Le protocole permet l’estimation mutationnelle chez les microbes. Il peut démontrer comment un contexte environnemental des organismes inséque la probabilité d’une mutation spontanée. Le principal avantage de ce protocole est qu’il est bon marché et efficace.
De nombreuses estimations du taux de mutation peuvent être faites en parallèle. Mutations que ce protocole mesure pourrait suivre la résistance aux antibiotiques. Ce protocole peut donc être utilisé pour étudier l’un des plus grands défis au monde, la résistance aux antimicrobiens.
Cette méthode peut fournir un aperçu de la façon dont le contexte écologique des cellules peut effectuer l’évolution de la résistance aux antimicrobiens. Ce protocole estime les taux de mutation dans la monoculture de la souche de laboratoire, mais nous l’avons appliquée à des souches cliniques et à la co-culture de deux souches pour distinguer la molécule bionéutrale. Les réactions les plus dangereuses utilisées dans ce protocole sont la rifampicine antibiotique et le méthanol.
Assurez-vous donc d’utiliser des gants de protection et des lunettes lorsque la rifampicine est dissoute au méthanol. Pour commencer cette procédure inoculer trois mL de bouillon de lysogeny liquide avec une éraflure de glace du stock de glycérol E.coli K12. Secouez la culture LB à 120 rpm et à 37 degrés Celsius pendant environ sept heures.
Après cela, diluer la culture 2000 fois avec la solution saline. Ajouter 10 mL de liquide Davis milieu minimal à chaque tube avec chacun contenant une concentration différente de glucose comme indiqué ici. Ajouter 100 microlitres de la culture diluée à trois tubes de polymère conique à fond conique de 50 mL.
Préparer 22 mL de cinq solutions différentes de liquide Davis milieu minimal avec du glucose, chacun dans son propre tube de 50 mL comme contour dans le protocole de texte. Pour préparer l’inocula aux environnements, mesurez d’abord la densité optique des cultures nocturnes à 600 nanomètres. Diluer les cultures avec une solution saline et ajouter entre 2200 et 110000 cellules à chaque environnement.
Cela permettra de s’assurer que l’inoculum pour un mL de l’environnement contient entre 1000 et 5000 cellules. Ensuite, créez une disposition aléatoire des cultures parallèles pour 196 plaques de puits profondes. Transférer un mL du média inoculé dans chaque puits de la plaque selon la disposition.
Ensuite, fixez le couvercle de la plaque avec du ruban adhésif et pesez toute la plaque avec le couvercle et le ruban adhésif. Secouez la plaque à 250 rpm et à 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après cela, placez deux L d’eau distillée dans l’incubateur pour stabiliser la quantité d’évaporation parmi les ensembles expérimentaux.
Déterminez la taille de l’inoculum en placage de 10 microlitres de chacun des supports inoculés sur une plaque d’agar TA non sélective. Utilisez un épandeur stérile en forme de L jusqu’à ce que la surface de l’agar soit sèche. Ensuite, préparez une agar TA sélective contenant de la rifampicine dans six assiettes de puits.
Pipette cinq mL de l’agar ta sélective dans chaque puits des six plaques de puits. Comptez les unités formant la colonie sur les plaques d’agar non sélectives et déterminez la taille de l’inocula. Après 24 heures d’incubation, peser toute la plaque de puits profond pour déterminer la quantité d’évaporation, qui est probablement d’environ 10%Transférer trois cultures choisies au hasard par essai dans des tubes de microcentrifugeuse étiquetés.
Plaquez les 81 cultures parallèles restantes de la plaque de puits profond sur l’agar sélectif TA contenant de la rifampicine. Ensuite, retirez les couvercles des plaques sélectives d’agar et laissez-les à découvert dans des conditions stériles pour assécher tout le liquide à la surface de l’agar. Déterminer le nombre d’unités formant des colonies en diluant les cultures des tubes de microcentrifugeuse à l’aide de cinq étapes de dilution 10 fois en mélangeant et en vortexant 900 microlitres de solution saline avec 100 microlitres de la culture par étape de dilution.
Plaquez 40 microlitres de la dilution finale sur l’agar TA non sélectif et placez le couvercle sur les plaques. Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius. Une fois que tous les puits d’une plaque de six puits sont exempts du liquide de culture, remettre le couvercle en place.
Puis incuber les plaques avec le couvercle à 37 degrés Celsius pendant 44-48 heures. Le quatrième jour, comptez les unités formant la colonie sur les plaques d’agar non sélectives. Le cinquième jour, comptez le nombre de colonies résistantes à l’antibiotique sur les plaques sélectives d’agar TA.
Enregistrez la distribution entre les cultures parallèles du nombre observé de mutants pour un essai particulier. Ouvrez le logiciel approprié sur l’ordinateur. Dans l’onglet test d’hypothèse, laissez les valeurs à leur valeur par défaut.
Cliquez sur parcourir et sélectionnez le fichier texte avec la distribution des mutants observés. Après avoir téléchargé le fichier, cliquez sur test effectué. Sur le côté droit, sous le résultat du test, dans le cadre du test ONE Sample ML, trouver le numéro de mutation.
C’est m, le nombre prévu d’événements mutationnels. Ensuite, estimer le taux de mutation d’un génotype particulier dans un environnement particulier comme le décrit le protocole texte. Les taux de mutation MG1655 de trois marqueurs phénotypiques différents, la cyclosérine, la rifampicine et l’acide nalidixique sont indiqués ici.
Les taux de mutation sont évalués dans le milieu minimal de Davis avec la concentration de glucose de 80 mg/L, 125 mg/L, et 250 mg/L. Dans un cas, une concentration de glucose de 1000 mg/L est utilisée. Comme prévu, les taux de mutation sont plus élevés pour la résistance à la cyclosérine, les plus faibles pour la résistance à l’acide nalidixique, et le taux de résistance à la rifampicine est au milieu.
L’analyse des fluctuations montre clairement quelle souche est un mutator constitutif et qui a des taux de mutation normaux. Comme la souche de suppression mutT avait un taux de mutation à la résistance à l’acide nalidixique qui est d’environ 50 fois plus élevé que la souche mg1655 de contrôle. Tout en préformant ce protocole, assurez-vous que vos cellules se développent bien.
Ils devraient être de plus en plus à la densité uniforme à travers les cultures parallèles avec le même environnement. Un suivi de cette procédure est de déterminer la séquence d’ADN du gène rpoB dans les colonies résistantes. Déterminer comment le spectre des mutations de la résistance à la rifampicine varie selon le génotype microbien environnemental.
Les analyses de fluctuation du XXe siècle ont démontré comment la mutation est spontanée et aléatoire par rapport à l’environnement. Maintenant, ils jetant un nouvel éclairage sur la façon dont les taux de mutation ne varient avec l’environnement génétiquement, écologiquement, même socialement.
