivirus qui pourraient être nocives pour l’homme.
